張琳桓，孫謐，王偉，孫晶晶，劉均忠，郝建華,3*

1(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部極地漁業(yè)開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島，266071)2(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)3(江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港，222005)

1 沙雷氏蛋白酶

1.1 蛋白酶

蛋白酶(protease)是生物體內(nèi)通過切斷蛋白質(zhì)肽鍵從而水解蛋白質(zhì)的一類酶的總稱，控制著蛋白質(zhì)的大小、組成、空間構(gòu)象及其最終降解。生物體內(nèi)的生理活動(dòng)和疾病的發(fā)生與蛋白酶息息相關(guān)，如食物的消化吸收，血液的凝固、溶血作用、消炎、血壓調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化自溶、機(jī)體衰老、癌癥轉(zhuǎn)移以及生理活性肽的活化等。

蛋白酶來源廣泛，初期來源于動(dòng)物和植物，但這兩者所分泌的均為胞內(nèi)酶，生產(chǎn)耗時(shí)耗力，故工業(yè)上一般利用微生物進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)胞外蛋白酶。蛋白酶是目前在全世界產(chǎn)量占比百分之四十且廣泛應(yīng)用的商品酶(主要應(yīng)用在食品、制革、日化和醫(yī)藥行業(yè)等)[1]。

按照國際生物化學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合會(huì)(IUBMB)命名委員會(huì)規(guī)定的命名法，蛋白酶隸屬于水解酶類的第4亞類，然而，由于自身作用和結(jié)構(gòu)多樣性，蛋白酶的命名很難與通用命名系統(tǒng)一致[2]。按照最適作用的pH值，蛋白酶可分類為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶[3]。按其水解多肽的方式，可將蛋白酶歸類為外肽酶和內(nèi)肽酶兩類[4]：外肽酶是從蛋白質(zhì)分子的游離氨基或羧基末端逐個(gè)水解多肽鏈，從氨基端水解的為氨基肽酶，從羧基端水解的為羧基肽酶；內(nèi)肽酶則是專一性地把蛋白質(zhì)多肽鏈從分子內(nèi)部切斷，形成小分子量的朊和胨。工業(yè)生產(chǎn)用的蛋白酶主要為內(nèi)肽酶。按催化中心的種類可分為絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶[5]。其中，金屬蛋白酶主要是鋅金屬蛋白酶[6]，跟據(jù)鋅離子的結(jié)合位點(diǎn)又可將鋅金屬蛋白酶分為五類：嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)、沙雷氏蛋白酶(serralysin)、龍蝦肽酶(astacin)、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixin，metalloproteinase MMP)以及蛇毒金屬蛋白酶(adamalysin)[7]。HOOPER[8]對(duì)此分類進(jìn)行擴(kuò)充，將嗜熱菌蛋白酶(thermolysin)與其他擁有谷氨酸配位的蛋白酶合并為谷氨酸鋅蛋白(gluzincin)，相應(yīng)的，將剩余后四類合并為甲硫氨酸鋅蛋白(metzincin)。

1.2 沙雷氏蛋白酶

沙雷氏蛋白酶屬于鋅金屬蛋白酶M10B亞家族(http://merops.sanger.ac.uk/)，是一種廣泛存在于革蘭氏陰性菌中的胞外內(nèi)肽酶，多存在于沙雷氏菌、菊歐文氏菌、弗氏埃希氏菌和銅綠假單胞菌中[9]。

1.2.1 沙雷氏蛋白酶的活性中心

鋅金屬蛋白酶的活性中心是由Zn2+構(gòu)成，其作用是活化水分子，使水分子親核攻擊肽鍵的羰基。N段有一段保守序列HEXXH(His-Glu-Xaa-Xaa-His，斜體表示配位體)，包含2個(gè)組氨酸配位體和1個(gè)作為一般堿基的谷氨酸[10]。甲硫氨酸鋅蛋白保守區(qū)序列延長為HEXXHXXGXXH，提供了3個(gè)組氨酸配體與Zn2+結(jié)合。HEXXH基序位于1個(gè)α-螺旋上，第三配位體在另1個(gè)α-螺旋上，而配位體要在空間上縮進(jìn)距離，必然要有一個(gè)轉(zhuǎn)角[11]。因此，β-轉(zhuǎn)角使3個(gè)金屬配體在空間上相互靠近，也是活性位點(diǎn)形成的基礎(chǔ)[12]。在β-轉(zhuǎn)角區(qū)域是否存在1個(gè)保守的甲硫氨酸，是判斷蛋白酶是否屬于甲硫氨酸鋅蛋白的依據(jù)，故又稱“甲硫氨酸轉(zhuǎn)角”[13]。對(duì)于沙雷氏蛋白酶來說，鋅配位保守序列是HEXXHXXGXXHP，在第12位上是1個(gè)脯氨酸，甲硫氨酸轉(zhuǎn)角的保守序列是SBMSY，酪氨酸是一般堿基[14]。

孫謐[15-16]等發(fā)現(xiàn)了由海洋細(xì)菌YS-80-122分泌的胞外海洋低溫蛋白酶MP，對(duì)其進(jìn)行了基因測(cè)序和晶體結(jié)晶。研究表明MP存在2個(gè)結(jié)構(gòu)域：N-端結(jié)構(gòu)域是蛋白水解結(jié)構(gòu)域，含有活性位點(diǎn)；C端結(jié)構(gòu)域主要和蛋白穩(wěn)定性有關(guān)，含平行β-卷結(jié)構(gòu)和7個(gè)結(jié)合的Ca2+。其N-端保守序列為HEXXHXXGXXHP，其中His186、His190、His196、Tyr226以及水分子是Zn2+的配體，形成了三角雙錐結(jié)構(gòu)，符合沙雷氏蛋白酶特征。除此之外，MP的N端部分氨基酸序列為ANGTSSAFTQ，與來自假單胞菌屬TAC II 18的沙雷氏蛋白酶的氨基酸序列相同，證明其確實(shí)屬于沙雷氏金屬蛋白酶[17]。

1.2.2 沙雷氏蛋白酶性質(zhì)

沙雷氏蛋白酶是胞外酶，可水解酪蛋白，被EDTA和鄰菲咯啉抑制。

KWAK[18]等發(fā)現(xiàn)了沙雷氏菌(Escratiaproteamaculans)HY-3產(chǎn)生的屬于沙雷氏蛋白酶的胞外酶arazyme，可有效地水解許多蛋白質(zhì)底物，包括白蛋白，角蛋白和膠原蛋白等。酶的蛋白水解活性不被天冬氨酸，半胱氨酸或絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制，但是被1,10-菲咯啉和EDTA強(qiáng)烈抑制。

熒光假單胞菌KT1可以分泌一種細(xì)胞外金屬蛋白酶，分子量47～48 kDa，部分氨基酸序列分析顯示該酶與沙雷氏蛋白酶高度同源。該酶被螯合劑如EDTA和鄰菲咯啉強(qiáng)烈抑制，并被某些表面活性劑活化[19]。

1.2.3 沙雷氏蛋白酶的應(yīng)用及危害

沙雷氏蛋白酶的水解能力和對(duì)應(yīng)產(chǎn)生的致病效果，使其擁有了應(yīng)用價(jià)值。KIM[20]等用幾丁質(zhì)誘導(dǎo)一種新型沙雷氏菌屬細(xì)菌KCK得到的沙雷氏蛋白酶Mpr，可以通過預(yù)處理幾丁質(zhì)來促進(jìn)幾丁質(zhì)酶A對(duì)幾丁質(zhì)的降解。通過生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法從粘質(zhì)沙雷氏菌FS14中分離鑒定出一種具有獨(dú)特V型熱穩(wěn)定性的沙雷氏蛋白酶SPB(Serralysin-like protease B，SPB)，在60 ℃時(shí)具有自溶性質(zhì)，對(duì)棉鈴蟲幼蟲具有毒性，在昆蟲控制中具有潛在的應(yīng)用[21]。

沙雷氏蛋白酶在細(xì)菌生理學(xué)中的功能被認(rèn)為是水解周圍環(huán)境中的蛋白質(zhì)底物，為細(xì)菌細(xì)胞提供簡單的營養(yǎng)[22]。奇異變形桿菌(Proteusmirabilis)在游動(dòng)細(xì)胞分化過程中產(chǎn)生許多毒素，其中包括胞外金屬蛋白酶ZapA(也稱為Mirabilysin)，該蛋白酶屬于沙雷氏蛋白酶。ZapA在感染部位分泌，破壞組織和宿主的免疫系統(tǒng)[23]。SlpE是與粘質(zhì)沙雷氏菌屬臨床分離株相關(guān)的鈣依賴性細(xì)胞毒性金屬蛋白酶，并且有證據(jù)表明SlpE導(dǎo)致沙雷氏菌對(duì)A549氣道癌細(xì)胞系的毒性[24]。郝俊[25]用PCR方法和電子顯微鏡觀察的方法驗(yàn)證了柑橘黃龍病病原中進(jìn)攻性的I型分泌蛋白(COG2931)的基因?qū)儆谏忱资系鞍酌?，并探究了其?duì)黃龍病的致病機(jī)理。

2 沙雷氏蛋白酶抑制劑

2.1 蛋白酶抑制劑

蛋白酶抑制劑是一類在動(dòng)植物和微生物體內(nèi)普遍存在且分子量很小的有環(huán)狀結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可競(jìng)爭性或非競(jìng)爭性抑制蛋白酶水解活性，在調(diào)節(jié)涉及組織蛋白動(dòng)員和蛋白質(zhì)前體加工的各種生理和病理過程中起關(guān)鍵作用，還可間接使病毒顆粒無法成熟，抑制病毒的復(fù)制。因此，許多致病蛋白酶的抑制劑是有效的抗病藥物。

不同類型的抑制劑其活性和作用靶酶不同，不同來源的抑制劑其性質(zhì)和藥理作用也各不相同，這又增加了此類藥物臨床療效的選擇性。進(jìn)一步研究蛋白酶抑制劑可以提供無毒無污染的生物農(nóng)藥，還可開發(fā)成更具特色的新型藥物[26]。

2.2 沙雷氏蛋白酶抑制劑

能抑制沙雷氏蛋白酶的抑制劑有很多種類，包括螯合劑如EDTA和鄰菲咯啉，但本文描述的抑制劑是特指從屬于沙雷氏蛋白酶的抑制劑，專一性抑制沙雷氏蛋白酶。在對(duì)產(chǎn)沙雷氏蛋白酶的微生物進(jìn)行基因組分析發(fā)現(xiàn)：這類蛋白酶基因附近都有一段抑制其酶活性的抑制劑基因，與蛋白酶基因在基因組序列中處于緊鄰的位置，屬于同一個(gè)分泌體[27]。該抑制劑基因編碼的蛋白即為沙雷氏蛋白酶抑制劑，是一種小分子蛋白質(zhì)。

沙雷氏蛋白酶抑制劑具有相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)價(jià)值，因?yàn)樗鼈兩婕霸谠S多情況下調(diào)節(jié)鋅金屬蛋白酶活性，包括假單胞菌感染、腫瘤轉(zhuǎn)移和自身免疫性疾病中對(duì)組織的破壞[28]。雖然蛋白酶抑制劑具有良好的發(fā)展?jié)摿?，但是只有少?shù)報(bào)道描述了沙雷氏蛋白酶抑制劑的特征，至于沙雷氏蛋白酶和對(duì)應(yīng)抑制劑的復(fù)合物，至今為止僅有4種被綜述。

2.2.1 沙雷氏蛋白酶抑制劑的性質(zhì)

沙雷氏蛋白酶抑制劑穩(wěn)定性較強(qiáng)，熱處理后大多可恢復(fù)抑制活性，分子量約為10 kDa。ODA[29]等從黑色鏈霉菌TK-23的培養(yǎng)濾液中分離出能夠抑制金屬蛋白酶活性的新型金屬蛋白酶抑制劑。pH 2～7條件下100 ℃處理5 min后，抑制劑保留其原始活性的80%。分子量為12 kDa，等電點(diǎn)為10.3。該抑制劑顯示出高含量的疏水性氨基酸，不含色氨酸，并具有2個(gè)二硫鍵。

LIANG[30]等從海洋細(xì)菌黃桿菌sp.YS-80-122克隆了1種新的沙雷氏抑制基因lupI，在高溫下是耐熱的。沙雷氏金屬蛋白酶抑制劑SmaPI的等電點(diǎn)約為10.0，是分子量為10 kDa的單體蛋白質(zhì)。該抑制劑在沸水中穩(wěn)定長達(dá)30 min，其熱穩(wěn)定性是由于其可逆變性[31]。

2.2.2 沙雷氏蛋白酶抑制劑的作用

沙雷氏蛋白酶抑制劑具有相當(dāng)?shù)纳飳W(xué)價(jià)值，可以治療沙雷氏蛋白酶誘發(fā)的疾病[32-33]。沙雷氏蛋白酶可不同程度的加重腦膜炎、心內(nèi)膜炎、腎炎、鼠疫、皮炎、軟組織感染、敗血癥、類鼻疽、肺炎以及其他呼吸道和尿道感染等人類疾病，甚至進(jìn)一步引起菌血癥和各種全身感染，特別是對(duì)免疫低下的癌癥和艾滋病患者尤為嚴(yán)重。在醫(yī)院感染中，主要造成手術(shù)傷口感染和新生兒感染。這種威脅被抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)所擴(kuò)大，并且增加了對(duì)新型治療方法的需求。除人類外，這些病原體還可能感染其他生物，脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物。例如，銅綠假單胞菌和粘質(zhì)沙雷氏菌都能夠通過基于毒素的機(jī)制或通過感染殺死線蟲。銅綠假單胞菌還可能攻擊植物也可在馬中造成鼻疽。沙雷氏蛋白酶的危害程度由特定的約10 kDa內(nèi)源性抑制劑(即沙雷氏蛋白酶抑制劑)所控制。這些抑制劑由相同的蛋白酶分泌物編碼，并進(jìn)一步提供約25個(gè)殘基的分泌信號(hào)肽。推測(cè)其生理功能是保護(hù)細(xì)菌周質(zhì)空間從而保證其免受蛋白酶的影響[34]。

CARSON[35]等通過繪制蛋白酶的S10結(jié)合位點(diǎn)，試圖找到蛋白酶與蛋白酶抑制劑結(jié)合的喜好與差異。在2個(gè)原始金屬蛋白酶抑制劑(1個(gè)嗜熱蛋白酶抑制劑和1個(gè)沙雷氏蛋白酶抑制劑)的基礎(chǔ)上，對(duì)抑制劑類似物的設(shè)計(jì)、合成和篩選進(jìn)行了研究。驗(yàn)證了可以開發(fā)有效地抑制沙雷氏蛋白酶的廣譜沙雷氏蛋白酶抑制劑的可能性。

植物不可避免地受到各種有害生物和病原體的侵襲，造成作物產(chǎn)量的整體損失。由于缺乏特異性，長期使用化學(xué)農(nóng)藥會(huì)使病菌產(chǎn)生抗性，污染環(huán)境，具有嚴(yán)重的缺陷。因此，可降低抗性發(fā)展并且可生物降解的生物防治劑是有利的替代品。蛋白酶抑制劑具有調(diào)節(jié)蛋白酶的作用，在保護(hù)植物免受有害生物和病原體入侵中起重要作用[36]。

3 沙雷氏蛋白酶與抑制劑復(fù)合物

3.1 沙雷氏蛋白酶與抑制劑復(fù)合的結(jié)構(gòu)

沙雷氏蛋白酶抑制劑對(duì)蛋白酶活性位點(diǎn)的抑制通常通過抑制劑的暴露結(jié)構(gòu)元件(如單個(gè)環(huán)或蛋白質(zhì)末端)獨(dú)立地或以2種及以上元件與蛋白酶活性位點(diǎn)對(duì)接來實(shí)現(xiàn)。通常來說，抑制劑的反應(yīng)位點(diǎn)和蛋白酶的活性中心是互補(bǔ)的[37]。例如利用N-端殘基與Zn2+的配位鍵，N-端Trunk結(jié)構(gòu)的長度保證了N-端殘基和鋅離子之間精確和密切的相互作用(如圖1所示)。

a-Serratia marcescens的蛋白酶SMP與Erwinia chrysanthemi的沙雷氏蛋白酶抑制劑Inh的復(fù)合體結(jié)構(gòu)；b-APR與抑制劑APRin的復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(1JIW)圖1 沙雷氏蛋白酶與其抑制劑復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Three-dimensional structure diagram of Serralysin and its inhibitor complex

3.2 四種沙雷氏蛋白酶與抑制劑復(fù)合物實(shí)例

3.2.1 蛋白酶APR與其抑制劑APRin

來自銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的1種堿性蛋白酶APR和抑制劑APRin是一組典型的沙雷氏蛋白酶與抑制劑。蛋白酶抑制劑APRin是由幾種革蘭氏陰性細(xì)菌分泌的，具有高親和性，分子量為11.5 kDa[38]。

蛋白酶APR和抑制劑APRin復(fù)合物的晶體衍射結(jié)構(gòu)分析顯示，有兩個(gè)空間上的接觸：一個(gè)是抑制劑β-折疊IV和V之間的loop環(huán)，它與蛋白酶的甲硫氨酸轉(zhuǎn)角相互接觸；另一個(gè)是N-端5個(gè)殘基構(gòu)成的Trunk結(jié)構(gòu)，約成直線狀伸入蛋白酶的β-桶結(jié)構(gòu)，占據(jù)了酶的活性中心，阻止其他多肽底物進(jìn)入酶的活性中心，末端氨基基團(tuán)(Ser)與酶的催化鋅配位，從而抑制該蛋白酶的活性[39]。

3.2.2 蛋白酶SMP與其抑制劑SmaPI

沙雷氏金屬蛋白酶抑制劑(SmaPI)是沙雷氏金屬蛋白酶(SMP)的抑制劑。前體抑制劑通過切割信號(hào)肽(26個(gè)氨基酸殘基)產(chǎn)生SmaPI。該抑制劑具有可逆變性，可在沸水中穩(wěn)定長達(dá)30 min。SmaPI以摩爾比1∶1的比例抑制SMP形成非共價(jià)復(fù)合物，顯示出高蛋白酶特異性，在檢測(cè)的各種蛋白酶中僅抑制SMP[31]。

LéTOFFé[40]等從365株粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescens)中克隆了SMP基因，并從攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體中檢測(cè)出針對(duì)SMP的抑制活性。他們認(rèn)為SmaPI的抑制活性是保護(hù)細(xì)胞免受SMP蛋白水解損傷所必需的。在SmaPI的N-端區(qū)域的連續(xù)缺失分析中， SmaPI基本能全面抑制SMP活性。Leu-3與SMP的相互作用對(duì)SMP-SmaPI復(fù)合物(8.44 kcal/mol)的整體穩(wěn)定性貢獻(xiàn)0.73 kcal/mol。通過對(duì)Leu-3定點(diǎn)突變，驗(yàn)證了疏水的Leu-3在SMP與其抑制劑SamPI結(jié)合過程中起重要作用[41]。

3.2.3 多種蛋白酶與抑制劑Inh

菊歐文氏菌(Erwiniachrysanthemi)，1種植物病原菌，可產(chǎn)生沙雷氏蛋白酶抑制劑Inh。Inh是1種非常具有熱穩(wěn)定的(95 ℃下t1/2>30 min)堿性蛋白，等電點(diǎn)約為8.5。抑制劑Inh在胞內(nèi)被合成為12 kDa的蛋白，包括19個(gè)殘基的信號(hào)肽[42]。當(dāng)抑制劑被分泌到細(xì)胞質(zhì)中后，信號(hào)肽被切割，成熟抑制劑的分子量為10 kDa。像許多蛋白酶抑制劑一樣，它與蛋白酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，形成1∶1的非共價(jià)復(fù)合物。

與SmaPI不同的是，Inh可以抑制不同的沙雷氏蛋白酶。除了對(duì)3種菊歐文氏胞外蛋白酶A、B和C有作用外，還強(qiáng)烈抑制來自沙雷氏菌的50 kDa細(xì)胞外蛋白酶SMP。BAUMANN[43]等對(duì)SMP和Inh的復(fù)合物進(jìn)行晶體分析，發(fā)現(xiàn)Inh主要通過5個(gè)N末端殘基與蛋白酶相互作用，插入活性位點(diǎn)裂隙，占據(jù)S'位點(diǎn)。第1個(gè)N-末端殘基SerI1被蛋白酶切割，而SerI2與蛋白酶的谷氨酸Glu177形成氫鍵。蛋白酶中位于甲硫氨酸轉(zhuǎn)角之后的218～228片段與由鏈s3，s4和s5形成的抑制劑的一個(gè)面還會(huì)發(fā)生進(jìn)一步的相互作用。

3.2.4 蛋白酶MP與其抑制劑LupI

來源于海洋細(xì)菌菌株YS-80-122的低溫蛋白酶MP基因下游有一個(gè)抑制劑基因LupI，該基因的表達(dá)產(chǎn)物L(fēng)upI能在體外完全抑制蛋白酶MP的活性[44]。LupI對(duì)其靶金屬蛋白酶MP的抑制常數(shù)為0.64 μmol/ L；高溫下耐熱，在100 ℃下處理1～60 min后其抑制活性仍保留35.6%～90.7%。該新型抑制劑可代表用于治療沙雷氏蛋白酶相關(guān)感染的候選藥物[30]。

MP與LupI的結(jié)構(gòu)雖然還沒有具體復(fù)合物晶體數(shù)據(jù)研究，但梁朋娟[45]等突變了抑制劑LupI的N-端Trunk結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其抑制活性大大降低。結(jié)合結(jié)構(gòu)模擬與分子對(duì)接，認(rèn)為該抑制劑與蛋白酶的結(jié)合類似于蛋白酶APR和抑制劑APRin，N-端Trunk結(jié)構(gòu)可以直接插入蛋白酶MP的活性中心，導(dǎo)致其失活。

4 結(jié)語

近年來，越來越多的學(xué)者對(duì)沙雷氏蛋白酶或者沙雷氏蛋白酶抑制劑進(jìn)行研究，提取純化、基因測(cè)序、晶體解析等研究方法日趨成熟，但對(duì)于兩者結(jié)合的具體位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)的表述較少，僅有4種沙雷氏抑制劑及其對(duì)應(yīng)蛋白酶復(fù)合物被詳細(xì)描述。沙雷氏蛋白酶在調(diào)節(jié)組織蛋白動(dòng)員和蛋白質(zhì)前體加工的各種生理和病理過程中起關(guān)鍵作用，尤其是對(duì)感染類疾病有著重要的作用。沙雷氏蛋白酶抑制劑作為特異性抑制可以只針對(duì)特定的靶蛋白酶進(jìn)行抑制，并且不受抗生素耐藥菌株的抗藥性影響，因此可就此進(jìn)行藥物的設(shè)計(jì)，以阻止沙雷氏蛋白酶的危害。進(jìn)一步探究沙雷氏蛋白酶和其抑制劑的結(jié)合有助于利用沙雷氏抑制劑針對(duì)性治療沙雷氏蛋白酶相關(guān)疾病，在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等方面均有巨大潛力。