孫曉強 王淑靜 羅春雄 侯本祥

營養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境對糞腸球菌侵入人工微管系統(tǒng)的影響

孫曉強 王淑靜 羅春雄 侯本祥

目的研究不同環(huán)境因素對糞腸球菌侵入人工微管系統(tǒng)能力的影響和微流芯片的適用性。方法采用軟光刻技術(shù)制作微流芯片，觀察細菌在牛腦心浸出液(BHI)、PBS和pH 10的情況下在微流芯片中的生長情況，測定和比較細菌在相應微管內(nèi)的最大侵入深度。結(jié)果糞腸球菌在營養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境下生長速度明顯下降，侵入小管徑微管的深度顯著下降(Plt;0.01)。結(jié)論營養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境可顯著降低糞腸球菌侵入微管系統(tǒng)的能力。微流芯片具有高通量、平行對比和可觀察性好等特點，有望為今后相關(guān)研究提供標準化的實驗平臺。

牙本質(zhì)小管； 糞腸球菌； 微流芯片； 持續(xù)性根尖周炎

糞腸球菌與根管治療失敗和持續(xù)性根尖周炎關(guān)系密切，在持續(xù)性根尖周炎患牙根管內(nèi)糞腸球菌的檢出率高達24%～77%[1-2]，被認為是導致根管治療失敗和持續(xù)性根尖周炎的主要致病菌。研究顯示糞腸球菌可侵入側(cè)、副根管、根管峽部以及根管側(cè)壁的牙本質(zhì)小管內(nèi)[3]，很難通過目前的器械預備和化學預備方法完全清除。同時，糞腸球菌還具有對惡劣生存環(huán)境極強的適應性，可耐受營養(yǎng)缺乏[4]和堿性環(huán)境[5]而在根管中長期生存。目前對糞腸球菌在壓力環(huán)境下對牙本質(zhì)小管等根管微結(jié)構(gòu)的侵入情況研究較少[6]。

本實驗利用基于牙本質(zhì)小管大小與結(jié)構(gòu)制作的微流芯片[7]，觀察糞腸球菌在這2 種壓力環(huán)境下對微管系統(tǒng)的侵入情況，探討不同壓力環(huán)境對糞腸球菌侵入微管能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

E.faecalis標準菌株ATCC29212；聚二甲基硅氧烷 (polydimethylsiloxane、PDMS)前聚體(GE Toshiba日本)；SU-8系列光膠及顯影液(MicroChem，美國)；牛腦心浸出液(BHI)(賽默飛世爾生物化學制品有限公司)；1×PBS 、10×PBS(上海百賽生物技術(shù)有限公司)；0.2 mol/L NaHCO3緩沖液、0.2 mol/L K2CO3緩沖液(分析純，北京化學制劑廠)； NIS軟件(Nikon，版本3.10)；尼康Ti-E全自動倒置熒光顯微鏡系統(tǒng)(尼康，日本)。

1.2 方法

1.2.1 不同環(huán)境培養(yǎng)基的配置 BHI培養(yǎng)基和1×PBS分別模擬營養(yǎng)豐富和營養(yǎng)缺乏狀態(tài)[8]；堿性環(huán)境由0.2 mol/L NaHCO3緩沖液和0.2 mol/L K2CO3緩沖液將BHI培養(yǎng)基調(diào)整為pH=10[9]，消毒后4 ℃冰箱保存，3 d內(nèi)使用。

1.2.2 細菌準備 將細菌置于37 ℃恒溫箱中活化2 h，將細菌懸液加入不同條件培養(yǎng)基中，菌密度調(diào)整為OD600=0.1。

1.2.3 微流芯片的制作與準備 根據(jù)牙本質(zhì)小管的特點和Sigusch等[10]的研究，采用標準的軟光刻技術(shù)設(shè)計和制作微流芯片。主要結(jié)構(gòu)包括中央孔(紫色)、緩沖區(qū)(桔紅色)和不同管徑和長度的微管系統(tǒng)(紅色)，1 塊微流芯片由4 個相同的單位構(gòu)成(圖 1)[7]，芯片預處理完成后，隨機將其中4 個相同單位分為空白對照組、BHI組、營養(yǎng)缺乏組(PBS)和堿性環(huán)境組(pH=10)。

圖 1 本實驗中使用的微流芯片示意圖

1.2.4 時序照片觀察點和時間點的設(shè)定 將芯片置于時序顯微鏡下，BHI組、營養(yǎng)缺乏組(PBS)和堿性環(huán)境組(pH=10)分別隨機選取每個直徑單元各10 個作為觀察單元。觀察點設(shè)定完畢后自中央孔加入菌液進行時序觀察。

1.2.5 觀察各組細菌的生長情況并測定各組細菌在微管內(nèi)最大平均侵入深度 使用Image J 軟件測定72 h各組各管徑20～30 個長度500 μm微管內(nèi)細菌侵入最大深度，計算平均最大侵入深度，分析不同環(huán)境對細菌侵入深度的影響。

1.3 統(tǒng)計學分析

SPSS 18.0軟件進行非參數(shù)檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 細菌在BHI培養(yǎng)基環(huán)境對微管系統(tǒng)的侵入情況

平行空白對照組72 h微管系統(tǒng)內(nèi)無細菌生長，培養(yǎng)液不渾濁。BHI組，細菌在腔室內(nèi)生長迅速，并維持較高密度(圖 2)。2 h細菌逐漸充滿腔室并接近微管口，在2 μm和3 μm管徑的微管中近腔室側(cè)細菌排列較為密集，向末端逐漸變得稀疏，呈間斷排列(圖 3)；在5 μm和10 μm管徑的微管中排列密集。72 h不同管徑500 μm長度微管內(nèi)細菌平均最大侵入深度分別為(339.3±63.6)、(389.6±35.3)、(487.8±11.3)、(500.0±0.0) μm(表 1)。

Tab 1 The depth of bacterial invasion in microtubes of different sizes at 72 h (μm, ±s)

注： ①與BHI組比較，Plt;0.01

2.2 營養(yǎng)缺乏環(huán)境對糞腸球菌在微管侵入的影響

在營養(yǎng)缺乏環(huán)境下，細菌在微流芯片內(nèi)的生長繁殖明顯減弱， 6～8 h逐漸由腔室接近微管系統(tǒng)(圖 2)。細菌對小管徑微管的侵入深度顯著下降(表 1)，72 h，腔室內(nèi)充滿細菌，但只有少量細菌進入微管系統(tǒng)。小管徑各微管間細菌侵入情況差異較大，微管內(nèi)細菌數(shù)量稀少，密集區(qū)域少見(圖 3)。

2.3 堿性環(huán)境(pH=10)對糞腸球菌在微管侵入的影響

細菌在pH=10的環(huán)境下生長明顯受到抑制，6～8 h開始侵入微管，細菌在腔室內(nèi)表現(xiàn)出特殊的存在狀態(tài)，多呈鏈狀或團塊狀存在，微管內(nèi)細菌數(shù)量較少(圖 2～3)，除10 μm管徑微管外，細菌侵入微管深度顯著下降(表 1)。

圖 2 微管系統(tǒng)腔室內(nèi)細菌在不同環(huán)境下的時序變化

圖 3 72 h細菌在3 種環(huán)境下在管徑2 μm微管內(nèi)的侵入情況

Fig 3 Images of the bacterial invasion in 2 μm ×2 μm microtubes under different conditions at 72 h

3 討 論

糞腸球菌導致持續(xù)性根尖周炎與其較強的環(huán)境適應能力密切相關(guān)。糞腸球菌在營養(yǎng)物質(zhì)缺乏狀態(tài)下可繼續(xù)生存，研究[3]顯示糞腸球菌可在根管治療后營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的根管內(nèi)生存12 個月之久。本實驗中采用了George等[8]實驗的方法，用1×PBS模擬營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的狀態(tài)。氫氧化鈣是目前根管治療中的最為常用消毒藥物[11]，糞腸球菌對其產(chǎn)生的堿性環(huán)境有很強的耐受能力[12]，可耐受的堿性極值達pH 11.1[5]。由于牙本質(zhì)的緩沖作用，根管內(nèi)氫氧化鈣產(chǎn)生的堿性環(huán)境pH值通常不會高于10[13]，因此本實驗采用Appelbe等[9]的方法，使用2 種緩沖鹽將BHI培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為10，模擬氫氧化鈣在根管內(nèi)所產(chǎn)生的堿性環(huán)境。

此前研究[6,8]發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)狀態(tài)可顯著影響糞腸球菌侵入牙本質(zhì)小管的能力，本研究顯示在營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，細菌侵入微管的深度和數(shù)量均顯著下降。與冉淑君等[14]的研究結(jié)果相似，在營養(yǎng)缺乏的環(huán)境下，糞腸球菌的生長速度明顯減慢，表現(xiàn)為細菌充盈腔室所需的時間明顯增加，密度明顯下降。細菌生長速度下降可能是導致細菌侵入微管深度下降的原因之一。一方面由細菌密度不同產(chǎn)生的梯度所導致的擴散作用減小，另一方面細菌在微管內(nèi)通過繁殖產(chǎn)生的主動侵入能力也下降。但本研究結(jié)果也顯示，在24 h后，細菌在腔室內(nèi)的密度逐漸增高，并沒有發(fā)生可由此產(chǎn)生的向微管內(nèi)明顯的擴散，在一些微管內(nèi)甚至沒有細菌的存在。推測可能有以下幾點原因：①管徑因素，隨著管徑的縮小，擴散作用明顯減弱，細菌不容易通過擴散進入小管徑微管[7,10]；②細菌在營養(yǎng)缺乏的狀態(tài)下可能更容易形成生物膜，生物膜結(jié)構(gòu)是細菌抵御外界不良環(huán)境的一種重要的方式。在Liu等[15]和劉紅艷等[16]實驗中就證實細菌在饑餓狀態(tài)下可產(chǎn)生生物膜。生物膜的存在可能使處于游離狀態(tài)的細菌減少，生物膜的形成還可能堵塞微管的入口，使后續(xù)的細菌難以進入微管系統(tǒng);③從本實驗的時序觀察可以看到，在營養(yǎng)缺乏狀態(tài)下，細菌即使進入腔室，但向微管內(nèi)遷移的能力很弱。此前的研究[7]顯示糞腸球菌可能通過隨機運動侵入微管，外界環(huán)境的改變可能使細菌外在蛋白的表達、所帶電荷等性狀發(fā)生改變，隨機運動的能力可能減弱，導致了細菌向微管內(nèi)侵入的能力下降。

本研究顯示在pH 10環(huán)境下，細菌不僅生長速度明顯下降，還表現(xiàn)出特殊的狀態(tài)，多呈鏈狀或團塊狀存在，這種變化隨著時間延長更加明顯，與在BHI和PBS中的形態(tài)存在顯著差異。Ran等[17]報道糞腸球菌在堿性環(huán)境下，細胞外形和胞質(zhì)均會出現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的改變，同時細菌的疏水性顯著提高。研究[6,9]還發(fā)現(xiàn)細菌在堿性環(huán)境下包括調(diào)控細胞分裂的多種基因的表達受到影響。以上這些因素可能是導致糞腸球菌在堿性環(huán)境下表現(xiàn)出特殊形態(tài)的原因。

在pH 9、10的條件下，細菌對牙本質(zhì)小管的侵入較正?？煞謩e下降50%和80%以上[6]。本研究結(jié)果也顯示，細菌在pH 10的堿性環(huán)境下對微管系統(tǒng)的侵入深度顯著下降。Ran等[6]認為堿性環(huán)境下細菌侵入能力的下降不能簡單歸因于細菌生長速度的下降，而可能與細菌在此環(huán)境下表現(xiàn)出的疏水性增加有關(guān)。有研究還觀察到糞腸球菌在堿性環(huán)境下更容易形成生物膜[5]，如前所述生物膜的形成也可能會妨礙細菌侵入牙本質(zhì)小管的深部。在本實驗中觀察到的細菌在堿性環(huán)境下的特殊存在方式也說明堿性環(huán)境造成細菌侵入能力下降可能是多方面因素的綜合結(jié)果。

本研究結(jié)果表明糞腸球菌在營養(yǎng)缺乏和堿性環(huán)境下，對微管系統(tǒng)尤其是小管徑微管的侵入深度和數(shù)量均顯著下降。這一方面可能與在這2 種環(huán)境下細菌生長受到抑制有關(guān)，更有可能是細菌在壓力環(huán)境下通過某些基因的調(diào)控來適應外界不良環(huán)境的表現(xiàn)。結(jié)果也表明該微流芯片具有制作精度高、高通量、平行對比和便于觀察等特點，適于對細菌在微小空間內(nèi)的生長做連續(xù)觀察，可為今后相關(guān)研究提供標準化的研究平臺。

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(收稿： 2016-08-18 修回： 2016-09-18)

TheeffectsofenvironmentalchangesonE.faecalisgrowthandpenetrationintomicrotubesinamicrofluidchip

SUNXiaoqiang1,WANGShujing2,LUOChunxiong2,HOUBenxiang1.

1.100050,DepartmentofEndodontics,SchoolofStomatologyCapitalMedicalUniversityBeijing,China; 2.StateKeyLaboratoryforArtificialMicrostructuresandMesoscopicPhysics,SchoolofPhysicsPekingUniversityBeijing

Objective: To evaluate the effects of different growth conditions onE.faecalisgrowth in the microfluid chip and the penetration ofE.faecalisinto microtubes.MethodsFour units on the chip were randomly selected as control, BHI, nutrient-Tdeprived(PBS) and pH 10 groups. The growth ofE.faecaliswas monitored by microscope for a period of 72 h after the suspension ofE.faecalishad been added into the chip.ResultsThe microscopic analysis showed a distinct variation in the growth rate and morphological feature under different experimental conditions. he depth of bacterial penetration was significantly greater in BHI group.ConclusionThis study demonstrated that environmental changes can significantly influence the growth and penetration ofE.faecalisinto the micro tubes.

Dentinaltubules;Enterococcusfaecalis;Microfluidics;Persistentapicalperiodontitis

國家自然科學基金(編號： 81170952, 11174012, 11434001)； 北京市醫(yī)院管理局臨床醫(yī)學發(fā)展專項經(jīng)費資助(編號： XMLX201301)

100050， 首都醫(yī)科大學附屬北京口腔醫(yī)院牙體牙髓科(孫曉強 侯本祥)； 北京大學定量生物學中心，前沿交叉學科研究院(王淑靜 羅春雄)

侯本祥 010-57099230 E-mail: houbenxiang@gmail.com

R780.2

A

10.3969/j.issn.1001-3733.2017.01.011