林艷　陳志雄　蔡瑞云　趙麗芬

[摘要] 目的 研究感染性鮑曼不動桿菌碳青霉烯酶基因分布與耐藥相關(guān)性。 方法 回顧性分析鮑曼不動桿菌在2010年1月～2015年12月期間的藥物敏感性變遷，留取200株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌，檢測青霉烯酶與外排泵表型，并統(tǒng)計比較200株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌與200株碳青霉烯類敏感組的差異。 結(jié)果 2010年1月～2015年12月期間鮑曼不動桿菌耐藥嚴(yán)峻，碳青霉烯類鮑曼不動桿菌檢出率在35.8%～78.9%。其中在200株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌菌株中，檢出攜帶OXA-51基因108株，攜帶OXA-23基因46株，同時攜帶OXA-51和OXA-23 26株，其余碳青霉烯酶基因均未檢測到；外排泵表型在碳青霉烯類耐藥菌陽性株為175株，碳青霉烯類敏感株陽性株為115株，χ2檢驗碳青霉烯類敏感組的與耐藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=45.141，P=0.000）。結(jié)論 近六年鮑曼不動桿菌耐藥機(jī)制以O(shè)XA-51，OXA-23起主要作用，外排泵機(jī)制可能在碳青霉烯類耐藥機(jī)制起作用。

[關(guān)鍵詞] 鮑曼不動桿菌；碳青霉烯酶；耐藥性；耐藥機(jī)制

[中圖分類號] R446 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）29-0038-05

Study on the main drug resistance mechanism of carbapenems-resistant acinetobacter baumannii

LIN Yan1 CHEN Zhixiong2 CAI Ruiyun1 ZHAO Lifen3

1.Clinical Laboratory， Red Cross Hospital， Rui'an People's Hospital， Rui'an 325200， China； 2.Clinical Laboratory， Rui'an Disease Prevention and Control Center， Rui'an 325200， China； 3.Clinical Laboratory， Rui'an People's Hospital， Rui'an 325200， China

[Abstract] Objective To study the relationship between the distribution of carbapenemase gene and the drug resistance of infectious acinetobacter baumannii. Methods The drug sensitivity changes of acinetobacter baumannii from January 2010 to December 2015 were retrospectively analyzed. 200 strains of carbapenems-resistant acinetobacter baumannii were collected. Phenotype of carbapenemase and efflux pump was detected， and the differences of 200 carbapenems-resistant acinetobacter baumannii and 200 carbapenems-sensitive strains were compared. Results During the period from January 2010 to December 2015， acinetobacter baumannii was highly drug resistant. The detection rate of carbapenems-resistant acinetobacter baumannii was 35.8%-78.9%. Among the 200 strains of carbapenems-resistant acinetobacter baumannii， 108 strains carrying OXA-51 gene were detected， 46 strains carrying OXA-23 gene were detected， while 26 strains carrying both OXA-51 and OXA-23 were detected. Other carbapenemase genes were not detected； there was 175 strains of positive carbapenems-resistant strains with the efflux pump phenotype， and 115 strains of positive carbapenems-sensitive strains. Chi-square test showed that there was statistically significant difference between carbapenems-sensitive group and carbapenems-resistant group（χ2=45.141， P=0.000）. Conclusion The of drug resistance mechanism of acinetobacter baumannii in the past six years has played a major role in OXA-51 and OXA-23， and the efflux pump mechanism may play a role in the carbapenems drug resistance mechanism.endprint

[Key words] Acinetobacter baumannii； Carbapenemase； Drug resistance； Drug resistance mechanism

鮑曼不動桿菌是一類不發(fā)酵糖類、氧化酶陰性、無動力的革蘭陰性球桿菌，其廣泛存在于自然環(huán)境中，并可引起院內(nèi)嚴(yán)重感染。鮑曼不動桿菌耐藥嚴(yán)重，耐藥機(jī)制是其研究熱點。根據(jù)我們地區(qū)幾家醫(yī)院感染監(jiān)測報告顯示，鮑曼不動桿菌（包括鮑曼不動桿菌復(fù)合群）在非發(fā)酵菌中檢出率僅次于銅綠假單胞菌，耐藥情況嚴(yán)峻，在2015年對亞胺培南耐藥率達(dá)78.9%，給臨床治療帶來嚴(yán)峻考驗。本研究通過收集臨床2010～2015年間分離出來的鮑曼不動桿菌（包括鮑曼不動桿菌復(fù)合群），分析其院內(nèi)感染臨床分布特征與耐藥變遷及碳青霉烯酶產(chǎn)生情況，外排泵基因表達(dá)情況等耐藥機(jī)制研究，為臨床治療鮑曼不動桿菌（包括鮑曼不動桿菌復(fù)合群）引起的院內(nèi)復(fù)雜感染提供合理使用抗菌藥物，預(yù)防和控制耐藥菌株的流行提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

連續(xù)分離、非重復(fù)菌株共2800株鮑曼不動桿菌（2010年1月～2015年12月）患者的臨床標(biāo)本。藥敏試驗紙片擴(kuò)散法亞胺培南≤19 mm或美羅培南≤14 mm篩選為耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌為耐藥篩選為耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CR-AB），篩選200株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌（非重復(fù)分離株—即剔除同一患者同一部位）。其中質(zhì)控菌株為（ATCC27853）銅綠假單胞菌、（ATCC35218）大腸埃希菌、（ATCC 292133）金黃色葡萄球菌。

1.2 儀器與試劑

法國梅里埃VITEK鑒定系統(tǒng)：革蘭陰性菌鑒定卡（GNI）、革蘭陰性菌藥敏卡（GNS）；抗菌藥物紙片（英國OXOID，廣州迪景）；PCR擴(kuò)增儀5000型-試劑購自寶生物（大連）有限公司，由上海生工公司設(shè)計引物，凝膠成像系統(tǒng)（Biorad公司），QIAGEN凝膠回收試劑盒（New England Biolabs）。

1.3 藥物敏感試驗

統(tǒng)計鮑曼不動桿菌（2010年1月～2015年12月）在標(biāo)本類型（血液、尿液、痰液、分泌物等）分布情況、臨床科室（ICU、內(nèi)科、外科、急診等）分布、藥物敏感變遷情況。

1.4 主動外排泵表型檢測

即加入主動外排泵抑制劑羥基氰氯苯蹤（CCCP）后，美羅培南的最小抑菌濃度降低至少四倍以上為主動外排泵表現(xiàn)檢測陽性，分別檢測200株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌與200株碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌，并用χ2檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.5 碳青霉烯酶基因擴(kuò)增

細(xì)菌DNA模版[2]使用煮沸法粗制，PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中正反引物（P1、P2）各1 μL（工作濃度為20 μM）、DNA模板各5 μL，25 μL TaKaRa premix Taq酶（含Taq酶1.25 U/25 μL、2倍濃度dNTP 0.4 mM、2倍濃度PCR緩沖液），ddH2O 18 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程中各項參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃ 1 min、52℃ 1 min（退火溫度各個反應(yīng)略有不同）、72℃ 1 min共30個循環(huán)，最后72℃延伸5 min。正反引物序列見表1。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳，凝膠成像及PCR產(chǎn)物測序分析

取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1 μL loading buffer（含溴酚蘭），混勻，置于1%EB瓊脂糖凝膠，50 mA，在100 V電壓下電泳30 min，在紫外燈下觀察結(jié)果，并凝膠成像系統(tǒng)成像保存。選取DNA-Marker相應(yīng)位置條帶位置水平，即碳青霉烯酶基因陽性的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，送上海生工公司進(jìn)行核苷酸序列測定。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

對使用CCCP之后的碳青霉烯類耐藥組與碳青霉烯類敏感組，采用χ2檢驗統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)本類型分布與臨床科室分布

痰液標(biāo)本2518株，尿液79株，分泌物65株，血液56株，膿液38株，腹水5株，其他39株；ICU 2540株，呼吸內(nèi)科101株，骨科66株，神經(jīng)內(nèi)科73株，骨科40株，其他27株，感染科26株，共分離2800株鮑曼不動桿菌。

2.2 藥物敏感試驗結(jié)果

其中K-B法藥敏試驗篩選為耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌，共1965株。耐碳青霉烯類陽性率35.8%～78.9%。見表2。

2.3 主動外排泵表型檢測實驗結(jié)果

使用CCCP之后，200株碳青霉烯類耐藥組，CCCP抑制實驗共篩選出泵陽性菌株175株，200株碳青霉烯類敏感組，CCCP抑制實驗陽性株115株，經(jīng)χ2檢驗統(tǒng)計學(xué)分析，差異有顯著意義（χ2=45.141，P=0.000），提示主動外排泵的存在對碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制中起作用。見表3。

表3 CCCP對碳青霉烯類抗生素耐藥表型的影響[n（%）]

2.4 耐藥基因的PCR檢測及測序結(jié)果

在200株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌菌株中，檢出攜帶OXA-51基因108株，攜帶OXA-23基因46株，同時攜帶OXA-51和OXA-23 26株，其余碳青霉烯酶基因均未檢測到。見圖1、2。

3 討論

不動桿菌屬（Acinetobacte）分為7種，即鮑曼不動桿菌（A.baumanii）、魯氏不動桿菌（A.lwoffi）、醋酸鈣不動桿菌（A.calcoaceticus）、溶血不動桿菌（A.haemolytius）、約翰遜不動桿菌（A.johnsonii）、瓊氏不動桿菌（A.junii）和抗輻射不動桿菌。其中檢出率最高的為鮑曼不動桿菌。當(dāng)患者免疫功能受損或機(jī)體抵抗力下降時可引起肺部感染、泌尿系統(tǒng)感染、菌血癥、腹膜炎等各種感染，更是引起院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一[1]。endprint

鮑曼不動桿菌引起的院內(nèi)感染日益引起重視，多重耐藥鮑曼不動桿菌檢出率亦逐漸增多，甚至呈暴發(fā)流行的趨勢[2-3]，碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥鮑曼不動桿菌的臨床首選，起初對鮑曼不動桿菌敏感率接近100%[4]。但2014年中國CHINET耐藥性檢測顯示我國鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類抗生素的耐藥率已升至62.4%～66.7%[5]，給臨床治療和控制醫(yī)院內(nèi)感染提出了極大的挑戰(zhàn)。

本研究顯示，鮑曼不動桿菌（包括鮑曼不動桿菌復(fù)合群）在非發(fā)酵菌中檢出率僅次于銅綠假單胞菌，耐藥情況嚴(yán)峻，近六年對亞胺培南總體耐藥率為70.2%（1965/2800），碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌往往同時存在多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥[6-7]。鮑曼不動桿菌（包括鮑曼不動桿菌復(fù)合群）耐碳青霉烯類抗生素的主要耐藥機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯酶與外排泵系統(tǒng)過度表達(dá)[8-13]。其中碳青霉烯酶能破壞碳青霉烯類抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，水解范圍廣泛，包括所有青霉素類、頭孢菌素類、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑、碳青霉烯類等；主動外排泵的耐藥機(jī)制為[11-12]外排系統(tǒng)的過度表達(dá)，降低抗菌藥物在細(xì)菌體內(nèi)的藥物濃度，使其達(dá)不到殺菌或抑菌濃度。我們研究發(fā)現(xiàn)OXA-23與OXA-51基因型在本地區(qū)檢出率高，有流行特點。查閱文獻(xiàn)[15-18]鮑曼不動桿菌以D類酶（即OXA型碳青霉烯酶或苯唑西林酶）為主，分為4個亞型，由質(zhì)粒編碼（部分為染色體介導(dǎo)）。其中第一組為OXA-23組，主要包括OXA-23；第二組為OXA-24組，主要包括OXA-24、OXA-25、OXA-26；第三組OXA-51和第四組OXA-58。本研究以以O(shè)XA-51，OXA-23為主，與其他地區(qū)流行趨勢較吻合。對于主動外排泵機(jī)制，本研究使用表型檢測，顯示碳青霉烯類耐藥組與碳青霉烯類敏感組，檢驗統(tǒng)計學(xué)差異有顯著意義（χ2=45.141，P=0.000），提示主動外排泵機(jī)制在碳青霉烯類抗生素的耐藥機(jī)制中起作用。主動外排泵也是形成鮑曼不動桿菌多重耐藥的重要機(jī)制之一，可介導(dǎo)對氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥[19-22]。后續(xù)的實驗將進(jìn)一步的檢測外排泵的分子機(jī)制驗證，同時檢測更多的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌株進(jìn)行流行病學(xué)耐藥機(jī)制研究，以補(bǔ)充本實驗的不足。

碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的耐藥機(jī)制復(fù)雜，本文通過分析瑞安地區(qū)2010～2015年間分離出來的鮑曼不動桿菌，發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類耐藥嚴(yán)重，其主要分子流行以O(shè)XA-51、OXA-23為主，主動外排泵表型檢測顯示在臨床分離的耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌檢出率與碳青霉烯類敏感鮑曼不動桿菌有差異，提示外排泵介導(dǎo)外排泵在介導(dǎo)碳青霉烯類獲得性耐藥或碳青霉烯類耐藥中起作用。

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（收稿日期：2017-07-23）endprint