半夏白術(shù)天麻湯4種方法≤1000Da小分子混合物對高血壓大鼠血管緊張素Ⅱ、一氧化氮和內(nèi)皮素含量的影響

王淑玲，徐 男，孫劍鋒，周曉曉，謝 恬，蔡梅超

(1.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310012；2.山東中醫(yī)藥研究院 國家中醫(yī)藥管理局中藥分析重點(diǎn)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

半夏白術(shù)天麻湯4種方法≤1000Da小分子混合物對高血壓大鼠血管緊張素Ⅱ、一氧化氮和內(nèi)皮素含量的影響

王淑玲1，徐 男2，孫劍鋒1，周曉曉1，謝 恬1，蔡梅超3

(1.杭州師范大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310012；2.山東中醫(yī)藥研究院 國家中醫(yī)藥管理局中藥分析重點(diǎn)學(xué)科，山東 濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

目的比較半夏白術(shù)天麻湯不同提取方法對大鼠血漿中一氧化氮、血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素含量的影響。方法選用高血壓大鼠，隨機(jī)分為正常對照組、空白對照組、半仿生酶組(Semi-Bionic Enzyme Extraction，SBEE)、半仿生組(Semi-Bionic Extraction，SBE)、水提組(Water Extraction，WE)、醇提組(Alcohol Extraction，AE)，分別灌胃相應(yīng)提取液，每鼠每天1mL(濃度2.83g·mL-1)。喂養(yǎng)4W，分別測定血清中一氧化氮、血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素含量。結(jié)果4種方法提取液均可提高模型大鼠血清中一氧化氮含量，降低模型大鼠血清中血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素含量；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均Plt;0.05)。結(jié)論經(jīng)過4周的喂養(yǎng)，半夏白術(shù)天麻湯四種方法提取液均可提高模型大鼠血清中一氧化氮的含量，降低血清中血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素的含量，加入酶解過程的SBEE提取方法效果顯著。

半夏白術(shù)天麻湯；≤1000Da提取液；一氧化氮；血管緊張素Ⅱ；內(nèi)皮素

半夏白術(shù)天麻湯來源于《醫(yī)學(xué)心悟》，臨床主要用于治療高血壓病痰濕壅盛證[1-3]。半仿生提取法(Semi-Bionic Extraction，SBE)由張兆旺教授提出，至今已有21年的發(fā)展歷史；半仿生-酶法(Semi-Bionic Enzyme Extraction，SBEE)將生物酶引入SBE法，是SBE的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)選用一定規(guī)格中空纖維膜截留相對分子質(zhì)量≤1000Da提取液，采用痰濕壅盛型高血壓大鼠模型，進(jìn)一步研究半夏白術(shù)天麻湯的藥效學(xué)；為建立一種中藥用半仿生提取法研究的技術(shù)平臺奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步驗(yàn)證該方小分子提取物有效性提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1 儀器與材料 Beckman CX7全自動生化分析儀(美國貝克曼庫爾特公司)；Cobase 411全自動化學(xué)發(fā)光分析儀(美國羅氏診斷有限公司)；P-6型動物無創(chuàng)血壓測試儀(成都泰盟科技有限公司)；BL-420E+型生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(四川成都泰盟電子公司)；全自動血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

本實(shí)驗(yàn)所用中藥由張兆旺教授鑒定：半夏為天南星科植物半夏Pinelliaternate(Thunb.)Breit.的干燥塊莖；白術(shù)為菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖；天麻為蘭科植物天麻GastrodiaelataBl.的干燥塊莖；茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(schw.)Wolf.的干燥菌核；橘紅為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥外層果皮；甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的根及根莖。提取液 SBEE、SBE、WE、AE制備按照實(shí)驗(yàn)要求[4]。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物與造模 雄性Wistar大鼠90只，體重180～200g，由山東中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXR〈魯〉20090012。分成6組，每組15只；每日明暗時(shí)間各12h，室溫25℃，濕度50%。對照組喂普通飼料，模型組喂高脂高鹽飼料[5]；持續(xù)喂16W后測量體重、尾動脈收縮壓、舒張壓。收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90mmHg；同時(shí)體形肥胖，體重明顯增加，懶動，不思飲水，納呆嗜睡，大便不成形者為痰濕壅盛型高血壓大鼠模型。

1.3 藥物干預(yù) 將痰濕壅盛型高血壓大鼠隨機(jī)平均分為6組：正常組、空白對照組、SBEE組、SBE組、WE組、AE組。均喂普通飼料，空白對照組飲去離子水；SBEE組、SBE組、WE組、AE組分別灌胃相應(yīng)提取液。每鼠每天1mL(2.83g·mL-1)。正常血壓大鼠8只作為對照組，同法喂養(yǎng)4W，取大鼠尾靜脈血。

1.4 含量測定 給動物腹腔注射10%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，剖腹腔，肝門靜脈取血，全血4℃離心20min(3500r·min-1)，收集上清液待用。按文獻(xiàn)應(yīng)用雙抗夾心法測定待測標(biāo)本中血管緊張素Ⅱ水平[6]。加樣品稀釋液90μL在酶標(biāo)包被板上，再加待測樣品10μL，充分混勻置37℃ 120min；按文獻(xiàn)應(yīng)用雙抗夾心法，酶標(biāo)儀在450nm處測OD值，計(jì)算一氧化氮的含量[6-7]。在酶標(biāo)包被板上先加樣品稀釋液40μL，待測樣品10μL，溫育30min。棄液體，洗滌液5次，拍干；空白孔除外，每孔加酶標(biāo)試劑50μL，溫育30min；棄去液體，甩干，洗滌5次，拍干；顯色，終止反應(yīng)；以空白孔調(diào)零，450nm波長測量各孔的OD值，計(jì)算內(nèi)皮素的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13. 0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析，P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.2 綜合評判R值 將R1～R3求平均值得RA，為對高血壓痰濕壅盛型大鼠血清影響的綜合評價(jià)值，大者為佳。由表2中數(shù)據(jù)可知，SBEE法綜合評判R值最大，即半夏白術(shù)天麻湯提取方法以SBEE法對實(shí)驗(yàn)大鼠血清相關(guān)指標(biāo)影響最大，提示藥效更顯著。

表1 治療后各組大鼠血清NO、血管緊張素Ⅱ和內(nèi)皮素情況

注：△與空白對照組比較，P﹤0.05；#與正常對照組比較，P﹤0.05。

表2 實(shí)驗(yàn)后各組大鼠各指標(biāo)綜合評判RA值

注：①RA=(R1+R2+R3)/3

3 討論

高血壓病在中醫(yī)學(xué)中屬于“眩暈”范疇。分為肝火亢盛型、肝腎陰虛型、痰濕壅盛型、瘀血阻絡(luò)型。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)原發(fā)性高血壓根據(jù) Lragah等的意見，認(rèn)為可以分為二大類型：一類屬于腎素依賴型，另一類為容量依賴型。隨著祖國醫(yī)學(xué)對原發(fā)性高血壓的分型研究的不斷深入，也有各種不同的分型，近年來，我們對這方面的研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者絕大多數(shù)屬于陰虛陽亢型及氣陰兩虛型，這二大類型不但有明確不同的中醫(yī)辨證見證，而且有不同的病理生理改變，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的分型也有一定的關(guān)系。

半夏白術(shù)天麻湯為中醫(yī)經(jīng)典方劑，來源于《醫(yī)學(xué)心悟》。由半夏、天麻、茯苓、橘紅、白術(shù)、甘草組成。具有燥濕化痰，平肝息風(fēng)的作用。主治風(fēng)痰上擾所致眩暈頭痛，胸悶嘔惡，舌苔白膩，脈弦滑等證。為治風(fēng)化痰的代表方劑，現(xiàn)代用于治療痰濕壅盛型高血壓、痰濕型內(nèi)耳眩暈證(美尼爾氏綜合征)，痰迷心竅所致的癲癇，風(fēng)痰阻痹經(jīng)絡(luò)之中風(fēng)及后遺癥等。風(fēng)痰諸證病緣于脾濕生痰，痰阻清陽，加之肝風(fēng)內(nèi)動，風(fēng)痰上擾清空所致。前人有“無痰不作?！?，“諸風(fēng)掉眩，皆屬于肝”之說。肝風(fēng)內(nèi)動，則頭眩物搖，又因濕痰上擾，濁陰上逆，故眩暈更甚，自覺天旋地轉(zhuǎn)，遂作嘔吐惡逆。治宜化痰息風(fēng)。方中半夏辛溫，長于燥濕化痰，降逆止嘔以治其本；天麻甘平，善于平肝息風(fēng)止暈而治其標(biāo)。二藥合用，標(biāo)本兼顧，功?；迪L(fēng)為君藥。以白術(shù)為臣，健脾燥濕，與半夏、天麻配伍，祛濕化痰、止眩之功益佳。佐以茯苓健脾滲濕，與白術(shù)相伍，尤能治生痰之本；橘紅理氣化痰，使氣順則痰消。使以甘草調(diào)藥和中，諸藥合用，共奏化痰息風(fēng)之效。風(fēng)息痰消，眩暈自愈。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)與高血壓的相關(guān)性，主要集中在腎素活性( plasmatic renin activity，PRA)、AngⅡ水平等方面[8]。AngII是RAS的主要活性物質(zhì)，為血管活性肽和生長因子，可收縮腎小球小動脈，引起腎小球毛細(xì)血管靜水壓升高，亦可刺激系膜細(xì)胞內(nèi)DNA 和蛋白質(zhì)合成，使系膜細(xì)胞增殖和肥大[9]。目前，血管緊張素受體阻滯劑(angiotensin receptor blockers，ARBs) 和血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitors，ACEI) 類藥物廣泛用于臨床治療高血壓。

痰濕壅盛是高血壓重要證型之一?，F(xiàn)代研究表明，高脂血癥與中醫(yī)痰濁密切相關(guān)，痰濁是高血壓病的重要病機(jī)之一。痰證與血液流變學(xué)、與氧自由基、糖代謝、能量代謝酶等皆密切相關(guān)。氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)的形成是對內(nèi)皮細(xì)胞的損傷的重要環(huán)節(jié)。內(nèi)皮細(xì)胞釋放ET 、NO等物質(zhì)，ET和NO是維持血管的正常狀態(tài)、功能的重要物質(zhì)。當(dāng)ET及NO系統(tǒng)信號通路異常，會引起血管內(nèi)皮功能紊亂、內(nèi)皮壞死、血管壁破壞。甚至引起血管內(nèi)局部缺氧、代謝物堆積等，最終導(dǎo)致血壓升高、微循環(huán)障礙等[10]。

AngⅡ、ET含量升高以及NO含量降低在高血壓的發(fā)病中起著極為重要的作用，是導(dǎo)致高血壓發(fā)病并使之持續(xù)的重要機(jī)制之一。ET是目前已知的體內(nèi)最強(qiáng)的血管收縮因子，NO是內(nèi)皮細(xì)胞釋放的舒張血管物質(zhì)。高血壓病人的血管內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，NO合成或分泌不足。ET可催化合成AngⅡ,AngⅡ可誘導(dǎo)增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞ET基因表達(dá)，故AngⅡ和ET是相互促進(jìn)的關(guān)系。NO可抑制ET和AngⅡ的的生成和釋放。

為探索多種提取方法半夏白術(shù)天麻湯的對血管活性因子影響，進(jìn)一步探索該方對痰濕壅盛性高血壓的作用機(jī)理。本研究選取藥效指標(biāo)AngⅡ、ET、NO?？疾熘笜?biāo)≤1000Da分子量的提取物。由于目前大多數(shù)中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，研究證明，吸收入血的成分一般為小分子物質(zhì)，故選取≤1000Da分子量的提取物為指標(biāo)[11]，優(yōu)選工藝和控制質(zhì)量，更能體現(xiàn)中藥整體、綜合、客觀、模糊的特點(diǎn)，對中藥現(xiàn)代化研究很有借鑒意義[12]。并且與粗提物相比，降低提取物量，縮小劑量，也為選用現(xiàn)代新劑型開發(fā)產(chǎn)品提供了可能。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明半夏白術(shù)天麻湯提取液可提高痰濕壅盛型高血壓大鼠血清中NO的含量，R1值的大小次序?yàn)镾BEE組、SBE組、AE組、WE組。提取液可降低痰濕壅盛型高血壓大鼠血清中AngⅡ和ET的含量，其中，SBEE液作用最佳。提示，該方通過影響AngⅡ、ET、NO的含量，治療濕壅盛型高血壓。

[1]熊興江，王階．論半夏白術(shù)天麻湯在高血壓病中的運(yùn)用[J]．中華中醫(yī)藥雜志，2012，27 ( 11)：2862-2867．

[2]陳新宇，尹玲瓏，劉紫軒，等．半夏白術(shù)天麻湯治療原發(fā)性高血壓臨床療效Meta分析[J]．遼寧中醫(yī)雜志，2014，41( 2)：196-199．

[3]朱梅，鞠建慶，李運(yùn)倫．半夏白術(shù)天麻湯治療痰濕壅盛型原發(fā)性高血壓隨機(jī)對照試驗(yàn)系統(tǒng)評價(jià)[J]．山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，38( 2)：105-108．

[4]王淑玲，徐男，孫云廷，等.截留相對分子質(zhì)量≤1000半夏白術(shù)天麻湯4種提取液對原發(fā)性高血壓大鼠血清中單胺類遞質(zhì)的影響[J].藥物評價(jià)研究，2016，39(5):772-777.

[5]陳騰蛟，徐男.自發(fā)性高血壓痰濕壅盛型大鼠動物模型的構(gòu)建和分析評價(jià)[J].藥學(xué)研究，2015，34(9)：53-56.

[6]韓麗，李明珠. 半夏白術(shù)天麻湯對高血壓模型大鼠血管緊張素Ⅱ、內(nèi)皮素、一氧化氮含量的影響[J]. 黑龍江中醫(yī)藥，2003，46(3)：39-40.

[7]田廣周. 益腎降壓片對高血壓模型大鼠血壓和腎素血管緊張素系統(tǒng)、內(nèi)皮素、一氧化氮含量的影響[J]. 光明中醫(yī)，2010，25(3)：420-421.

[8]盧健棋，溫志浩. 腎素-血管緊張素系統(tǒng)與中醫(yī)藥防治高血壓病的相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2015，13(18)：2073-2076.

[9]韓琳，秦建國，高譽(yù)珊，等. 降壓通絡(luò)方對高血壓腎損害大鼠腎臟血管緊張素II及腎功能的影響[J]. 環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8(1):36-41.

[10]張蕾，阮君山，嚴(yán)令耕，等. 內(nèi)皮素和一氧化氮致血管損傷性疾病的分子機(jī)制及藥物研發(fā)策略[J]. 中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28(2):162-162.

[11]徐男，時(shí)海燕. 論半仿生提取法內(nèi)涵[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(12)：38-40.

[12]郭立瑋，陸敏，付廷明，等. 基于中藥復(fù)方小分子藥效物質(zhì)組“溶液結(jié)構(gòu)”特征的膜分離技術(shù)優(yōu)化原理與方法初探[J].膜科學(xué)與技術(shù)，2012，32(1)：1-11.

EffectsofBanxiaBaizhuTianmadecoctions(≤1000Da)onthecontentofangiotensinⅡ，NOandendothelininhypertensionrats

WANG Shu-ling1, XU Nan2,SUN Jian-feng1, ZHOU Xiao-xiao1, XIE Tian1，CAI Mei-chao3

(1.CollegeofMedicine，HangzhouNormalUniversity,Hangzhou310012； 2.KeydisciplinesonAnalysisofTraditionalChineseMedicine,ShandongAcademyofChineseMedicine,Jinan250014；3.ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250355，China)

ObjectiveTo evaluate the effects of Banxia Baizhu Tianma decoctions extracted by diferent methods on the content of angiotensin Ⅱ、NO and endothelin in rat plasma.MethodHypertensive rats were randomly divided into six groups, namely, normal control group, the control group, SBEE group, SBE group, WE group and AE group, and fed with the respective extract, per mouse 1mL (2.83g·mL-1) per day. Four weeks after feeding, the content of serum nitric oxide, angiotensin Ⅱ and endothelin levels were determined.FindingsFour methods could increase serum nitric oxide content of the model rat and reduce serum angiotensin Ⅱ and endothelin .The differences were statistically significant.ConclusionAfter four weeks of feeding, four-method extract of Banxia Baizhu Tianma decoctions could increase the content of serum nitric oxide and reduce the content of angiotensin Ⅱ and endothelin. The effect of SBEE extraction with the enzymolysis process is remarkable.

Banxia Baizhu Tianma decoction; ≤1 000 Da extraction ; angiotensin Ⅱ; NO; endothelin; hypertension

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.05.010

2017-05-05

浙江省自然科學(xué)基金(LY16H270018)；國家科技部國際合作項(xiàng)目(2007DFA31180)。

王淑玲(1972 - )，女，山東利津人，博士，講師。

R285.5

A

1674-6449(2017)05-0510-04