生物農(nóng)藥茶多酚微乳劑的制備及其對(duì)稻瘟病菌的抑制效果

徐婧　沈曉蘭　周捷　李東芳　邱業(yè)先

摘要：為制備高效、穩(wěn)定的茶多酚微乳劑，延長(zhǎng)茶多酚的作用時(shí)間，使茶多酚在抑制植物病原真菌[稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）]方面發(fā)揮更好的作用。通過篩選助溶劑和乳化劑確定茶多酚微乳劑配方，研究水質(zhì)、儲(chǔ)存條件及酸堿度等因素對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響；選擇平板速率法，研究茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌的抑制效果。結(jié)果表明，根據(jù)擬三元相圖分析，丙酮和PEG800作為茶多酚的助溶劑和乳化劑時(shí)，微乳劑最穩(wěn)定且效果最好；不同劑型茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，茶多酚微乳劑>茶多酚丙酮溶劑>茶多酚水溶劑；其中茶多酚微乳劑的抑制效果最好，它對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)81%。表明選擇合適的乳化劑、溶劑種類和用量十分重要，茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌有較好的抑制作用。研究結(jié)果為植物源性農(nóng)藥微乳劑的研制提供了參考。

關(guān)鍵詞：生物農(nóng)藥；茶多酚；微乳劑；稻瘟病菌；抑菌效果

中圖分類號(hào)： S435.111.4+1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2017）19-0191-05

收稿日期：2016-05-06

基金項(xiàng)目：江蘇省蘇州市科技局科技計(jì)劃資助項(xiàng)目（編號(hào)：SNG201353）。

作者簡(jiǎn)介：徐 婧（1992—），女，江蘇揚(yáng)州人，碩士研究生，主要從事生物催化轉(zhuǎn)化工程研究。E-mail：843173685@qq.com。

通信作者：邱業(yè)先，博士，教授，主要從事蛋白質(zhì)、土壤微生物、土壤酶學(xué)及植物資源利用研究。E-mail：qyx542@163.com。 我國(guó)是世界上水稻生產(chǎn)量及需求量最多的國(guó)家之一，約占糧食作物總量的27%和38%，是我國(guó)三大糧食作物之一[1-2]。然而水稻和其他農(nóng)作物一樣，被許多病原微生物包圍，受到各種病害的干擾。世界公認(rèn)的水稻三大病害有稻瘟病（Magnaporthe grisea）、紋枯病（Rhizoctonia solani）和白葉枯?。╔anthomonas oryzae pv. oryzae）[3-4]。其中，稻瘟病是傳播最廣、危害最大的世界性病害之一，主要危害寄主植物的地上部分，是由子囊菌[Magnaprthegrisea（Hebert）Barr]引起的真菌性病害[5]。

為了有效地進(jìn)行稻瘟病的綜合防治，保障水稻的產(chǎn)量與質(zhì)量，化學(xué)藥劑長(zhǎng)期以來都是防治稻瘟病的重要手段之一。但化學(xué)農(nóng)藥的弊端也逐漸嚴(yán)重——不僅造成環(huán)境污染、生態(tài)平衡的破壞，而且會(huì)損害人體健康。因此，用生物農(nóng)藥防治稻瘟病逐漸成為主流。生物農(nóng)藥是利用生物活體或其代謝產(chǎn)物針對(duì)農(nóng)業(yè)有害生物進(jìn)行殺滅或抑制的制劑。生物農(nóng)藥主要分為3類：動(dòng)物源農(nóng)藥、微生物源農(nóng)藥及植物源農(nóng)藥。其中，植物源農(nóng)藥因在自然環(huán)境中易降解、無公害的優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為綠色生物農(nóng)藥首選之一。羅亞楠等發(fā)現(xiàn)，復(fù)方白毛藤提取液對(duì)溫室盆栽水稻稻瘟病菌有較好的防治作用[6]。Hemingway等研究表明，印度楝樹種子的冷水提取物和油浸提取物對(duì)稻瘟病菌的生防效果很好[7]。邱業(yè)先等發(fā)現(xiàn)，不同濃度的茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)具有很強(qiáng)的抑制作用，其中500、10.00 mg/mL抑制效果最好，抑制率高達(dá)100%[8-10]。

茶多酚提取工藝簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，且對(duì)人體、環(huán)境無副作用。其抑制微生物的作用機(jī)制由多種因素共同作用，最重要的特性是絡(luò)合蛋白質(zhì)[11]。已有大量研究表明，茶多酚對(duì)病原細(xì)菌尤其對(duì)醫(yī)學(xué)和食品致病細(xì)菌有較強(qiáng)的抑制作用。而茶多酚對(duì)病原真菌的抑制作用主要集中于皮膚真菌、生殖系統(tǒng)真菌，對(duì)植物真菌的抑制作用報(bào)道還較少，因此將茶多酚作為一種綠色植物源病原菌防治藥物，有極大的開發(fā)潛力。但不同結(jié)構(gòu)的茶多酚溶解度不同，對(duì)真菌的抑制效果會(huì)存在較大的差異。大部分茶多酚屬于類黃酮化合物及其衍生物，一般黃酮苷元難溶或不溶于水，卻易溶于甲醇、乙醇、丙酮、三氯甲烷、乙醚等有機(jī)溶劑或稀堿液中[12]。因此，可選用水乳劑、微乳劑、水分散性粒劑等水基化新劑型研制茶多酚微乳劑（micro-emulsion，簡(jiǎn)稱ME）[13]。

微乳劑又稱水性乳油，是用水代替有機(jī)溶劑作分散介質(zhì)，由水—表面活性劑—農(nóng)藥原油配制成的一種在熱力學(xué)上穩(wěn)定的、膨脹的、大的膠柬分散體系。借助表面活性劑的作用，將液態(tài)或固態(tài)農(nóng)藥均勻分散在水中形成透明或半透明的農(nóng)藥微乳劑。與傳統(tǒng)劑型——乳油相比，微乳劑基本不用或較少使用有機(jī)溶劑，從而降低了制劑對(duì)人和環(huán)境的污染。微乳劑劑型相對(duì)其他劑型有穩(wěn)定性好、藥效高、使用安全、高傳遞效率以及環(huán)境相容性好等特點(diǎn)。并且，農(nóng)藥微乳劑的開發(fā)歷史較短，產(chǎn)品配方、加工工藝及技術(shù)指標(biāo)等方面都有待深入研究和完善[13-14]。

茶多酚微乳劑在國(guó)內(nèi)的科學(xué)研究工作才剛起步，因此本試驗(yàn)選用茶多酚為研究對(duì)象，助溶劑、微乳劑作為研制劑型，篩選并研制茶多酚微乳劑的最佳助溶劑。運(yùn)用選擇平板速率法試驗(yàn)來確定茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌的抑制效果，為植物源性農(nóng)藥微乳劑的研制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

98%茶多酚粉末；稻瘟病菌；水稻種為圣稻16號(hào)；溶劑有甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮、乙酸甲酯（均為分析純）；乳化劑有吐溫-80、吐溫-20、司盤-20、司盤-60、農(nóng)乳 600#、PEG800。

1.2 方法

1.2.1 微乳劑組分篩選 （1）助溶劑的初選：取10個(gè)錐形瓶，向每瓶中加入0.5 g茶多酚粉劑，再分別加入10 mL待篩選助溶劑，振蕩均勻后，觀察溶解情況，選出能澄清且透明的溶劑。再各稱取0.5 g茶多酚粉劑，分別溶于10 mL篩選出的溶劑中，溶解混勻，然后依次添加0.1 g茶多酚粉劑，每次同量，直至不能再溶解，得出每10 mL助溶劑最多能溶解的茶多酚質(zhì)量，選擇用量少、溶解完全的溶劑進(jìn)入復(fù)選。（2）乳化劑的初選：按照GB/T 1603—1979《農(nóng)藥乳化劑穩(wěn)定性測(cè)定方法》的要求，對(duì)乳化劑單劑種類進(jìn)行選擇。稱取2.0 g茶多酚粉劑，溶解于20 mL助溶劑中，并按1.5 g/份，再稱取35 g各類乳化劑單體分別加入溶液中，混合均勻，然后在攪拌的情況下加入蒸餾水，定容至10 mL，在室溫下觀察是否能形成透明、穩(wěn)定、均一的體系，能形成的乳化劑進(jìn)入復(fù)選[10]。（3）復(fù)篩（擬三元相圖的繪制）：稱取茶多酚5.0 g溶于50 mL有機(jī)溶劑中制成母液，作為100%油相，標(biāo)記為O相；各類乳化劑單劑作為表面活性劑相，標(biāo)記為S相，然后按照體積比 9 ∶1、8 ∶2、7 ∶3、6 ∶4、5 ∶5、4 ∶6、3 ∶7、2 ∶8、1 ∶9把母液和乳化劑配成均相，在錐形瓶中混勻靜置，用去超純水滴定至 50.00 mL （水相，標(biāo)記為W相），并記錄滴定過程中及終點(diǎn)處的現(xiàn)象。運(yùn)用Origin 8.0軟件繪制出溶劑—乳化劑—水的擬三元相圖，通過對(duì)擬三元相圖的微乳區(qū)大小進(jìn)行分析比較，篩選出其中微乳區(qū)范圍比較廣的試劑組合。endprint

1.2.2 茶多酚微乳劑的制備工藝 采用轉(zhuǎn)相法制備微乳劑，將茶多酚溶于有機(jī)溶劑中作為油相，乳化劑加入油相中。攪拌成透明溶液，然后將水慢慢滴入油相中，邊滴加邊攪拌，剛開始時(shí)形成的是W/O型微乳劑，隨著水量的增加，發(fā)生轉(zhuǎn)相，最終形成O/W型微乳劑。

1.2.3 茶多酚微乳劑穩(wěn)定性的研究 （1）冷儲(chǔ)、熱儲(chǔ)及常溫儲(chǔ)存對(duì)穩(wěn)定性的影響：取12份等體積的茶多酚微乳劑在 100 mL 錐形瓶中，平均分為4組。其中第1組放置在（54±2）℃的培養(yǎng)箱中15 d，并進(jìn)行外觀觀察；記外觀保持均勻透明為合格，如果分層，要在室溫振蕩下恢復(fù)原狀，否則視為不合格。第2組放在冰箱中（0±1） ℃冷儲(chǔ)，保持15 d，并記錄其外觀；觀察有無沉淀，振蕩后有無可見的粒子或油狀物，沒有沉淀和分層現(xiàn)象，或者有沉淀、渾濁現(xiàn)象，但在室溫下漸漸消失，恢復(fù)透明狀態(tài)的視為合格。第3組放在冰箱中-5 ℃冷儲(chǔ)，保持15 d，并記錄其外觀結(jié)果。第4組放在室溫下儲(chǔ)存，保持15 d，并分別記錄其外觀結(jié)果。（2）水質(zhì)對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響：選出最佳配方，分別用蒸餾水、去離子水、自來水和硬水，以合適的配比來制備該配方的微乳劑，并與超純水比較，觀察剛配制完，靜置一段時(shí)間后微乳劑的外觀，記錄結(jié)果。（3）酸堿度對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響：將配好的微乳劑分為等體積的2份，一份用HCl溶液一邊慢慢調(diào)成酸性，一邊觀察其變化；另一份用配好的NaOH溶液一邊慢慢調(diào)成堿性，一邊觀察其變化。

1.2.4 茶多酚微乳劑抑制稻瘟病菌效果研究 配制等濃度的茶多酚水溶液、茶多酚丙酮溶劑、茶多酚微乳劑3種溶液，并以無菌水（CK）為對(duì)照，共4個(gè)處理，每個(gè)處理作4個(gè)平板。先在滅菌的培養(yǎng)皿中加入配好的1.00 mL各個(gè)溶液，對(duì)照組加1.00 mL無菌水，用滅了菌的打孔裝置在稻瘟病菌菌落邊緣生長(zhǎng)旺盛的部位打取菌圓片，用無菌鑷子輕挑放入凝固的培養(yǎng)基中央，且將有菌一面貼著培養(yǎng)基，每種溶液作3個(gè)處理，置于27 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，每24 h觀察1次，測(cè)量菌落直徑，觀察菌落形態(tài)、生長(zhǎng)狀況并拍照[11]。

抑菌率=對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑對(duì)照菌落直徑×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 微乳劑組分的篩選

2.1.1 助溶劑的初選 根據(jù)茶多酚的理化性質(zhì)，從中選擇甲醇、乙醇、丙三醇、異戊醇、正丁醇、乙酸甲酯、乙酸乙酯、三氯甲烷、丙酮9種有機(jī)溶劑進(jìn)行助溶劑的初選，篩選結(jié)果見表1。

2.1.2 乳化劑的初選 乳化劑是制備微乳劑的重要條件，選擇不對(duì)，就不能制成穩(wěn)定的微乳劑。選擇溶解度最高的丙酮為助溶劑，溶解茶多酚，作為原液。原液1.5 g，乳化劑3.5 g，然后加水定容至10 mL。配制一系列配方樣品，選擇可以形成均一透明的微乳劑體系，確定乳化劑單體，結(jié)果見表3。

2.1.3 微乳劑最優(yōu)助溶劑與乳化劑的復(fù)篩 采用轉(zhuǎn)相法制備微乳劑。針對(duì)初選出的助溶劑甲醇、乙醇和丙酮，先確定單一的乳化劑進(jìn)行試驗(yàn)，進(jìn)而挑選出最理想的助溶劑。繪制出母液-乳化劑-去離子水的擬三元相圖，通過對(duì)擬三元相圖微乳區(qū)域的分析比較，篩選出其中微乳區(qū)范圍比較廣的試劑組合。上述3種助溶劑的擬三元相圖如圖2至圖4所示。

通過比較擬三元相圖的微乳區(qū)面積，可以看出復(fù)配液丙酮-吐溫20-水的微乳范圍（即共溶區(qū)）最大，所以選擇丙酮為最佳助溶劑。

選擇丙酮為助溶劑與上一步試驗(yàn)初選的乳化劑復(fù)配，利用相同的方法，挑選出最理想的乳化劑。作擬三元相圖見圖5至圖7。

通過比較擬三元相圖的微乳區(qū)面積，可以看出復(fù)配液丙酮-PEG800-水的微乳范圍最大，所以選擇PEG800為最佳乳化劑，復(fù)配液丙酮-PEG800-水為最佳微乳劑體系。

2.2 微乳劑穩(wěn)定性的研究

根據(jù)丙酮和PEG800的擬三元相圖，選取茶多酚含量較高的邊界比例7 ∶3來配制微乳劑，取1 g茶多酚粉劑溶于10 mL 丙酮中，稱取7 g茶多酚丙酮溶液與3 g PEG800混合均勻，制成茶多酚微乳劑。

2.2.1 冷儲(chǔ)、熱儲(chǔ)及常溫儲(chǔ)存對(duì)穩(wěn)定性的影響 分別取等體積的微乳劑于不同溫度下放置，并分別在0、3、6、9、12、15 d時(shí)記錄其外觀。冷凍起來的一組于室溫下化開再觀察，結(jié)果見表4。

在可能儲(chǔ)藏的溫度范圍內(nèi)，冷儲(chǔ)或熱儲(chǔ)對(duì)茶多酚微乳劑基本無影響。熱儲(chǔ)期間，溶液澄清透明，符合要求，但是隨著時(shí)間的推移，微乳劑中的水分蒸發(fā)附著在試管壁上或散失，導(dǎo)致微乳劑變得黏稠。冷儲(chǔ)和常溫下的結(jié)果一致，微乳劑仍然保持澄清透明，說明茶多酚微乳劑能適應(yīng)的環(huán)境溫度變化范圍較寬，能滿足相關(guān)要求。

2.2.2 水質(zhì)對(duì)微乳劑穩(wěn)定性的影響 用蒸餾水、去離子水、硬水、自來水分別配制微乳劑，超純水作為對(duì)照，觀察并記錄水質(zhì)對(duì)微乳劑外觀的影響，結(jié)果見表5。初始外觀與靜置1 h后現(xiàn)象相同，所有溶液都形成穩(wěn)定均一的微乳劑體系，水質(zhì)對(duì)所配制的微乳劑的影響不大，說明該微乳劑復(fù)配體系對(duì)水質(zhì)的適應(yīng)能力很強(qiáng)，自來水即可滿足要求。

2.2.3 酸堿度對(duì)穩(wěn)定性的影響 按照前面的方法配好微乳劑，調(diào)節(jié)pH值，結(jié)果見表6。茶多酚微乳劑在調(diào)pH值至875時(shí)微乳劑顏色變深，但仍保持澄清，一直調(diào)至12.0時(shí)顏色已深到肉眼無法分辨溶液是否澄清。一般酸性水稻土或堿性水稻土在被水淹后，田中pH值偏中性，范圍在4.6～8.0之間，這個(gè)區(qū)間pH值對(duì)微乳劑的影響不大。

2.3 茶多酚微乳劑抑制稻瘟病菌的效果

結(jié)果如圖8所示，10.00 mg/mL的茶多酚水溶液、茶多酚丙酮溶液、茶多酚微乳劑與無菌水（CK）處理的稻瘟病菌菌落直徑不同，其中無菌水（CK）的菌落直徑最大，在7 d時(shí)達(dá)到8.641 cm，茶多酚微乳劑處理的菌落直徑最小，為1.640 cm，抑菌率為81% ；其次是茶多酚丙酮溶液和茶多酚水溶液處理的菌落，直徑分別為2.781、3.469 cm，抑菌率分別為68%、60%。由圖8可知，4個(gè)處理差異明顯，其中，茶多酚微乳劑抑菌效果>茶多酚丙酮溶液>茶多酚水溶液。endprint

觀察并記錄7 d來各組處理的稻瘟病菌菌落直徑，結(jié)果見表7。不同劑型的茶多酚對(duì)稻瘟病菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用。其中，茶多酚微乳劑的抑制效果最好，其菌絲生長(zhǎng)的抑制率達(dá)81%；茶多酚丙酮溶劑對(duì)稻瘟病病菌抑制作用其次，茶多酚水溶劑對(duì)稻瘟病病菌抑制效果最差，可能是因?yàn)椴瓒喾尤苡谒箅y以長(zhǎng)期維持本身化學(xué)性質(zhì)，而微乳劑的形式卻可以增強(qiáng)茶多酚的抑菌效果。

3 結(jié)論與討論

對(duì)助溶劑、乳化劑等復(fù)配并結(jié)合擬三元相圖的研究篩選出茶多酚微乳劑的研制配方，其中，丙酮—PEG800—水體系最好。對(duì)茶多酚微乳劑體系進(jìn)行穩(wěn)定性（水質(zhì)、酸堿度、溫度）的研究，結(jié)果顯示該體系穩(wěn)定性良好。蒸餾水、去離子水、硬水、自來水對(duì)其影響較小，從節(jié)約成本來看，自來水即可滿足要求。（54±2）℃條件下，微乳劑會(huì)隨著時(shí)間的推移出現(xiàn)黏稠現(xiàn)象，在（-5～53） ℃條件下，微乳劑均可穩(wěn)定存在，具有較寬的溫度范圍。偏堿性時(shí)，微乳劑的顏色開始變深，在低pH值條件下，茶多酚微乳劑均穩(wěn)定。將茶多酚微乳劑對(duì)稻瘟病菌進(jìn)行防治試驗(yàn)，結(jié)果顯示茶多酚微乳劑的抑菌率達(dá)81%，遠(yuǎn)高于茶多酚丙酮溶液的68%及茶多酚水溶液的60%，說明茶多酚微乳劑具有良好的防治效果。

目前，微乳劑或茶多酚的研究已經(jīng)逐漸成熟，但茶多酚做成微乳劑目前還在試驗(yàn)中（即還處于空白階段）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，甲醇、乙醇、正丁醇和丙酮作為助溶劑，茶多酚均能完全溶解。魯靜等研究者在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，乙醇、丙酮均能將牛心樸子與苦豆子全部溶解，由此可見，乙醇與丙酮助溶效果極佳[15]。微乳劑的制備工藝有乳化油法、乳化水法、轉(zhuǎn)相法等，在試驗(yàn)過程中，乳化油法、乳化水法在最初的過程中，不利于茶多酚的溶解，因而選擇轉(zhuǎn)相法。儲(chǔ)西平等研究者在制作微乳劑的過程中均采用轉(zhuǎn)相法[16-17]。在微乳劑穩(wěn)定性的研究試驗(yàn)中，水質(zhì)、酸堿度、溫度對(duì)其影響均不大，且適應(yīng)范圍較

廣。這與魯靜等研究者的研究結(jié)果[15]一致，說明丙酮-PEG800-水這個(gè)體系制成的茶多酚微乳劑具有良好的穩(wěn)定性。

本試驗(yàn)運(yùn)用的乳化劑種類相對(duì)較少，或許在未用的乳化劑中，存在更利于茶多酚溶解的乳化劑，這還需要進(jìn)一步的研究；且茶多酚微乳劑運(yùn)用到田間試驗(yàn)中，能否達(dá)到預(yù)期的效果，也需作進(jìn)一步的探究。

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