龍海波, 陳 文, 裴月令, 馮推紫, 孫燕芳

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理實驗室,?？?571101; 2. 貴州省植物保護研究所, 貴陽 550006)

貴州省大豆孢囊線蟲的發(fā)生與分布

龍海波1*, 陳 文2, 裴月令1, 馮推紫1, 孫燕芳1

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理實驗室,?？?571101; 2. 貴州省植物保護研究所, 貴陽 550006)

大豆孢囊線蟲病是威脅大豆生產(chǎn)的重大病害之一。2015-2016年,采用隨機取樣的方法對貴州省大豆孢囊線蟲的發(fā)生和分布情況進行了調(diào)查。調(diào)查范圍包括貴陽、六盤水、安順、畢節(jié)、黔西南和遵義等6個地區(qū)下轄的14個縣(區(qū)),共采集土樣287份。調(diào)查結(jié)果表明,貴州省大豆孢囊線蟲的總檢出率為28.2%,其中畢節(jié)地區(qū)的大方縣和赫章縣孢囊檢出率最高,分別達到46.7%和45.0%,而在遵義市、貴陽市和黔西南州孢囊檢出率為0。六盤水地區(qū)的水城縣孢囊發(fā)生量最大,平均孢囊數(shù)為3.4個/200 g土,最大孢囊數(shù)達到17個/200 g土;安順地區(qū)的鎮(zhèn)寧和關(guān)嶺縣大豆孢囊線蟲發(fā)生程度最輕,每200 g土樣平均孢囊數(shù)分別為0.3和0.2個,最大孢囊數(shù)僅為2個/200 g土。分離的孢囊主要形態(tài)特征與大豆孢囊線蟲一致,并且ITS序列與甘肅大豆孢囊線蟲種群序列一致性達100%。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和ITS序列分析比對,將貴州省采集到的孢囊線蟲鑒定為大豆孢囊線蟲。本研究結(jié)果可為有效防控貴州省大豆孢囊線蟲病提供依據(jù)。

貴州省; 大豆孢囊線蟲; 發(fā)生; 分布

大豆孢囊線蟲Heteroderaglycines(soybean cyst nematode)是一種專性、固著型內(nèi)寄生植物病原線蟲,其引起的大豆孢囊線蟲病是大豆生產(chǎn)上的毀滅性病害之一[1-2]。大豆孢囊線蟲于1988年在我國東北地區(qū)首次發(fā)現(xiàn),目前在中國、俄羅斯、美國、加拿大、巴西、阿根廷等世界主要大豆種植國家廣泛分布,每年造成數(shù)十億美元的經(jīng)濟損失[3-4]。在中國,黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、北京、安徽、江蘇、山東、山西、河北、河南、浙江、陜西、寧夏、甘肅和新疆等近20余個省(自治區(qū)、直轄市)均已有SCN的發(fā)生報道[5-9],發(fā)生面積超過200萬hm2,其中以東北和黃淮海大豆產(chǎn)區(qū)發(fā)生最為嚴(yán)重,一般引起大豆減產(chǎn)30%～50%,嚴(yán)重時甚至可導(dǎo)致絕產(chǎn)[10]。據(jù)報道,大豆孢囊線蟲在我國不僅危害大豆,還可侵染煙草、地黃和泡桐等經(jīng)濟作物[11-13]。

貴州位于云貴高原東部,屬于典型的喀斯特地貌山地省,大豆種植區(qū)域廣,從海拔200～2 300 m均有分布,資源十分豐富[14]。由于獨特的地理環(huán)境,貴州大豆的種植方式主要是與玉米等作物進行間、套作[15]。盡管貴州大豆種植歷史悠久,但一直未有大豆孢囊線蟲病害調(diào)查和發(fā)生分布的研究。2015年7月,筆者在對貴州省作物孢囊線蟲種類進行調(diào)查時首次在六盤水市的水城縣分離到大豆孢囊線蟲。隨后,筆者對貴州的貴陽市、畢節(jié)市、黔西南州和安順市等地區(qū)的大豆孢囊線蟲進行了系統(tǒng)的采樣調(diào)查,以期明確大豆孢囊線蟲在貴州的分布范圍、發(fā)生程度和危害特點,為該病害的及時有效治理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 取樣調(diào)查

2015-2016年,對貴州省的貴陽、六盤水、安順、畢節(jié)、黔西南和遵義等6個地級市下轄的14個縣(區(qū))共287個地塊進行了調(diào)查。采用5點取樣法對每一地塊土壤進行取樣,挖取表土下20 cm左右土壤,每塊地取1～2 kg裝于塑料自封袋,標(biāo)注采集信息帶回實驗室分離孢囊。

1.2 孢囊分離

參照黃文坤等[16]描述的方法進行。采集的土壤樣品經(jīng)自然風(fēng)干,混勻后每份稱取200 g土壤置于塑料桶中加水沖洗,充分?jǐn)噭雍髮⒛酀{懸浮液依次經(jīng)20目(0.83 mm孔徑)和100目(0.15 mm孔徑)篩網(wǎng)過濾。收集100目篩網(wǎng)殘渣用清水沖洗干凈,轉(zhuǎn)移至定性濾紙上,體式顯微鏡下觀察并挑取孢囊計數(shù)。

1.3 孢囊形態(tài)學(xué)鑒定

每樣點隨機挑取1～2個飽滿的孢囊,取部分孢囊切取陰門錐,將切下的陰門錐制成臨時玻片,在顯微鏡下直接觀察。按照王明祖等[17]的方法對孢囊線蟲種類進行初步鑒定。

1.4 rDNA-ITS序列擴增

在形態(tài)學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上,隨機挑取10個飽滿孢囊,參照亓?xí)岳虻萚18]方法提取單個孢囊線蟲的DNA。利用通用引物TW81(GTTTCCGTAGGTGAACCTGC)和AB28(ATATGCTTAAGTTCAGCGGGT)擴增孢囊線蟲的rDNA-ITS序列[19]。PCR總體系為50 μL,其中10×PCR Buffer 5 μL,dNTPs 4 μL,Mg2+3 μL,上下游引物各1 μL,rTaq酶(TaKaRa)0.25 μL,DNA模板5 μL,滅菌雙蒸水30.75 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;然后94℃ 30 s,55℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠純化、連接、轉(zhuǎn)化,最后挑取陽性克隆送華大基因公司測序。

2 結(jié)果

2.1 貴州孢囊線蟲的分布狀況

共采集了貴州省14個縣(區(qū)),52個鄉(xiāng)鎮(zhèn)287份田間土樣,其中共有81份土樣分離到孢囊線蟲,檢出率為28.2%(表1)。由表1可知,在畢節(jié)、六盤水和安順采集的土樣中都檢測到孢囊,其中畢節(jié)地區(qū)的大方縣和赫章縣孢囊檢出率最高,分別達到46.7%和45.0%。其次,六盤水的水城縣孢囊檢出率也達到了42.9%。而在遵義市、貴陽市和黔西南州采集的74份土樣中均未檢測到孢囊線蟲(表1)。

2.2 孢囊線蟲的發(fā)生程度

由表2可知,貴州檢測出孢囊的地區(qū)總體孢囊發(fā)生程度均較輕,但不同地塊的孢囊密度差別較大。其中,安順地區(qū)的鎮(zhèn)寧和關(guān)嶺孢囊線蟲發(fā)生程度最輕,每200 g 土樣平均孢囊數(shù)分別為0.3個和0.2個,最大孢囊數(shù)僅為2個/200 g土。六盤水地區(qū)的水城縣孢囊量最大,平均孢囊數(shù)為3.4個/200 g土,最大孢囊數(shù)達到17個/200 g土。畢節(jié)地區(qū)的孢囊量居中,每200 g 土樣平均孢囊數(shù)在0.8～1.8個之間,其中大方縣最大孢囊數(shù)也達到了11個/200 g土,但黔西縣最大孢囊數(shù)僅為3個/200 g土(表2)。

表1大豆孢囊線蟲在貴州不同地區(qū)的發(fā)生與分布情況

Table1OccurrenceanddistributionofHeteroderaglycinesindifferentregionsinGuizhou

地區(qū)(市)Region(City)縣County采集土樣數(shù)/份Numberofsample檢出孢囊土樣數(shù)/份Numberofsamplewithcyst孢囊檢出率/%Cystdetectionratio六盤水Liupanshui水城Shuicheng351542．9盤縣Panxian22836．4畢節(jié)Bijie納雍Nayong20525．0大方Dafang452146．7赫章Hezhang401845．0黔西Qianxi261038．5黔西南Qianxinan晴隆Qinglong1600安龍Anlong1600貞豐Zhenfeng1800興義Xingyi1200安順Anshun鎮(zhèn)寧Zhenning10220．0關(guān)嶺Guanling15213．3貴陽Guiyang花溪Huaxi900遵義Zunyi遵義Zunyi300

表2大豆孢囊線蟲在貴州不同地區(qū)的發(fā)生程度

Table2OccurrencedegreeofHeteroderaglycinesindifferentregionsinGuizhou

縣County含不同孢囊數(shù)量地塊的百分率/%Percentageofsampleswithdifferentquantitiesofcysts01～56～1010～1516～20最大孢囊數(shù)/個·(200g土)-1Maxnumberofcysts平均孢囊數(shù)/個·(200g土)-1Averagedensityofcysts水城Shuicheng57．120．05．78．68．6173．4盤縣Panxian63．627．39．10．00．091．1納雍Nayong75．015．010．00．00．071．0大方Dafang53．335．68．92．20．0111．8赫章Hezhang55．037．57．50．00．0101．5黔西Qianxi61．538．50．00．00．030．8鎮(zhèn)寧Zhenning80．020．00．00．00．020．3關(guān)嶺Guanling86．713．30．00．00．020．2

2.3 孢囊線蟲的鑒定

分離的孢囊的主要形態(tài)特征與大豆孢囊線蟲一致(圖1)。孢囊深褐色或黃色,檸檬形,陰門錐和頸部都有明顯的突出;陰門錐下方有較多不規(guī)則的泡狀突,排列不整齊,下橋發(fā)達。陰門膜孔為雙半膜孔(圖1)。進一步應(yīng)用通用引物TW81和AB28擴增孢囊線蟲18S和28S rDNA之間的ITS序列,均獲得了大小約為1 000 bp的電泳條帶(圖2)。測序結(jié)果表明,回收片段長度均為1 030 bp。其中,選擇畢節(jié)大方種群(GZDF1,GenBank登錄號KY964273)進行同源性搜索比對,結(jié)果顯示該序列與GenBank中來自我國甘肅地區(qū)的大豆孢囊線蟲種群(Hg-GS4)ITS序列(GU595427)具有100%的一致性(E-value=0)。因此,根據(jù)形態(tài)學(xué)特征和ITS序列,將在貴州分離的孢囊種類鑒定為大豆孢囊線蟲。

圖1 大豆孢囊線蟲的孢囊(a)及陰門錐(b, c)形態(tài)Fig.1 Morphological characteristic of cyst (a) and vulval cone (b, c) of Heterodera glycines

圖2 大豆孢囊線蟲rDNA-ITS擴增片段電泳檢測Fig.2 PCR amplification of rDNA-ITS sequences of Heterodera glycines

3 討論

大豆孢囊線蟲通常以孢囊的形式在土壤中越冬越夏,卵塊在孢囊的保護下具有很強的抗逆性,能在缺少寄主的條件下存活數(shù)年,直至遇到適宜的條件再孵化成2齡幼蟲侵染寄主[20]。因此,大豆孢囊線蟲病是一種毀滅性的土傳病害,一旦發(fā)生,極難治理。我國大豆孢囊線蟲發(fā)生率最高的地區(qū)在東北和黃淮海地區(qū),檢出率在50%以上[5]。孫玉秋等[21]調(diào)查了黑龍江35個市縣的112份土樣,發(fā)現(xiàn)大豆孢囊線蟲的發(fā)生率達到100%。黑龍江省每年因大豆孢囊線蟲病危害造成的大豆減產(chǎn)達4億公斤,經(jīng)濟損失達14億～18億元[22]。此外,張俊立等對河北省大豆孢囊線蟲的分布和危害進行了調(diào)查,結(jié)果表明大豆孢囊線蟲病的總發(fā)生率也達到了73.93%[6]。本研究表明,貴州省大豆孢囊線蟲的發(fā)生分布主要集中在貴州省西北部。盡管總檢出率僅為28.2%,但畢節(jié)和六盤水的一些地塊檢出率超過40%,表明兩地大豆孢囊線蟲發(fā)生已較為普遍。值得注意的是,大豆孢囊線蟲還可寄生煙草[19],而貴州是我國重要的煙葉生產(chǎn)大省,需引起高度重視,防止大豆孢囊線蟲進一步傳播擴散。

大豆孢囊線蟲的危害水平與田間初始孢囊密度(或卵塊密度)密切相關(guān)。在美國,大豆孢囊線蟲的防控閾值大約為每100 cm3土中有100個卵[20]。大豆孢囊線蟲的單孢囊卵量一般為200～600個[23]。周書其等[24]通過人工室內(nèi)接種測定了不同孢囊密度對大豆產(chǎn)量的危害損失率,結(jié)果表明,100 g土中接種1個孢囊,大豆產(chǎn)量損失15%;接種10個孢囊,大豆減產(chǎn)36%,而接種30個和100個孢囊,減產(chǎn)分別達到了48%和75%。由此可見,每100 g土壤中含有1個飽滿孢囊即可導(dǎo)致大豆產(chǎn)量損失。本研究表明,貴州地區(qū)總體孢囊發(fā)生程度較輕,但不同地塊的孢囊密度差別較大。孢囊發(fā)生量最大的地區(qū)在水城縣,平均孢囊數(shù)為3.4個/200 g土,單份土樣最大孢囊數(shù)達到了17個/200 g土(表2)?？梢酝茰y,大豆孢囊線蟲已對當(dāng)?shù)卮蠖乖斐闪艘欢ǔ潭鹊漠a(chǎn)量損失。而且,貴州大豆通常種植在坡地、山地,灌溉條件差,栽培粗放,植株抵抗力差,大豆孢囊線蟲的危害可能比平原地區(qū)更為嚴(yán)重。

目前,防治大豆孢囊線蟲的主要措施有輪作、種植抗性品種和使用化學(xué)藥劑[25]。化學(xué)殺線劑使用成本較高,并不適宜在貴州山區(qū)推廣應(yīng)用。同時,大豆孢囊線蟲病是積年流行性病害,即使采取與非寄主作物輪作的措施,1～2年后重新種植寄主植物,大豆孢囊線蟲仍能大量繁殖。此外,大豆孢囊線蟲種群擁有豐富的遺傳多樣性,理論存在的生理小種有16個[26],增加了抗性育種的難度。本研究初步明確了大豆孢囊線蟲在貴州省的分布和發(fā)生程度,還需深入開展大豆孢囊線蟲病的發(fā)生規(guī)律調(diào)查、明確生理小種、篩選抗病品種及高效低毒殺線劑,確保貴州大豆產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

[1] Noel G R.The soybean cyst nematode [C]∥Lamberti F, Taylor C E. Cyst nematodes. New York:USA.Plenum Press, 1986: 257-268.

[2] 劉維志.植物病原線蟲學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2000: 281-293.

[3] Jones J T, Haegeman A, Danchin E G J, et al. Top 10 plant-parasitic nematodes in molecular plant pathology [J]. Molecular Plant Pathology, 2013, 14(9): 946-961.

[4] Klink V P, Overall C C, Alkharouf N W, et al. A time-course comparative microarray analysis of an in compatible and compatible response byGlycinemax(soybean) toHeteroderaglycines(soybean cyst nematode) infection [J]. Planta, 2007, 226(6): 1423-1447.

[5] 宋美靜,朱曉峰,王東,等.我國大豆主產(chǎn)區(qū)大豆胞囊線蟲群體分布及致病性分化研究[J].大豆科學(xué),2016,35(4):630-636.

[6] 張俊立,彭德良,曹克強. 河北省大豆孢囊線蟲分子鑒定及其分布[J]. 植物保護, 2005,31(1): 40-43.

[7] 李克梅,日孜旺古麗,董艷秋. 新疆大豆孢囊線蟲病的初步研究[J]. 植物保護, 2014, 40(2): 132-134.

[8] 孔祥超,李紅梅,耿甜,等.大豆種質(zhì)資源對大豆孢囊線蟲3號和4號生理小種的抗性鑒定[J].植物保護,2012,38(1):146-150.

[9] Zheng J, Zhang Y, Li X, et al. First report of the soybean cyst nematode,Heteroderaglycines, on soybean in Zhejiang, Eastern China [J]. Plant Disease, 2009, 93(3): 319.

[10] 阮維斌,王敬國,張福鎖. 根際微生態(tài)系統(tǒng)中的大豆孢囊線蟲[J].植物病理學(xué)報,2002,32(3):200-213.

[11] 程子超,趙洪海,李建立,等. 山東省寄生煙草的孢囊線蟲種類鑒定及種內(nèi)群體間rDNA-ITS-RFLP分析[J]. 植物病理學(xué)報, 2012,42(4):387-395.

[12] 陳金堂, 李知. 為害地黃的大豆孢囊線蟲的初步研究[J]. 植物病理學(xué)報, 1981, 11(1): 37-44.

[13] 張東升. 大豆胞囊線蟲侵染泡桐和豌豆的研究[J].植物病理學(xué)報, 1995,25(3): 275-278.

[14] 楊春杰, 陳佳琴, 朱星陶,等, 貴州大豆種質(zhì)資源的表型多樣性[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015, 43(10): 46-49.

[15] 朱星陶, 陳佳琴, 強興明,等. 貴州大豆生產(chǎn)現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)技術(shù)需求與對策[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(10): 208-213.

[16] 黃文坤, 葉文興,王高峰,等. 寧夏地區(qū)禾谷孢囊線蟲的發(fā)生與分布[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 30(1): 74-77.

[17] 王明祖, 彭德良, 武學(xué)勤. 小麥孢囊線蟲病的研究I.病原鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 1991, 10(4): 352-356.

[18] 亓?xí)岳? 彭德良, 彭煥,等. 基于SCAR 標(biāo)記的小麥禾谷孢囊線蟲快速分子檢測技術(shù)[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,45(21):4388-4395.

[19] Subbotin S A, Peng Deliang, Moens M.A rapid method for the identification of the soybean cyst nematodeHeteroderaglycinesusing duplex PCR [J].Nematology,2001,3(4):365-371.

[20] Davis E L, Tylka G L. Soybean cyst nematode disease [J]. The Plant Health Instructor.2000,DOI:10.1094/PHI-I-2000-0725-0.

[21] 孫玉秋, 許艷麗, 李春杰,等. 黑龍江省大豆胞囊線蟲種群分布和卵密度研究[J].大豆科學(xué), 2011, 30(2): 250-253.

[22] 劉海勤, 劉泉成, 趙洪海. 大豆孢囊線蟲大豆和煙草群體寄生性比較分析[J]. 植物保護, 2016, 42(2): 68-73.

[23] 許艷麗,王麗芳,戰(zhàn)麗莉.大豆胞囊線蟲病研究進展(續(xù)一)[J].大豆科技,2010(1):21-24.

[24] 周書其, 王振榮, 高同春,等. 大豆孢囊線蟲危害大豆損失率研究[J].植物病理學(xué)報, 1990, 20(2): 116.

[25] 車延平. 大豆孢囊線蟲的研究進展及其防治現(xiàn)狀[J]. 黑龍江科技信息, 2002(10): 25.

[26] Riggs R D, Schmitt D P.Complete characterization of the scheme forHeteroderaglycines[J]. Journal of Nematology, 1988, 20(3): 392-395.

(責(zé)任編輯： 楊明麗)

OccurrenceanddistributionofHeteroderaglycinesinGuizhouProvince

Long Haibo1, Chen Wen2, Pei Yueling1, Feng Tuizi1, Sun Yanfang1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonTropicalCrops,MinistryofAgriculture,EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou571101,China; 2.GuizhouInstituteofPlantProtection,Guiyang550006,China)

Soybean cyst nematode (Heteroderaglycines) is the most devastating and yield limiting pest of soybean in the world. A systematic survey ofH.glycinesin Guizhou Province was conducted during 2015-2016. A total of 287 soil samples were collected covering 14 counties from Guiyang, Liupanshui, Anshun, Bijie, Qianxinan and Zunyi. The results showed that the total incidence of soybean cyst nematode was 28.2%. Dafang and Hezhang showed the highest incidence of 46.7% and 45.0%, respectively. No cyst was found in Zunyi, Guiyang and Qianxinan. The highest cyst number existed in Shuicheng County, with the average density of 3.4 cysts per 200 g soil, and the max number of cysts was 17 per 200 g soil. The lowest cyst number existed in Zhenning and Guanling, with the average density of 0.3 and 0.2 cysts per 200 g soil, respectively, and both max number of cysts was only 2 per 200 g soil. Morphology of the cysts was the same as that forH.glycines, and the ITS sequence had 100% identity withH.glycinesGansu isolate in GenBank. Therefore, the cyst nematodes were identified asHeteroderaglycinesbased on morphological characteristics and ITS sequences.This result can provide a basis for effective prevention of soybean cyst nematode in Guizhou Province.

Guizhou Province;Heteroderaglycines; occurrence; distribution

2017-04-30

2017-05-28

國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503114)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(1630042017024)

* 通信作者 E-mail: longhb@catas.cn

S 435.651

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.06.030