傅春燕++程雪　潘穎　陳述政　徐民

[摘要] 目的 研究中國漢族女性乳腺癌患者高遷移率族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）相關基因遺傳變異與無病生存期（DFS）和總生存期（OS）之間的關系。 方法 回顧性分析2010年5月～2015年10月期間我院收治的420例乳腺癌患者的臨床資料，分析8個基因的166個單核苷酸多態(tài)性（SNPs），并采用多變量Cox比例風險模型來估計SNPs的風險比和95%置信區(qū)間（CI），在多基因風險評分的累積水平評估SNPs對乳腺癌預后的影響。 結果 與DFS顯著相關的SNPs是MMP2基因的單核苷酸多態(tài)性，分別為rs243867位點（HR為1.28，95%CI為1.02～1.52，P<0.05）和rs243842位點（HR為1.25，95%CI為1.04～1.55，P<0.05）。而與OS相關的SNPs為MMP2基因的rs243842位點（HR為1.35，95%CI=1.01～1.74，P<0.05）、HMGB1基因的rs4145277位點（HR為1.31，95%CI=1.01～1.68，P<0.05）、TLR2基因的rs7656411位點（HR為0.78，95%CI，0.58～0.99，P<0.05）和TLR4基因的rs7045953位點（HR為0.51，95%CI=0.27～0.88，P<0.05）。DFS和OS患者的多基因風險評分結果顯示，其第三個三分位數(shù)風險比率分別為1.79（95%CI=1.29～2.41）和2.84（95%CI=1.84～4.51）。 結論 HMGB1相關基因的遺傳多態(tài)性與乳腺癌患者的預后有關。

[關鍵詞] 高遷移率族蛋白B1；乳腺癌；無病生存期；總生存期；基因多態(tài)性

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）29-0001-05

Effects of HMGB1-related gene polymorphisms on disease-free survival and overall survival in Chinese Han patients with breast cancer

FU Chunyan CHENG Xue PAN Ying CHEN Shuzheng XU Min

Department of Breast and Thyroid Surgery， Lishui Central Hospital in Zhejiang Province， Lishui 323000， China

[Abstract] Objective To study the relationship between genetic variation of high mobility group box 1 （HMGB1）-related genes and disease free survival（DFS） and total survival（OS） in Chinese Han women with breast cancer. Methods The clinical data of 420 patients with breast cancer who were admitted to our hospital from May 2010 to October 2015 were retrospectively analyzed. 166 single nucleotide polymorphisms（SNPs） of 8 genes were analyzed， and the multivariate Cox proportional hazards model was used to estimate the risk ratio of SNPs and 95% confidence interval（CI）. The effect of SNPs on the prognosis of breast cancer was assessed at the cumulative level of polygenic risk score. Results SNPs significantly associated with DFS were single nucleotide polymorphisms of the MMP2 gene， which were locus rs243867 （HR 1.28， 95%CI 1.02-1.52， P<0.05） and locus rs243842（HR 1.25， 95%CI 1.04-1.55， P<0.05）. SNPs associated with OS were locus rs243842 of the MMP2 gene（HR=1.35， 95%CI=1.01-1.74， P<0.05）， locus rs 4145277 of HMGB1 gene（HR=1.31， 95% CI=1.01-1.68， P<0.05）， locus rs7656411 of TLR2 gene （HR 0.78， 95%CI 0.58-0.99， P<0.05） and locus rs7045953 of the TLR4 gene（HR 0.51， 95%CI=0.27-0.88， P<0.05）. The results of polygenic risk score for DFS and OS patients showed a third tertile risk ratio was 1.79 （95%CI=1.29-2.41） and 2.84 （95%CI=1.84-4.51）. Conclusion The genetic polymorphism of HMGB1-related gene is related to the prognosis of breast cancer patients.endprint

[Key words] High mobility group box 1（HMGB1）； Breast cancer； Disease free survival； Total survival； Gene polymorphisms

乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率占女性所有癌癥的25.5%[1]。研究顯示，乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是由環(huán)境因素和遺傳因素所共同決定的，鑒定與乳腺癌發(fā)生和轉移相關的遺傳因素對于乳腺癌的治療具有非常重要的臨床意義[2]。HMGB1蛋白參與DNA翻譯和復制，其也在細胞凋亡和免疫應答中起重要作用[3-5]，因為可以作為晚期糖基化終產物（RAGE）[6]、各種Toll樣受體[7]（Toll-like receptors，TLR2，TLR4和TLR9）的配體以及骨髓細胞上表達的觸發(fā)受體1[8]。有Meta分析研究RAGE在不同類型癌癥風險的相關性，但是缺少對HMGB1 的研究[9，10]。最近有學者對中國漢族人群HMGB1/RAGE通路的研究表明，RAGE基因多態(tài)性與乳腺癌風險之間存在顯著的相關性[11]。然而，關于HMGB1及其相關基因對乳腺癌預后的影響的研究很少。隨著乳腺癌發(fā)病率的增加，研究HMGB1及其相關基因對乳腺癌預后的影響至關重要。本研究的主要目的是分析HMGB1及其相關基因單核苷酸多態(tài)性（SNPs）對乳腺癌預后的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2010年5月～2015年10月期間我院收治的420例乳腺癌患者的臨床資料，收集患者臨床資料，包括患者的年齡、學歷、絕經(jīng)期、絕經(jīng)年齡、生育史、子女數(shù)量、身體質量指數(shù)（BMI）、TNM分期、是否進行了化療、是否進行激素治療和放療、組織學分級、雌激素受體陽性和陰性、孕激素受體陽性和陰性以及乳腺癌家族史等。排除以下幾類患者：①臨床資料不全的乳腺癌患者（n=8）；②有乳腺癌或其他癌癥史（n=4）；③有其他良性乳腺疾病的患者（n=3）。對于生存分析，排除失訪的患者（n=15），本研究初次納入450例患者，排除不合格的患者后納入420例。

1.2 方法

無病生存期（DFS）的計算是從乳腺癌患者手術之日到復發(fā)日期，包括局部和遠處轉移、死亡或最后隨訪觀察日期?？傮w生存期（OS）是從診斷乳腺癌直到最后隨訪觀察日期或患者死亡日期。本研究中的420例患者中，有51例患者出現(xiàn)DFS事件，28例患者出現(xiàn)OS事件。

取受試者肘靜脈血5 mL后抽提基因組DNA并對HMGB1及其相關基因進行分型，將抽提的基因組DNA送至上海桑尼生物科技有限公司測序。參考有關文獻資料[12]，選擇HMGB1基因和其5個結合受體基因作為本研究的候選基因。此外，根據(jù)研究顯示，基質金屬蛋白酶2（MMP2）和MMP9在HMGB1/RAGE途徑中發(fā)揮了一定的作用[13，14]，因此也將其納入本研究，本研究中包含8個基因共160個SNP，序列范圍包含第一個轉錄位置上游的20 kb以及最后一個外顯子下游的20 kb，結合測序結果并結合有關文獻確定本研究中各SNP的具體位置[15]。

1.3 統(tǒng)計學分析

本研究中數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析采用SPSS20.0軟件，用對數(shù)秩檢驗和多因素Cox比例風險模型評估DFS和OS組的基線資料。對與DFS和OS兩者相關性顯著的因素進行多因素Cox比例風險模型的調整。采用Logistic回歸模型估計每個SNP的乳腺癌風險比（HR）和95%置信區(qū)間（CI）。在分析中使用了加性、共顯性和顯性模型。通過評估多基因風險評分，在累積水平評估SNP對乳腺癌預后的影響。多基因風險評分模型的建立參考Reeves GK等研究[16]。本研究的420例患者中，51例患者納入DFS模型分析，28例患者在OS模型分析中。經(jīng)多因素風險評分分類后，患者分為三分位數(shù)。通過使用多元Cox比例風險模型，基于第1個三分位數(shù)計算第2個三分位數(shù)和第3個三分位數(shù)的危險比（HR）和95%CI，其具有最低的多基因風險評分作為參考值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般病理特征

DFS組的隨時間的中位數(shù)為3.85年（2.91～4.94年），OS組的隨時間的中位數(shù)為3.91年（3.01～4.97年）。結果顯示，兩組中TNM分期、ER狀態(tài)、PR狀態(tài)、輔助化療、輔助激素治療、組織學分級與乳腺癌預后顯著相關，而年齡、教育水平、乳腺癌家族史、BMI、絕經(jīng)狀態(tài)、絕經(jīng)年齡、生育史、子女數(shù)量和輔助放療等與乳腺癌預后沒有相關性，見表1。

2.2 HMGB1相關基因中的單核苷酸多態(tài)性

在DFS患者中最重要的SNP為MMP2基因的單核苷酸多態(tài)性，其位點分別為rs243867（HR為1.28， 95%CI為1.02～1.52，P<0.05）和rs243842（HR為1.25， 95%CI為1.04～1.55，P<0.05）；而在OS組患者中最重要的SNP為MMP2基因的rs243842（HR為1.35，95%CI=1.01～1.74，P<0.05），HMGB1基因的rs4145277位點（HR為1.31，95%CI=1.01～1.68，P<0.05）及TLR2基因的rs7656411位點（HR為0.78，95%CI，0.58～0.99，P<0.05）和TLR4基因的rs7045953位點（HR為0.51， 95%CI=0.27～0.88，P<0.05）。另外，用共顯性模型評估SNP與乳腺癌預后的關系，結果顯示出與加性模型的趨勢一致，見表2、表3。

2.3 多基因評分與乳腺癌預后的關系

DFS事件組的多基因風險評分分析顯示，與第一個三分位數(shù)的參考值相比，第三個三分位數(shù)的風險比為1.79（95%CI=1.29～2.41）。在OS事件組中，與第一個三分位數(shù)的參考值相比，第三個三分位數(shù)的風險比為2.84（95%CI=1.84～4.51），見表4。endprint

3 討論

乳腺癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈年輕化趨勢。隨著研究的深入，對乳腺癌有了進一步的認識，目前認為乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展是有多因素共同作用的結果。本研究的結果表明，MMP2基因的SNP rs243842與DFS或OS患者的乳腺癌預后一致。在DFS患者中，MMP2基因rs243842位點和rs243867位點與乳腺癌預后差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），而在出現(xiàn)OS事件患者中，MMP2基因rs243842位點和HMGB1基因的rs4145277位點與乳腺癌預后差異顯著（P<0.05）。相比之下，TLR2基因中的rs7656411位點和TLR4基因中的rs7045953位點與出現(xiàn)OS事件的患者的良好預后相關性顯著（P<0.05）。此外，對HMGB1相關基因遺傳多態(tài)性的多基因風險評分模型分析的結果顯示，出現(xiàn)DFS和OS事件患者的危險比與相關風險等位基因的數(shù)目呈正比。

HMGB1蛋白是一種損傷相關的分子模式分子，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[17]。研究顯示[18]，HMGB1通過與三種重要受體[分別為晚期糖基化終產物（RAGE）和Toll樣受體TLR2和 TLR4]的相互作用來轉導其信號。HMGB1誘導巨噬細胞分泌腫瘤壞死因子α，激活NF-κB，這些作用通過加速細胞增殖和抑制細胞凋亡來促進腫瘤生長[19]。除HMGB1外，惡性間皮瘤細胞也表達高水平的TLR2和TLR4，這表明HMGB1/TLR通路可能影響腫瘤生長和轉移[18]。通過這些相關研究中關于HMGB1相關基因功能并結合本研究結果，推斷rs4145277位點HMGB1表達增加與乳腺癌預后較差有關。此外，rs7656411位點和rs7045953位點多態(tài)性可能降低與HMGB1結合的TLR2和TLR4的表達水平，從而抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力，與乳腺癌患者預后良好相關。

在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，基質金屬蛋白酶2（MMP2）也起著非常重要的作用，MMP2能夠降解乳腺癌中的基質，不僅能使基質的結構和生化特性發(fā)生改變，同時影響基質細胞的增生和分化。本研究結果顯示，MMP2基因中rs243842位點SNP在DFS組和OS組中與乳腺癌預后顯著相關，而rs243867僅與DFS組乳腺癌預后相關。有研究者對體內和體外模型進行研究時，結果顯示癌細胞中HMGB1/RAGE水平升高[12]。另外，阻斷RAGE后MMP2活性受到抑制，細胞外基質分子的分解明顯減少[13]。因此，HMGB1/RAGE復合物通過促進細胞侵襲作用促進癌細胞的生長和轉移。此外，有研究顯示人血清MMP2水平與乳腺癌預后相關[20]。由此可以看出，受到rs243842和rs243867等遺傳因素的影響導致MMP2被激活，使乳腺癌患者預后較差。然而本研究選擇的是基于高加索人群數(shù)據(jù)選擇的標記SNP，因為缺少針對我國漢族人群的相關SNP研究。但是，本研究將HMGB1和HMGB1相關基因納入研究，這兩個基因在癌癥的發(fā)生中起非常重要作用。另外，本研究的樣本量也較小，需要進一步進行大樣本量驗證。

綜上所述，HMGB1、TLR2、TLR4和MMP2基因與乳腺癌的預后有顯著相關性。

[參考文獻]

[1] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al. Global cancer statistics，2012[J]. CA Cancer J Clin，2015，65（47）：87-108.

[2] Li T，Mellothoms C，Brennan PC. Descriptive epidemiology of breast cancer in China：Incidence，mortality，survival and prevalence[J]. Breast Cancer Research & Treatment，2016，159（3）：395-404.

[3] Maurizio E，Wi■niewski JR，Ciani Y，et al. Translating proteomic into functional data：An high mobility group A1（HMGA1） proteomic signature has prognostic value in breast cancer[J]. Molecular & Cellular Proteomics Mcp，2016，15（1）：109-115.

[4] Eisenberg T，Carmona-Gutierrez D，Büttner S，et al. Necrosis in yeast[J]. Apoptosis An International Journal on Programmed Cell Death，2010，15（3）：257-268.

[5] van Beijnum JR，Buurman WA，Griffioen AW. Convergence and amplification of Toll-like receptor（TLR） and receptor for advanced glycation end products（RAGE）signaling pathways via high mobility group B1（HMGB1）[J].Angiogenesis，2008，11（4）：91-99.

[6] Kim SW，Lim CM，Kim JB，et al. Extracellular HMGB1 released by NMDA treatment confers neuronal apoptosis via RAGE-p38 MAPK/ERK signaling pathway[J]. Neurotoxicity Research，2011，20（2）：159-165.endprint

[7] Conti L，Lanzardo S，Arigoni M，et al. The noninflammatory role of high mobility group box 1/Toll-like receptor 2 axis in the self-renewal of mammary cancer stem cells[J].Faseb Journal Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology，2013，27（12）：4731-4736.

[8] Wu J，Li J，Salcedo R，et al.The proinflammatory myeloid cell receptor TREM-1 controls Kupffer cell activation and development of hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Research，2012，72（16）：3977-3986.

[9] Xia W，Xu Y，Mao Q，et al. Association of RAGE polymorphisms and cancer risk：A meta-analysis of 27 studies[J]. Medical Oncology，2015，32（2）：1-9.

[10] Zhao DC，Lu HW，Huang ZH. Association between the receptor for advanced glycation end products gene polymorphisms and cancer risk：A systematic review and meta-analysis[J]. Journal of B.u.on. Official Journal of the Balkan Union of Oncology，2015，20（2）：614-625.

[11] Yue L，Zhang Q，He L，et al. Genetic predisposition of six well-defined polymorphisms in HMGB1/RAGE pathway to breast cancer in a large Han Chinese population[J].Journal of Cellular & Molecular Medicine，2016，20（10）：1966-1971.

[12] Wang X，Xiang L，Li H，et al. The role of HMGB1 signaling pathway in the development and progression of hepatocellular carcinoma：A review[J]. International Journal of Molecular Sciences，2015，16（9）：22527-22540.

[13] Taguchi A，Blood DC，Del TG，et al. Blockade of RAGE-amphoterin signalling suppresses tumour growth and metastases[J]. Nature，2000，405（6784）：354-360.

[14] Kim HC，Lee JY，Sung H，et al. A genome-wide association study identifies a breast cancer risk variant in ERBB4 at 2q34：Results from the Seoul Breast Cancer Study[J]. Breast Cancer Res，2012，14（9）：R56-59.

[15] Kent WJ，Sugnet CW，F(xiàn)urey TS，et al. The human genome browser at UCSC[J]. Genome Res，2002，12（25）：996-1006.

[16] Reeves GK，Travis RJ，Bull D，et al. Incidence of breast cancer and its subtypes in relation to individual and multiple low-penetrance genetic susceptibility loci[J]. JAMA，2010，304（4）：426-431.

[17] Klune JR，Dhupar R，Cardinal J，et al. HMGB1：Endogenous danger signaling[J]. Molecular Medicine，2008，14（7-8）：476-480.

[18] Jube S，Rivera Z，Bianchi M，et al. Abstract 1557：High mobility group box 1 secretion supports tumor progression of human malignant mesothelioma[J]. Cancer Research，2012，72（8 Supplement）：1557.

[19] Yang H，Bocchetta M，Kroczynska B，et al. TNF-alpha inhibits asbestos-induced cytotoxicity via a NF-kappaB-dependent pathway，a possible mechanism for asbestos-induced oncogenesis[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006，103（27）：10397-10402.

[20] Song N，Sung H，Choi JY，et al. Preoperative serum levels of matrix metalloproteinase-2 （MMP-2） and survival of breast cancer among Korean women[J]. Cancer epidemiology，biomarkers & prevention：A publication of the American Association for Cancer Research，cosponsored by the American Society of Preventive Oncology，2012，21（8）：1371-1376.

（收稿日期：2017-07-18）endprint