李明月，沈華杰，何海珊，邱堅

(西南林業(yè)大學(xué)材料工程學(xué)院，昆明 650224)

果膠酶預(yù)處理輔助提取沉香精油研究

李明月，沈華杰，何海珊，邱堅*

(西南林業(yè)大學(xué)材料工程學(xué)院，昆明 650224)

為提高沉香精油的提取得率并縮短提取時間，利用單因素法研究不同果膠酶預(yù)處理條件對沉香精油提取的影響。結(jié)果表明，當(dāng)果膠酶預(yù)處理溫度為60℃、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、預(yù)處理時間為5 h 時，沉香精油的提取得率達21.33%，與未進行預(yù)處理的提取工藝相比，提取得率增加了11.05%，果膠酶預(yù)處理可提高沉香精油提取得率。利用氣質(zhì)聯(lián)用色譜檢測預(yù)處理后沉香精油的主要化學(xué)成分，結(jié)果表明果膠酶預(yù)處理輔助提取沉香精油提高了精油得率，同時保留了精油純度，具有良好的應(yīng)用前景。沉香精油提取后殘渣的主要化學(xué)成分測定結(jié)果表明，綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73.26%、木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.98%、灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.23%。研究結(jié)果可為精油提取后殘渣利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

果膠酶；沉香精油；提?。坏寐?/p>

沉香具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘等功效[1]，主要源于沉香中含有倍半萜類化合物和色酮類化合物[2-3]，這兩種成分主要存在于沉香揮發(fā)油中。目前除部分沉香的木質(zhì)工藝品外，大部分沉香產(chǎn)品需將沉香精油從沉香木質(zhì)部中提取出來再進行加工[4-5]，所以沉香精油的提取工藝較為重要。常規(guī)的沉香精油提取方法有水蒸氣蒸餾法、95%乙醇回流抽提法、苯醇抽提法、石油醚浸漬法等[6]。酶輔助提取法是近幾年出現(xiàn)的沉香精油提取方法，其原理為通過酶水解細(xì)胞骨架，打通溶出的通道，從而快速高效地溶出細(xì)胞中活性成分[7-8]。隨著沉香產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，沉香精油大批量產(chǎn)出后，精油提取后殘渣處理問題受到廣泛關(guān)注。

果膠廣泛存在于植物的初生壁和胞間層中，紋孔是在細(xì)胞壁形成過程中初生壁上未被加厚的部分，主要化學(xué)成分為果膠[9-10]。果膠酶是指各種可以分解果膠質(zhì)的酶的總稱，分為原果膠酶、堿性果膠酶和普通果膠酶[11-12]。近年來果膠酶被應(yīng)用于果汁加工、紡織業(yè)、木材防腐、環(huán)境保護、木材纖維分離等各個領(lǐng)域。研究者利用果膠酶酶解胞間層的果膠，從而加快纖維分離時間[13]，也有研究表明果膠酶預(yù)處理可通過打通木質(zhì)部的通道而提高木材的滲透性[14]。筆者利用果膠酶酶水解果膠作用打通沉香精油溶出通道輔助提取沉香精油，以提高精油得率為目標(biāo)，制定和完善果膠酶預(yù)處理提取沉香精油的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沉香樣品市購；果膠酶購自上海藍季生物有限公司，酶活性為20 000 U/g，可用pH范圍3.5～6.0；索氏抽提器(自組，使用回流管、燒瓶等組裝)；掃描電鏡(日本，SU3500)；THERMO TRACE1310/ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國，ISQ系列)。

1.2 試驗方法

1.2.1 果膠酶預(yù)處理最佳條件確定

沉香樣品粉碎，過40～60目(0.38～0.25 mm)篩后，取2.000 0 g至不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的果膠酶溶液中，在水浴鍋中于不同溫度條件下分別處理不同時間。加入定量乙醇溶液使乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)達到95%，使用索氏抽提器進行抽提。計算抽提所得精油得率，確定精油得率最高的預(yù)處理條件。

根據(jù)單因素考察結(jié)果(表1)，在預(yù)試驗基礎(chǔ)上選取果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%，2%，3%，4%和5%，在50℃條件下處理沉香樣品2 h；根據(jù)單因素考察結(jié)果，確定果膠酶濃度為c時精油得率較高，以c濃度的果膠酶，在預(yù)試驗基礎(chǔ)上選取處理時間2，3，4，5和6 h；根據(jù)單因素考察結(jié)果，確定果膠酶濃度為c，處理時間為t，在預(yù)試驗基礎(chǔ)上選取處理溫度為45，50，55，60和65℃；根據(jù)單因素考察結(jié)果，確定果膠酶濃度為c，處理時間為t，處理溫度為T時為果膠酶預(yù)處理最佳條件。

表1 果膠酶預(yù)處理輔助提取沉香精油方案Table 1 Processing scheme of pectinase on extractingessential oil from agilawood

1.2.2 有效抽提時間確定

樣品處理后加入適量的乙醇溶液使抽提所用液體的乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，使用索氏抽提器進行抽提，控制抽提溫度確保每小時回流次數(shù)為6次，抽提6 h后，將液體濃縮至100 mL，取抽提液25 mL，置于已恒重的蒸發(fā)皿中。將蒸發(fā)皿置于水浴鍋上蒸干，放至105℃烘箱中干燥3 h后，在干燥皿中冷卻30 min，取出后迅速稱質(zhì)量。計算精油的得率，確定精油得率最高的果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

將沉香樣品研磨(過40～60目篩)平均分為12份，其中6份選擇最佳預(yù)處理方案處理樣品沉香，6份為空白對照組不經(jīng)預(yù)處理，將2組沉香進行抽提，抽提時間分別為1，2，3，4，5和6 h，從而確定較為有效的抽提時間。

1.2.3 果膠酶預(yù)處理后沉香木質(zhì)部結(jié)構(gòu)觀察

將沉香木塊切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小木塊2組，在萊卡切片機上將徑切面表面處理光滑，選取其中1組小木塊采用最佳果膠酶預(yù)處理方案進行處理，處理后將2組小木塊在體積分?jǐn)?shù)為50%，75%，95%和100%的乙醇溶液、100%正丁醇溶液、100%二甲苯溶液中逐級脫水，試樣脫水后噴金處理，在掃描電鏡下觀察經(jīng)過果膠酶預(yù)處理的沉香樣品和未經(jīng)果膠酶處理的沉香樣品木質(zhì)部結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.4 果膠酶預(yù)處理后精油化學(xué)成分檢測

果膠酶輔助提取所得沉香精油在水浴鍋上將乙醇和水蒸干，使用色譜純甲醇溶解，通過GC-MS進行樣品分析，進樣初始溫度60℃，升溫速度為5℃/min，升溫達到280℃保留20 min。離子源溫度260℃，溶劑延遲2 min，采集模式scan mode，信號閾值500。在氣質(zhì)聯(lián)用色譜圖庫中檢測有效化學(xué)成分。

1.2.5 精油提取殘渣化學(xué)成分分析

對精油提取后的殘渣進行主要化學(xué)成分分析，綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 2677.10—1995《造紙原料綜纖維素含量的測定》進行測定。木質(zhì)素質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用Klason法進行測定。灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)參考GB/T 742—2008《造紙原料、紙漿、紙和紙板灰分的測定》進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠酶預(yù)處理方案選擇

果膠酶預(yù)處理試驗方案及不同條件預(yù)處理后精油提取得率結(jié)果見表2。由表2可見，果膠酶預(yù)處理可提高沉香精油的抽提得率。當(dāng)溫度50℃、預(yù)處理時間2 h時，果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～3%時，精油得率最高達12.53%。當(dāng)果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、預(yù)處理溫度為50℃時，隨著預(yù)處理時間增加，精油得率呈上升趨勢。當(dāng)預(yù)處理時間為5 h時精油得率18.20%；預(yù)處理時間為6 h時，精油得率18.32%，與預(yù)處理時間為5 h的得率相比增加不明顯。因此，選取最佳預(yù)處理時間為5 h。當(dāng)果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、預(yù)處理時間5 h時，不同溫度預(yù)處理試驗樣品的精油得率隨溫度升高呈緩慢上升趨勢，預(yù)處理溫度為60℃時精油得率最高達21.33%。

表2 果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)、預(yù)處理時間、預(yù)處理溫度對沉香精油提取得率的影響Table 2 Effect of pectinase concentration, pretreatmenttime and temperature on extraction rate

由上述分析可知，果膠酶預(yù)處理輔助提取沉香精油的最佳預(yù)處理條件為：果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，預(yù)處理時間5 h，預(yù)處理溫度60℃。經(jīng)此條件預(yù)處理后沉香精油得率達21.33%，與未進行預(yù)處理的提取工藝相比，沉香精油得率增加了11.05%。

圖2 果膠酶預(yù)處理前后細(xì)胞壁紋孔變化Fig. 2 Changes of pit membrane after pectinase pretreatment

2.2 果膠酶預(yù)處理對沉香抽提時間的影響

沉香精油提取得率是沉香精油提取工藝的一個重要指標(biāo)，同時提取時間、提取所需能耗也是精油提取工藝中的關(guān)鍵技術(shù)指標(biāo)。在不同抽提時間(1，2，3，4，5和6 h)對經(jīng)果膠酶預(yù)處理的樣品和對照樣品分別測定精油得率，精油得率隨時間的變化情況如圖1所示。由圖1可知，隨抽提時間延長，沉香精油得率呈增加趨勢，精油得率在1～2 h增加明顯，3 h后增加趨于平緩。經(jīng)果膠酶預(yù)處理的沉香精油得率在2 h后達到16.78%，而未進行預(yù)處理的樣品提取得率為11.82%。未經(jīng)果膠酶預(yù)處理的樣品在抽提4 h后提取得率基本穩(wěn)定，而經(jīng)果膠酶預(yù)處理的提取得率在4～6 h緩慢增加。總之，經(jīng)果膠酶預(yù)處理的樣品提取得率較未經(jīng)處理的樣品顯著增加，雖然抽提時間較長，但抽提得率增加，這表明果膠酶預(yù)處理增加了沉香精油溶出通道，能夠提高沉香精油提取得率。

圖1 抽提時間對沉香精油得率的影響Fig. 1 Effect of extraction time on extraction rate

2.3 果膠酶預(yù)處理對沉香木質(zhì)部結(jié)構(gòu)的影響

為分析果膠酶預(yù)處理對沉香木質(zhì)部結(jié)構(gòu)的影響，在掃描電鏡下觀察經(jīng)果膠酶預(yù)處理樣品與對照組樣品的紋孔結(jié)構(gòu)是否被破壞，結(jié)果如圖2所示。由圖2a可知，未經(jīng)果膠酶預(yù)處理的樣品結(jié)構(gòu)表面粗糙，紋孔緊密完整，不利于沉香精油溶出；而由圖2b可見，經(jīng)過果膠預(yù)處理后，沉香結(jié)構(gòu)表面光滑，紋孔結(jié)構(gòu)被破壞而增大，有利于沉香精油溶出，提高精油得率。

2.4 果膠酶輔助提取沉香精油的GC-MS分析

對果膠酶預(yù)處理輔助提取的沉香精油進行GC-MS分析，結(jié)果如表3和圖3所示。由表3和圖3可知，經(jīng)果膠酶預(yù)處理后，沉香精油中并未出現(xiàn)太多雜質(zhì)，沉香純度相對較高。沉香精油中的有效化學(xué)成分倍半萜類、色酮類化合物并未被破壞，如GC-MS檢測出的沉香精油中的特征有效成分2-(2-苯乙基)色酮(圖4)。由此可見，果膠酶預(yù)處理輔助提取沉香精油既能夠提高精油得率，同時未破壞精油的有效化學(xué)成分，是一種有效的精油提取工藝。

表3 果膠酶預(yù)處理后提取精油的主要化學(xué)成分Table 3 Chemical composition of extraction afterpectinase pretreatment

圖3 果膠酶預(yù)處理后提取精油化學(xué)成分的GC-MS分析Fig. 3 The GC-MS analysis of extraction after pectinase pretreatment

圖4 果膠酶預(yù)處理后提取精油化學(xué)成分2-(2-苯乙基)色酮的GC-MS分析Fig. 4 The GC-MS analysis of 2-(2-Phenyleyhyl)chromone after pectinase pretreatment

2.5 精油提取殘渣主要化學(xué)成分分析

沉香精油提取后殘渣的主要化學(xué)成分是沉香殘渣利用的重要指標(biāo)，對沉香精油提取后的殘渣進行主要化學(xué)成分分析，結(jié)果如表4所示。由表4可見，未經(jīng)處理精油提取后殘渣主要化學(xué)成分中綜纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達到77.56%，且灰分質(zhì)量分?jǐn)?shù)較少。經(jīng)果膠酶處理后綜纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)稍有降低，可能是由于果膠酶中含有少量的纖維素水解酶，從而降低了纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)。根據(jù)精油提取后沉香殘渣的主要化學(xué)成分分析，主要化學(xué)成分為綜纖維素，通過纖維素酶水解沉香殘渣中的纖維素為糖類[15]，這一方案應(yīng)用于生物質(zhì)轉(zhuǎn)換中可減少工藝中的污染，增加附加值。

表4 精油提取后沉香殘渣主要化學(xué)成分Table 4 Main chemical component of residue /%

3 結(jié) 論

利用果膠酶輔助提取沉香精油，以精油得率為指標(biāo)確定果膠酶預(yù)處理的最佳條件。果膠酶預(yù)處理中果膠酶的酶水解作用水解了細(xì)胞壁上紋孔，從而增加了沉香精油溶出的通道，進而提高沉香精油的抽提得率。當(dāng)預(yù)處理溫度為60℃，處理時間為5 h，果膠酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%時，沉香精油的提取得率最高達21.33%，較對照組增加了11.05%。果膠酶預(yù)處理輔助提取沉香精油提高了精油抽提得率，且沉香精油的有效化學(xué)成分未改變，具有一定應(yīng)用前景。

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Effectofpectinasetreatmentonextractionofessentialoilfromagarwood

LI Mingyue, SHEN Huajie, HE Haishan, QIU Jian*

(College of Materials Engineering, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

The pectinase pretreatment of agarwood was optimized including temperature, time, and pectinase dosage by using single factor test. The compositions of extracted essential oil from the agarwood before and after the pretreatment were determined by gas chromatography-msaa spectrometer to investigate the effect of the pretreatment. The xylem structure of the agarwood after pretreatment was observed by scanning electron microscope. The chemical composition of extraction residue was also analyzed. The optimum conditions were determined as enzymolysis temperature of 60℃, time of 5 h, and pectinase dosage of 2%, at which the yield of essential oil from the agarwood reached 21.33% and increased 11.05% compared with that without the pretreatment. The effective chemical components of essential oil remained the same after the pretreatment. The results from scanning electron microscope showed that the pectinase pretreatment destroyed the pits on agarwood cell wall, which could improve the extraction of essential oil. The results of chemical analysis showed that extraction residue had holocellulose content of 73.26%, lignin content of 20.98% and ash content of 0.23%.

pectinase; essential oil; extraction; yield

2017-05-05

2017-08-13

國家自然科學(xué)基金(31570555)。

李明月，女，研究方向為木材學(xué)及木材功能性改良。

邱堅，男，教授。E-mail:qiujianswfu@foxmail.com

TQ351.3

A

2096-1359(2017)06-0055-05