黏質(zhì)沙雷氏菌次生代謝產(chǎn)物殺滅松材線蟲效果

胡宗浩　方文婉　周曉彤　何偉

摘要：為尋找研制新型綠色殺線蟲生物制劑，首次報道利用靈菌紅素（prodigiosin，簡稱PGN）對混合蟲齡松材線蟲的生物活性，靈菌紅素是一種廣泛分布于環(huán)境中的黏質(zhì)沙雷氏菌的次生代謝產(chǎn)物，試驗測定不同濃度下靈菌紅素的殺蟲活性及對松材線蟲卵孵化率的影響。離體殺蟲試驗結(jié)果表明，靈菌紅素對松材線蟲各蟲齡段都有較高的生物活性，32 h 時的LC90為（90.24±1.41）mg/L，陽性對照組硫酸銅的LC90為（60.60±1.48）mg/L；在離體蟲卵孵化率測定試驗中，靈菌紅素在較低濃度時就已經(jīng)表現(xiàn)出較高的生物活性，濃度為9.5 mg/L時，卵的孵化率僅為45.5%，與此同時，對照組的孵化率為97.6%。靈菌紅素以其殺蟲效率高、環(huán)境污染小、來源廣泛等優(yōu)勢，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中有極好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：黏質(zhì)沙雷氏菌；次生代謝；靈菌紅素；松材線蟲；孵化率；殺蟲活性；生物活性；應(yīng)用前景

中圖分類號： S432.4+5 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）19-0183-04

收稿日期：2016-05-09

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：41301564）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程。

作者簡介：胡宗浩（1995—），男，安徽蕪湖人，主要從事環(huán)境微生物技術(shù)研究。E-mail：huzonghao321@126.com。

通信作者：何 偉，博士，副教授，主要從事環(huán)境微生物技術(shù)研究。E-mail：myway@njnu.edu.cn。 植物寄生線蟲是農(nóng)林作物的主要病原物之一，線蟲病在世界各地普遍發(fā)生，會對經(jīng)濟造成嚴(yán)重?fù)p失。松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）所到之處，松樹迅速成片枯萎，對林業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成極大的威脅[1]。全世界每年因松材線蟲危害對農(nóng)林業(yè)造成的損失超過1 250億美元[2]。1982年中國首次報道發(fā)現(xiàn)由松材線蟲引起的松樹枯萎病，自此松材線蟲在全國迅速擴散，對農(nóng)林業(yè)造成嚴(yán)重的影響[3]。盡管人類在防治上已經(jīng)作出了巨大的努力，但收效甚微，其危害范圍仍在不斷擴大[4]。目前對松材線蟲病的防治主要通過化學(xué)手段，常用的化學(xué)藥劑有豐索磷、乙拌磷、治線磷、滅線磷、蟲線清等，然而豐索磷、乙拌磷、治線磷等都是毒性較高的有機磷農(nóng)藥，對哺乳動物存在嚴(yán)重的安全隱患[5]。所以，目前迫切須要找到一種環(huán)境友好型的殺蟲劑。

靈菌紅素（prodigiosin，簡稱PGN）是一類天然紅色素家族的總稱，由多種細(xì)菌（沙雷氏菌、假單胞菌）和放線菌（鏈霉菌）產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物[6]。已有的研究結(jié)果顯示，靈菌紅素在抗真菌[7]、抗原生動物[8]、抗癌[9]、殺蟲[10]等方面都具有優(yōu)良表現(xiàn)。試驗發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素在同樣濃度下對爪洼根結(jié)線蟲和香蕉穿孔線蟲的殺害作用優(yōu)于硫酸銅[11]。

本試驗通過黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）生產(chǎn)靈菌紅素，并對其進行分離純化和鑒定，進而研究靈菌紅素對松材線蟲的殺蟲活性，為獲得新型的綠色殺蟲制劑提供技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

黏質(zhì)沙雷氏菌為筆者所在實驗室保藏，供試松材線蟲及其培養(yǎng)所需的灰葡萄孢（Botrytis cinerea）均由南京師范大學(xué)微生物所惠贈。

儀器：GWT-P270A恒溫培養(yǎng)箱（合肥達斯卡特科學(xué)器材有限公司）；722S型可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；YS2-H顯微鏡（Nikon光學(xué)儀器有限公司）；UV-1800PC全波長光譜掃描紫外可見分光光度計（上海美譜達公司）。

1.2 方法

1.2.1 靈菌紅素的分離與純化 將黏質(zhì)沙雷氏菌涂布于LB培養(yǎng)基上，于30 ℃下培養(yǎng)2 d，用雙蒸水洗脫菌體后 8 000 r/min 離心10 min，收集菌體和蛋白沉淀物，按體積比 1 ∶10 在離心沉淀物中加入pH值為3的酸性甲醇溶液，萃取靈菌紅素。再通過離心后，獲取上清液，將上清液與三氯甲烷以體積比 2 ∶1 混合均勻后，在分液漏斗中萃取。得到靈菌紅素的三氯甲烷溶液，以正己烷與乙酸乙酯的混合液（體積比1 ∶1）為流動相，經(jīng)硅膠柱層析，除去蛋白質(zhì)、多糖、黃色素等雜質(zhì)，洗脫液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮得到靈菌紅素樣品。將得到的樣品進行紫外全波長掃描鑒定。

1.2.2 線蟲的培養(yǎng) 將滅菌后的PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、1 L 蒸餾水）趁熱在超凈工作臺上制成平板，待冷卻，接種灰葡萄孢，在25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)至菌株長滿平皿時備用[12]。在無菌操作臺上挑取少量松材線蟲，放入培養(yǎng)好的灰葡萄孢培養(yǎng)基中。然后置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)5 d左右，采用布氏漏斗法獲得大量混合蟲齡的線蟲，無菌水洗滌離心后，得到10 000條/mL線蟲懸液[13]。

1.2.3 離體殺蟲活性測定 以二甲基亞砜（DMSO）為助溶劑，以無菌水為溶劑配制最高濃度為200 mg/L的靈菌紅素溶液，并按梯度稀釋得到5個濃度的藥劑，分別為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/L（DMSO終濃度應(yīng)小于1%）；以硫酸銅為陽性對照，濃度梯度相同，為200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 mg/L；以1% DMSO水溶液為對照組（CK）。每個濃度處理設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)取150 μL供試藥劑加入96孔板中，而后加入混合均勻的線蟲懸液50 μL/孔。最終靈菌紅素的濃度梯度為150.0、75.0、37.5、19.0、9.5 mg/L，硫酸銅的濃度梯度為150.0、75.0、37.5、19.0、9.5 mg/L，處理0、8、16、24、32 h時進行鏡檢，計算死亡率。

1.2.4 離體蟲卵孵化率測定 用DMSO作助溶劑（終濃度應(yīng)小于1%），以無菌水為溶劑配制最高濃度為300 mg/L的靈菌紅素溶液，并按梯度稀釋得到5個濃度的藥劑，分別為300.0、150.0、75.0、37.5、19.0 mg/L。以1% DMSO水溶液為對照組（CK）。每個濃度處理設(shè)置4個重復(fù)，每個重復(fù)取150 μL供試藥劑加入96孔的孔板中。而后加入混合均勻的線蟲卵懸液150 μL/孔，最終靈菌紅素的濃度梯度為 150.0、75.0、37.5、19.0、9.5 mg/L。處理24 h后，檢測每組線蟲卵的孵化率。endprint

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用SPSS軟件得出各處理與對照的差異顯著性，利用Excel軟件分析得出供試藥劑的毒力回歸方程式、致死中濃度LC50值及LC90值，利用Origin 8.0軟件處理得到各處理的柱形圖；用SPSS 22.0軟件，通過單因素方差分析LSD檢驗來分析數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈菌紅素的物理和化學(xué)分析

蒸發(fā)濃縮的靈菌紅素溶解于甲醇中，分別用HCl、NaOH調(diào)整pH值為3、10，在300～800 nm波長范圍內(nèi)進行全波段掃描。pH值為3時，所得靈菌紅素溶液在535 nm左右有最大吸收峰，溶液為鮮紅色；pH值為10時，所得靈菌紅素在466 nm左右有最大吸收峰，溶液為橘黃色（圖1），與已報道的靈菌紅素的吸收光譜[14]一致。

2.2 離體殺蟲活性測定

濃度為150.0 mg/L的靈菌紅素在處理8 h后，線蟲的存活率僅為20.7%，處理24 h后，線蟲存活率為0（圖2-A），用同樣濃度的硫酸銅處理8 h后，線蟲存活率為24.0%，處理24 h后，存活率降低為0（圖2-B）；當(dāng)濃度降為 75.0 mg/L 時，處理8 h后靈菌紅素組和硫酸銅組線蟲的存活率差異并不顯著，分別為22.5%、29.5%，處理24 h后，靈菌紅素組的存活率降為13.2%，而硫酸銅組則迅速降為0。隨著濃度繼續(xù)降低，濃度為37.5、19.0 mg/L的靈菌紅素的殺蟲活性明顯低于相同濃度的硫酸銅，處理32 h后，靈菌紅素組線蟲存活率為50.8%、52.5%，而硫酸銅組的為3.7%、37.1%。當(dāng)二者濃度繼續(xù)下降到9.5 mg/L時，處理32 h后靈菌紅素組的線蟲存活率為83.9%，硫酸銅組的存活率為79.0%，對照組的存活率為91.3%（圖2）?？梢猿醪降贸?，靈菌紅素在較高濃度時的殺蟲活性較同濃度的硫酸銅仍有優(yōu)勢，當(dāng)處于較低濃度時，殺蟲能力有限。盡管硫酸銅的殺蟲活性較強，但其作為一種重金屬鹽，對環(huán)境的危害較大。當(dāng)進入土壤中，會對微生物的復(fù)合生態(tài)產(chǎn)生不可逆的影響[14]。進入水體后，會產(chǎn)生更嚴(yán)重影響，水中的魚類會對Cu2+進行富集，進而通過食物鏈進入人體，使人體產(chǎn)生重金屬中毒現(xiàn)象[15]。而靈菌紅素作為一種微生物的次生代謝物，即使在較高濃度時，對生態(tài)環(huán)境中的微生物區(qū)系和植物區(qū)系都不會產(chǎn)生不利影響[16]。并且靈菌紅素具有光解特性，較高濃度的靈菌紅素在產(chǎn)生效用之后，被逐漸稀釋，而低濃度的靈菌紅素在正常光照度下會被緩慢光解，進一步減少二次污染的可能性[17]。由此可見，靈菌紅素可作為一種環(huán)境友好型的綠色藥劑替代硫酸銅以及其他一些包括有機磷農(nóng)藥在內(nèi)的對環(huán)境有害的藥劑來防治松材線蟲，其應(yīng)用前景十分廣闊。

2.3 靈菌紅素和硫酸銅的毒性比較

通過軟件得到毒力回歸方程，計算不同時間點對應(yīng)的半致死量（LC50）以及90%致死量（LC90），結(jié)果見表1。處理8 h后，靈菌紅素的LC50、LC90分別為（58.02±4.39）、（228.31±67.48） mg/L；硫酸銅的LC50、LC90分別為（58.80±4.87）、（391.84±67.77） mg/L，靈菌紅素的殺蟲活性略優(yōu)于硫酸銅。但處理32 h后，靈菌紅素的LC50、LC90分別為（42.50±1.95）、（90.24±1.41） mg/L；硫酸銅的LC50、LC90分別為（34.58±1.37）、（60.60±1.48） mg/L，硫酸銅的殺蟲活性稍強于靈菌紅素。

2.4 離體蟲卵孵化率測定

由圖3可見，對線蟲卵用無菌水和不同濃度的靈菌紅素處理24 h后，清水組的孵化率為97.6%（48 h后少數(shù)卵仍未孵化，可視為正常死亡的卵），最低濃度的靈菌紅素（9.5 mg/L）處理24 h后，卵的孵化率僅為45.5%?？梢姡`菌紅素在較低濃度時對卵的孵化率也能產(chǎn)生較大影響。隨著靈菌紅素濃度的上升，卵的孵化率進一步下降，當(dāng)濃度上升至150.0 mg/L時，卵的孵化率僅為6.0%，并且孵化的蟲卵在孵化后的短時間內(nèi)迅速死亡。可見， 靈菌紅素對卵和二齡線蟲的抑制作用更強。

3 結(jié)論與討論

黏質(zhì)沙雷氏菌被報道對部分線蟲具有良好的抑制作用，通過與線蟲形成共生體，進而使線蟲死亡，如崇明擬異小桿線蟲（Heterorhabditidoides chongmingensis）[18]。但將黏質(zhì)沙雷氏菌作為生防細(xì)菌直接投入到環(huán)境中對人和動物存在較大的安全隱患[19-20]。一些報道發(fā)現(xiàn)，有些線蟲能夠識別黏質(zhì)沙雷氏菌，并產(chǎn)生防御機制，使菌體難以進入蟲體寄生，如秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）[21]。所以，利用黏質(zhì)沙雷氏菌的次生代謝產(chǎn)物靈菌紅素來代替菌體細(xì)胞，能夠更高效且更安全的對線蟲進行防治。國內(nèi)外對靈菌紅素的研究主要在醫(yī)藥方面，但近些年發(fā)現(xiàn)，靈菌紅素在抗線蟲方面也具有較好的防治效果，主要研究的線蟲種類為根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲等[11，22]。在防治松材線蟲方面的研究仍為空白，松材線蟲由于其特殊的生理結(jié)構(gòu)和獨特的生存環(huán)境，常規(guī)方法很難殺滅[23-24]。本試驗使用的殺蟲物質(zhì)靈菌紅素為黏質(zhì)沙雷氏菌的次生代謝產(chǎn)物，結(jié)果顯示，當(dāng)靈菌紅素濃度為150.0 mg/L時，24 h內(nèi)能將松材線蟲全部殺滅，濃度為75.0 mg/L時，在處理32 h后對松材線蟲的致死率也能達到95%以上。以處理24 h的半致死量來看，靈菌紅素LC50為46.97 mg/L，相比較目前使用較廣泛的殺線蟲有機磷農(nóng)藥，如克百威（LC50=488.47 mg/L）、滅線靈（LC50=51.50 mg/L），無論在作用效果還是對環(huán)境的保護上，都具有更大的優(yōu)勢[25]。經(jīng)過多次重復(fù)試驗驗證，靈菌紅素的殺蟲活性穩(wěn)定，對不同蟲齡的松材線蟲都具有較好的抑制作用。如果能將其投入到農(nóng)林業(yè)保護的實際應(yīng)用中，勢必將對世界森林松材線蟲的防治產(chǎn)生重大影響。但目前而言，靈菌紅素的產(chǎn)量難以達到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的水平，并且靈菌紅素的光解特性使其難以成為一種持效性的殺蟲藥劑。接下來，筆者將對靈菌紅素的發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，藥物制劑的最優(yōu)配比以及安全性評價作更進一步的探究。endprint

靈菌紅素和硫酸銅殺蟲活性比較試驗顯示，相同濃度的靈菌紅素與硫酸銅的殺蟲活性無明顯差異，而硫酸銅作為一種常用的殺蟲劑，對環(huán)境的污染太大，所以靈菌紅素可作為一種有效的、綠色的新型農(nóng)藥制劑取代硫酸銅等對環(huán)境污染較大的農(nóng)藥。靈菌紅素作為黏質(zhì)沙雷氏菌等多種菌的次生代謝物，來源廣泛，可通過發(fā)酵大量獲取。

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