鐘 渝 趙 洋 高順記 劉 政

新型載HIF-1α反義寡核苷酸微泡聯(lián)合超聲對腫瘤生長的抑制作用

鐘 渝1趙 洋2高順記2劉 政2

目的血管毀損術(shù)治療腫瘤后，腫瘤血管均有不同程度的再生，導(dǎo)致腫瘤壞死不徹底，其核心可能與HIF-1α的高表達有關(guān)。本研究探討采用載HIF-1α反義寡核苷酸微泡聯(lián)合超聲抑制腫瘤生長的可行性。材料與方法24只荷皮下VX2腫瘤的新西蘭大白兔隨機分為新型微泡超聲組（n=8）、普通微泡超聲組（n=8）和單純超聲組（n=8）。新型微泡超聲組經(jīng)耳緣靜脈推注載HIF-1α反義寡核苷酸微泡聯(lián)合超聲輻照，普通微泡超聲組和單純超聲組分別以普通微泡、生理鹽水代替。每次10 min，每72 h治療一次，采集各時間點腫瘤二維超聲圖像，測量腫瘤切面最大直徑。結(jié)果在30 d的實驗周期內(nèi)，新型微泡超聲組、普通微泡超聲組和單純超聲組的腫瘤平均直徑由（1.13±0.19）cm、（1.17±0.21）cm、（1.22±0.17）cm 生長至（1.60±0.45）cm、（2.11±0.57）cm、（3.43±0.71）cm。治療前，3組腫瘤平均直徑差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；治療后，新型微泡超聲組腫瘤生長最緩慢，直徑顯著小于普通微泡超聲組和單純超聲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論采用載HIF-1α反義寡核苷酸微泡聯(lián)合超聲治療可以明顯增強普通微泡超聲的血管毀損作用，有望成為一種新的腫瘤治療方法。

空化；HIF-1α反義寡核苷酸；微泡，腫瘤

近年來，以“超聲空化”為核心的血管毀損術(shù)實現(xiàn)兔皮下VX2腫瘤、大鼠皮下Walker-256腫瘤微循環(huán)的研究，其目標(biāo)是徹底阻斷腫瘤微循環(huán)，進而“餓死”腫瘤，從而實現(xiàn)治療腫瘤[1-5]。然而，進一步研究發(fā)現(xiàn)血管毀損術(shù)治療腫瘤48 h后，部分腫瘤有新生血管再次長入現(xiàn)象，且隨著觀察期延長，其腫瘤血管的再通越明顯，導(dǎo)致腫瘤壞死不徹底[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧條件下，缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF-1α）的高表達在超聲聯(lián)合微泡對腫瘤血管毀損治療后的血管再通和血管新生過程中可能具有決定性作用[6-7]。因此，本研究擬采用攜帶HIF-1α反義寡核苷酸（antisense oligodexynucleotides，ASODN）的新型微泡聯(lián)合超聲治療兔VX2皮下移植瘤模型探討其抑制腫瘤生長的可行性，以進一步完善血管毀損術(shù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及設(shè)備 健康新西蘭白兔24只（合格證號SCXK-2012-2009），均為雄性，體重2.0～2.5 kg，由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院動物實驗中心提供。VX2腫瘤組織勻漿由第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院提供，日本協(xié)和發(fā)酵株式會社贈送。深圳市威爾德醫(yī)療電子有限公司新型超聲治療儀（型號DCT-700），其治療頭直徑2.3 cm，探頭頻率1.2 MHz，峰值3439 kPa，脈沖重復(fù)頻率10 Hz，占空比為0.2%，平均聲強1.2 W/cm2。Logic9超聲診斷儀，9L高頻線陣探頭，配有超聲造影成像模式及超聲造影分析軟件。“脂氟顯”微泡造影劑由第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院提供，核心氣體為全氟丙烷，外觀為乳白色凝乳狀，平均粒徑2 μm，其中98%＜8 μm，濃度約為7×109/ml；速眠新II注射液為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所研制。

1.2 實驗步驟

1.2.1 制備新型載HIF-1α ASODN脂質(zhì)微泡 ①制備含生物素修飾PEG末端、包載HIF-1α ASODN的脂質(zhì)體；②制備含豐富生物素修飾PEG末端的新型脂膜微泡；③以親和素為中間連接體，制備耦連HIF-1α ASODN脂質(zhì)體的脂膜微泡。

1.2.2 建立荷VX2皮下移植瘤模型 采用速眠新II注射液將皮下荷VX2腫瘤兔以0.15 ml/kg肌肉注射麻醉，固定于實驗臺上，用8%硫化鈉脫毛，充分暴露腫瘤區(qū)，碘伏消毒，于無菌條件下，取出腫塊置于無菌生理鹽水中，選取魚肉狀有活力的腫瘤組織剪成1 mm3的小塊，分別接種于已麻醉的24只健康新西蘭大白兔右后腿外側(cè)皮下。

1.2.3 動物分組及治療方法 將建模后的新西蘭大白兔隨機分為3組，即24只荷皮下VX2腫瘤的新西蘭大白兔隨機分為新型微泡超聲組（n=8）、普通微泡超聲組（n=8）和單純超聲組（n=8）。治療前一天應(yīng)用常規(guī)二維超聲及彩色多普勒血流顯像檢查腫瘤，二維聲像圖上采集最大切面腫瘤直徑，選擇血供較豐富的腫瘤切面固定采集影像。新型微泡超聲組經(jīng)耳緣靜脈推注載HIF-1α反義寡核苷酸微泡（0.2 ml/kg）聯(lián)合超聲輻照，普通微泡超聲組、單純超聲組分別以普通微泡、生理鹽水代替。每次10 min，每72 h重復(fù)治療一次，直到觀察期30 d結(jié)束。

1.2.4 腫瘤生長抑制效果評價采集治療前及治療后各時間點腫瘤二維超聲圖像和超聲造影影像，測量腫瘤切面最大直徑，觀察腫瘤大小及壞死情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0軟件，計量資料以±s表示，治療前、后各時間點各組腫瘤大小比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型建立 24只新西蘭大白兔均成功建立皮下荷VX2腫瘤抑制模型，腫瘤直徑1.0～1.5 cm。觀察期內(nèi)無一例死亡。

2.2 腫瘤生長抑制結(jié)果 治療前，新型微泡超聲組、普通微泡超聲組、單純超聲組腫瘤大小差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療后第15天和第30天，新型微泡超聲組、普通微泡超聲組腫瘤直徑均小于單純超聲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；新型微泡超聲組腫瘤直徑均小于普通微泡超聲組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖 1～3。

圖1 不同實驗組治療后腫瘤直徑比較

圖2 新西蘭大白兔皮下荷VX2腫瘤生長抑制曲線

圖3 各組荷VX2腫瘤新西蘭大白兔皮下不同時間點腫瘤二維超聲切面圖。A～C為新型微泡超聲組治療前、治療后第15天、治療后第30天二維超聲腫瘤最大切面；D～F為普通微泡超聲組治療前、治療后第15天、治療后第30天二維超聲腫瘤最大切面；G～I為單純超聲組治療前、治療后第15天、治療后第30天二維超聲腫瘤最大切面

3 討論

近年來，血管毀損術(shù)作為一種新的、具有潛在廣闊應(yīng)用前景的治療方法成為研究熱點[1-4]，其根本在于以“先天缺陷”腫瘤新生血管為靶點，腫瘤發(fā)生、發(fā)展需要氧氣和營養(yǎng)，多數(shù)腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移也需要通過鄰近血管，因此如果阻斷腫瘤組織內(nèi)的血管，理論上就可以抑制腫瘤細胞生長，降低轉(zhuǎn)移幾率[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)靜脈注射脂質(zhì)微泡超聲造影劑聯(lián)合超聲空化治療技術(shù)，可有效阻斷兔皮下VX2腫瘤的微循環(huán)長達24 h[2-3]。然而，血管毀損術(shù)治療腫瘤3～10 d后，部分腫瘤有新生血管再次長入現(xiàn)象，導(dǎo)致腫瘤壞死不徹底，成為該療法的瓶頸[5]。HIF-1α表達增加是機體的一種適應(yīng)性反應(yīng)，在血管毀損術(shù)治療過程中，腫瘤微血管在短時間內(nèi)被迅速毀損阻斷，造成腫瘤細胞急性缺血缺氧，HIF-1α表達及活性可能均顯著增強；同時在缺氧條件下，HIF-1α誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的抑制因子——林希病腫瘤因子（product of von hippel-lindau disease，pVHL）和缺氧誘導(dǎo)因子抑制因子（factor inhibiting hypoxia-inducible factor-1，F(xiàn)IH-1）均幾乎失去降解HIF-1α的能力[9-10]。這就導(dǎo)致HIF-1α在腫瘤組織內(nèi)大量堆積，一方面可能與缺氧產(chǎn)生的自由基等因子共同作用，誘導(dǎo)環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）產(chǎn)生，進而催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素類物質(zhì)，使腫瘤及周圍組織血管擴張、血流量增加，促進不穩(wěn)定的微血栓迅速溶解。此外，高表達的HIF-1α和COX-2均可通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF）的表達，促進腫瘤血管新生[7]。因此，HIF-1α在超聲聯(lián)合微泡對腫瘤血管毀損治療后的血管再通和血管新生過程中可能具有決定性作用，在血管毀損術(shù)基礎(chǔ)上探索一種降低腫瘤細胞HIF-1α表達進而抑制腫瘤血管新生的方法具有重大意義。

本研究采用一種耦連HIF-1α ASODN脂質(zhì)體的新型微泡替代普通脂質(zhì)微泡，在超聲擊破微泡毀損腫瘤新生血管的同時靶向釋放HIF-1α ASODN以抑制腫瘤組織在缺氧條件下HIF-1α的高表達，進而抑制VEGF的表達，以鞏固微泡增強超聲對腫瘤新生血管的阻斷效果，減少腫瘤血管再通和血管新生。該新型微泡除采用目前較成熟的具有高度特異性和低毒性的基因干預(yù)手段ASODN技術(shù)，同時充分利用微泡本身的“空化核”特性，實現(xiàn)了在腫瘤靶位的有效釋放：一方面在超聲空化作用下微泡可以引起鄰近細胞膜短暫地形成可逆性小孔，稱為“聲孔效應(yīng)”；另一方面微泡破裂時產(chǎn)生的沖擊波、高速微射流等可以使細胞的內(nèi)吞作用顯著增強，加速目的基因進入細胞，從而增強基因轉(zhuǎn)染與表達[11]。趙洋等[5]研究發(fā)現(xiàn)，普通微泡超聲能有效實現(xiàn)腫瘤生長抑制，本研究再次證實這一結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，新型微泡聯(lián)合超聲組較普通微泡超聲組更顯著而有效地實現(xiàn)了抑制腫瘤生長，觀察期末二維超聲顯示其腫瘤體積明顯小于普通微泡超聲組，進一步證實其能夠抑制腫瘤血管新生及再通。

本研究存在一些不足之處：①本研究中VX2腫瘤來源于Shope病毒致乳頭瘤惡變形成的上皮細胞惡性腫瘤，屬于鱗狀細胞癌，雖然可以代表一般腫瘤模型，但不能代表臨床所有腫瘤模型，尚不具有普遍性；②本研究觀察隨訪期僅為30 d，時間較短，未觀察動物的完整生存期；③本研究尚未對超聲發(fā)射參數(shù)和治療的重復(fù)頻率等條件進行優(yōu)化，對新型微泡聯(lián)合超聲的最優(yōu)參數(shù)組合等有待進一步深入研究。同時本研究發(fā)現(xiàn)，在新型微泡聯(lián)合超聲抑制腫瘤的生長過程中，腫瘤仍較緩慢地生長，說明腫瘤血管的再通可能存在其他機制需要進一步探討。

總之，新型載HIF-1α ASODN微泡聯(lián)合超聲能有效而確切地抑制腫瘤生長，未來有望成為一種新的無創(chuàng)治療腫瘤的方法。

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（本文編輯 周立波）

Microbubbles with HIF-1αAntisense Oligonucleotide Enhanced Ultrasound on Inhibition of Tumor Growth

ZHONG Yu ZHAO Yang GAO Shunji LIU Zheng

PurposeAfter the angiotripsy treatment of tumor,tumor blood vessels have different degrees of regeneration,leading to incomplete tumor necrosis,which may be related to the high expression of HIF-1α.To explore the feasibility of microbubble with HIF-1α antisense oligonucleotide combined with ultrasound inhabit tumor growth.Materials and MethodsTwenty-four rabbits with VX2 tumor were randomly assigned to three groups: microbubbles with HIF-1α antisense oligonucleotide plus ultrasound(HMB+US) (n=8),microbubbles plus ultrasound (MB+US) (n=8),therapeutic ultrasound alone without microbubbles (US) (n=8).Pulsed focused ultrasound was delivered directly to the tumor surface for 10 minutes during intravenous infusion of microbubbles with HIF-1α antisense oligonucleotide in the experimental group.The control groups were applied only microbubbles or saline injection.The procedure was repeated every 72 hours until the 30th day.Contrast enhanced US and grey scale ultrasonography were acquired after every treatment to get the tumor perfusion images,size and volume measurements.ResultsThe average maximum diameter of the HMB+US,MB+US,and the US groups grows from(1.13±0.19) cm,(1.17±0.21) cm,(1.22±0.17) cm to (1.60±0.45) cm,(2.11±0.57) cm,(3.43±0.71) cm within a 30d-experimental period,respectively.No statistical difference in average diameter was observed among three groups before treatment (P＞0.05).The average maximum diameter of the HMB+US group was significantly smaller than that of the two control groups at the end of experiment (P＜0.05),and the average maximum diameter of the MB+US group was significantly smaller than that of the US group (P＜0.05).ConclusionMicrobubbles with HIF-1α antisense oligonucleotide can enhance vascular damage effect of angiotripsy,which can be a novel method for tumor treatment.

Cavitation; HIF-1α antisense oligonucleotide; Microbubble,tumor

10.3969/j.issn.1005-5185.2017.10.002

1.解放軍324醫(yī)院腎病科 重慶 400020

2.第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院超聲科 重慶400037

劉 政

Department of Ultrasound,Xinqiao

Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400037,China

Address Correspondence to:LIU Zheng

E-mail: liuzhengs@126.com

重慶市基礎(chǔ)與前沿計劃項目

（cstc2013jcyjA0913）；成都軍區(qū)醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究計劃面上項目（C14022）

R454；R73-3

2017-05-27

修回日期：2017-07-22

中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志

2017年 第25卷 第10期：726-728，733

Chinese Journal of Medical Imaging 2017 Volume 25 (10): 726-728,733