陳清法 韓發(fā)彬

Epha4基因通過FGF信號通路調(diào)節(jié)大腦皮層發(fā)育

陳清法 韓發(fā)彬

目的闡明Epha4基因在大腦皮層發(fā)育早期放射性膠質(zhì)細(xì)胞（RGCs）命運(yùn)決定中的功能。方法利用Cre-loxp技術(shù)分別在孕齡為11.5 d或13.5 d的小鼠皮層細(xì)胞中敲掉Epha4基因。根據(jù)小鼠的基因型分為3組：對照組、Nestin；Epha4fx/fx及GFAP；Epha4fx/fx，分別通過尼氏染色、免疫熒光共染色及免疫印跡分析了突變小鼠大腦皮層表現(xiàn)型、大腦皮層RGCs增殖和分化及皮層細(xì)胞信號通路。組間比較利用F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果尼氏染色結(jié)果表明，與正常新生小鼠皮層（709±30）μm相比，在孕齡11.5 dEpha4基因敲除新生小鼠大腦皮層厚度減少至（475±66）μm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.252，P＜0.05），而孕齡 13.5 dEpha4基因敲除新生小鼠大腦皮層厚度（727±37）μm，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。BrdU標(biāo)記及免疫熒光共染色結(jié)果表明，在孕齡14.5 d兩種突變小鼠中RGCs增殖能力減弱（46±1）﹪vsEpha4fx/fx（58 ± 2）﹪，t=10.72，P＜0.05 ；GFAP；Epha4fx/fx（50±2）﹪vsEpha4fx/fx（58±2）﹪，t=5.575，P＜0.05），而向神經(jīng)元分化能力增強(qiáng)（Nestin；Epha4fx/fx（34±5）﹪vsEpha4fx/fx（25±1）﹪，t=4.269，P＜0.05 ；GFAP；Epha4fx/fx（35±2）﹪vsEpha4fx/fx（25±1）﹪，t=12.48，P＜0.05。Western blotting分析表明分離的皮層細(xì)胞經(jīng)成纖維生長因子（FGFs）作用時ERK及FRS2α磷酸化減弱。結(jié)論Epha4基因決定大腦皮層發(fā)育早期RGCs的命運(yùn)，這一過程是通過FGFs信號通路完成的。這些發(fā)現(xiàn)為臨床治療脊髓損傷及阿爾茨海默癥等神經(jīng)疾病提供了理論依據(jù)。

大腦皮層； 膠質(zhì)細(xì)胞；Epha4； FGF； 信號通路； Cre-loxp

在大腦皮層發(fā)育過程中，放射性膠質(zhì)細(xì)胞（radial glial cells，RGCs）在室管膜區(qū)頂端擴(kuò)增并在胚胎發(fā)育早期分化產(chǎn)生神經(jīng)前體祖細(xì)胞（intermediate progenitor cells，IPCs），接著在胚胎發(fā)育晚期分化成各種類型的神經(jīng)元細(xì)胞，最先形成神經(jīng)元細(xì)胞位于皮層內(nèi)側(cè)，然后形成的神經(jīng)元跨過先形成的神經(jīng)元遷移到皮層板上，最終形成六層層狀結(jié)構(gòu)[1-2]。

成纖維生長因子（ fi broblastic growth factors，F(xiàn)GFs）通過磷酸化FRS2α及ERK促進(jìn)RGCs的增殖，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中起重要作用[3-4]，但是FGFs信號通路如何誘導(dǎo)RGCs到神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)換還未知。EphA4是Eph受體酪氨酸激酶家族的一員，可以被所有的ephrin-A配體和ephrin-B配體激活[5]。在成年小鼠皮層中EphA4促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化及遷移[6]，Epha4基因突變小鼠比野生小鼠具有較薄的皮層及減弱的皮層RGCs增殖能力[7]。但是，在皮層發(fā)育過程中Epha4基因在大腦皮層發(fā)育早期中的功能還不清楚，有待進(jìn)一步研究。

為了研究Epha4基因在大腦皮層發(fā)育早期中的功能，本文利用Cre-loxP技術(shù)構(gòu)建了兩種不同發(fā)育階段Epha4基因的條件性敲除小鼠。

材料與方法

一、材料

1.樣本來源：Epha4fx等位基因的小鼠、Nestin-Cre及hGFAP-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠購自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室。

2.主要試劑和儀器：DMEM培養(yǎng)基（美國Invitrogen公司）、青鏈霉素（美國Invitrogen公司）、胎牛血清（美國Invitrogen公司）、胰酶細(xì)胞消化液（美國Invitrogen公司）、細(xì)胞培養(yǎng)孵箱（美國Thermo公司）、CO2孵箱（美國Thermo公司）、熒光顯微鏡（日本 Keyence公司）、低速離心機(jī)（德國 eppendorf公司）、超凈工作臺（日本Airtech公司）。

二、方法

1.基因突變小鼠：靶向Epha4敲除是通過Cre介導(dǎo)的loxP包被的Epha4fx等位基因序列同源重組完成的。具體操作是將帶有Epha4fx等位基因的小鼠[8]與帶有Nestin-Cre[9]或hGFAP-Cre[10]轉(zhuǎn)基因小鼠交配，得到Epha4fx同源等位基因和由Nestin或GFAP啟動子調(diào)控的Cre小鼠（Nestin；Epha4fx/fx和GFAP；Epha4fx/fx）（圖 1）。帶有同源Epha4fx等位基因的小鼠用來作為對照。Nestin或GFAP啟動子特定介導(dǎo)Cre重組酶在背部端腦及大腦皮層的RGCs表達(dá)分別開始于孕齡11.5 d和孕齡13.5 d時期，導(dǎo)致Epha4等位基因在大多數(shù)RGCs及它們子代中通過同源重組被敲除。陰道栓剛鑒定到的早晨被認(rèn)定為孕齡0.5 d，陰道栓鑒定后的第19天被認(rèn)定為出生后0天（P0）。本研究嚴(yán)格按照國家衛(wèi)生部的實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)與使用指南進(jìn)行。所用動物手術(shù)都是通過麻醉進(jìn)行的，并盡可能避免動物疼痛。所有實(shí)驗(yàn)都按照聊城大學(xué)/聊城市人民醫(yī)院動物飼養(yǎng)與使用委員會規(guī)則進(jìn)行并得到批準(zhǔn)。

圖1 Cre-loxP方法獲得Epha4基因特異敲除小鼠

2.免疫熒光共染色、尼氏染色及定量分析：（1）免疫熒光共染色：分離的胚胎小鼠大腦通過4﹪多聚甲醛（PFA）在4℃固定過夜，石蠟包埋。6 μm厚的石蠟切片經(jīng)脫蠟、水解、在10 mmol/L檸檬酸鈉（pH值6.0）中121℃加熱1 min進(jìn)行抗原修復(fù)，然后使用標(biāo)準(zhǔn)染色方法進(jìn)行免疫熒光染色分析。具體操作是切片在含10﹪羊血清的Tris堿和Tween 20緩沖液（pH值8.0）室溫孵育30 min，然后在4 ℃孵育一抗過夜。本文中所使用的一抗有：兔抗人Class Ⅲ β-tubulin（TUBB3）（Cat.#MRB-435P，1:1000，Covance），兔 抗 人 Ki67抗體（Cat.#ab16667，1:200，Abcam），小鼠抗人 BrdU抗 體（Cat.#MI-11-3，1:1000，MBL）。PBS 洗 去 一抗，切片在連接有Alexa Flour 488及Alexa Flour 568（Molecular Probes）二抗室溫孵育1 h用于免疫熒光染色。經(jīng)PBS洗滌后復(fù)染DAPI（Molecular Probes），并用封固劑Gel/Mount（DAKO）封片。染色結(jié)果通過Keyence BZ-9000顯微鏡或Zeiss LSM5激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測。（2）尼氏染色：使用0.1﹪甲基藍(lán)溶液對10 μm厚的石蠟切片進(jìn)行染色[11]。染色結(jié)果通過Keyence BZ-9000顯微鏡檢測。（3）定量分析：P0皮層的厚度測量位點(diǎn)在連接pallial-subpallial VZ界線與半球間裂溝的皮層VZ dosalmost彎曲的中間線（圖2），增殖區(qū)的厚度也在相同位點(diǎn)測量。BrdU+細(xì)胞、BrdU+Ki67+細(xì)胞、BrdU+TUBB3+細(xì)胞數(shù)目在100～300 μm寬的矩形區(qū)域計算而來，該矩形區(qū)域的中線與pallialsubpallial VZ界線與背部VZ彎曲的中線對應(yīng)。

3. BrdU標(biāo)記：將BrdU通過皮內(nèi)注射入孕鼠，每千克體重注射50 mg BrdU。對于細(xì)胞循環(huán)逃逸分析，將孕齡13.5 d的母鼠注射入BrdU，然后免疫組化分析。石蠟切片經(jīng)1.5 mol/LHCl 37 ℃變性30 min，然后用0.1 mol/L硼酸鈉（pH值8.5）中和后進(jìn)行一抗孵育。每個基因型檢測至少5只小鼠。

4. Western blotting：經(jīng)端腦皮層分離而來的細(xì)胞經(jīng)機(jī)械法分離，并在含有0.6﹪葡萄糖、25 mmol/L HEPES、1﹪青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中37 ℃含5﹪ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。細(xì)胞懸液分到兩管，一管對照，另一管經(jīng)FGF2處理20 min。FGF2處理細(xì)胞及對照細(xì)胞在裂解液中裂解。15～50 μg上樣量的蛋白經(jīng) SDS-PAGE 電泳分離并在PVDF膜上雜交（Millipore，Billerica，MA，USA）。經(jīng) Immobilon Western Blotting 檢測系統(tǒng)（Millipore）檢測。用于western blotting的抗體有兔抗人 EphA4多克隆抗體（Cat. #sc-921；1:2000，Santa Cruz），兔 抗 人 FRS2α 多 克 隆 抗 體（Cat.#sc-8318 ；1:1000，Santa Cruz），兔抗人 GAPDH 多克 隆 抗 體（Cat. #sc-25778，1:3000，Santa Cruz），兔抗人有絲分裂活化蛋白激酶（MAPK）（ERK）（Thr202/Tyr204）多克隆抗體（Cat.#9101；1:4000，Cell Signaling Tech），兔抗人 MAPK（ERK）多克隆 抗 體（Cat. #9102 ；1:4000，Cell Signaling Tech），及兔抗人 pFRS2α（Y196）（Cat. #3861；1:1000，Cell Signaling Tech）。蛋白灰度通過CS 分子軟件版本3.0（日本ATTO公司）進(jìn)行定量。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

使用GraphPad Prism6軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，皮層厚度、增殖區(qū)（VZ+SVZ）厚度、Ki67+BrdU+細(xì)胞占總BrdU+細(xì)胞的比例及Tuj1+BrdU+細(xì)胞占總BrdU+細(xì)胞的比例平均值以± s表示。組間比較采用F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 Epha4基因敲除小鼠冠狀腦切片甲基藍(lán)染色及定量分析

結(jié) 果

一、Epha4基因敲除對皮層大小影響呈現(xiàn)階段依賴性

為了研究Epha4基因在皮層發(fā)育過程時間調(diào)控性，分別在深層皮層形成起始階段或表層皮層形成起始階段在RGCs中敲掉Epha4。免疫印跡結(jié)果表明Epha4等位基因在大多數(shù)RGCs及它們子代中通過同源重組分別在孕齡11.5 d時期（圖3a）和孕齡13.5 d時期（圖3b）被敲除。

圖3 Western blotting檢測Epha4基因在Nestin;Epha4（fx/fx）及GFAP;Epha4（fx/fx）突變小鼠中的表達(dá)

腦切片的尼氏染色表明Nestin；Epha4fx/fx小鼠大腦皮層在P0時期具有正常的大體層狀結(jié)構(gòu)（圖2）。GFAP；Epha4fx/fx小鼠也有正常的整體皮層結(jié)構(gòu)。Nestin；Epha4fx/fx小鼠大腦半球的大小與同籠對照小鼠相比略微減小，并且整個大腦皮層的放射狀厚度減小。另外，皮層增殖區(qū)域的VZ及SVZ的厚度在皮層前部區(qū)域減?。ū?）。通過比較Nestin；Epha4fx/fx和GFAP；Epha4fx/fx間的早期大腦皮層RGCs的命運(yùn)決定，進(jìn)一步對Epha4基因缺失在大腦皮層發(fā)育過程中的生物學(xué)功能進(jìn)行研究。

表1 突變小鼠同正常小鼠皮層厚度及VZ+SVZ厚度比較（μm，± s）

表1 突變小鼠同正常小鼠皮層厚度及VZ+SVZ厚度比較（μm，± s）

注 ：與對照組比較，aP＜0.05 ；與 Nestin ；Epha4（fx/fx）比較，bP＜0.05

組別 動物數(shù) 皮層厚度 VZ+SVZ厚度對照組 5 709±30 65± 4 Nestin ；Epha4（fx/fx） 5 475±66a 39±13a GFAP ；Epha4（fx/fx） 5 727±37b 63± 8b F值 44.75 12.61 P值 ＜0.01 ＜0.01

二、Epha4基因在RGCs命運(yùn)決定中的作用

為了尋找直接的證據(jù)證明Epha4缺失在大腦皮層發(fā)育過程中的作用，對RGCs向細(xì)胞分裂的細(xì)胞數(shù)及向神經(jīng)元轉(zhuǎn)變的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行了定量檢測。有絲分裂活性前體細(xì)胞在孕齡13.5 d時期用BrdU標(biāo)記，24 h后有絲分裂細(xì)胞群體的命運(yùn)通過共染色法進(jìn)行分析。進(jìn)入分裂前體細(xì)胞中的BrdU與分裂細(xì)胞蛋白標(biāo)記物Ki67或者與神經(jīng)元的標(biāo)記物Tuj1結(jié)合，確定細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期或逃逸細(xì)胞周期的數(shù)目。與對照小鼠相比，發(fā)現(xiàn)在突變小鼠中Ki67+BrdU+細(xì)胞在總BrdU+細(xì)胞中的比例明顯降低（圖 4a～c,表 2），相反 Tuj1+BrdU+ 細(xì)胞在總體BrdU+ 細(xì)胞中比例增加（圖 4d～f，表 2）。

表2 突變小鼠同正常小鼠皮層RGCs和IPCs的增殖和分化比較（﹪，± s）

表2 突變小鼠同正常小鼠皮層RGCs和IPCs的增殖和分化比較（﹪，± s）

注 ：與對照組比較，aP＜0.05 ；與 Nestin ；Epha4（fx/fx）比較，bP＜0.05

Tuj1+BrdU+細(xì)胞占總BrdU+細(xì)胞的比例對照組 5 58±2 25±1組別 動物數(shù)Ki67+BrdU+細(xì)胞占總BrdU+細(xì)胞的比例Nestin；Epha4（fx/fx） 5 46±1a 34±5a GFAP；Epha4（fx/fx） 5 50±2ab 35±2a F值 62.22 15.17 P值 ＜0.01 ＜0.01

三、Epha4基因通過調(diào)控FGFs信號通路調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)發(fā)育

為了檢測Epha4基因是否影響皮層FGFs信號傳導(dǎo)通路。通過Western blotting對Epha4突變小鼠及對照小鼠FGF2刺激下FGFs信號通路下游分子磷酸化進(jìn)行檢測（圖5）。結(jié)果表明，在對照小鼠中經(jīng)FGF2刺激后FRS2α及ERK1/2都被磷酸化，而在突變小鼠中這些蛋白的活化程度明顯弱于對照小鼠。

討 論

在大腦皮層發(fā)育過程中，RGCs不僅通過對稱分裂自身增殖還可以通過非對稱分裂產(chǎn)生IPCs及進(jìn)一步向神經(jīng)元分化[1-2]。在孕齡14.5 d時期出現(xiàn)神經(jīng)分化的高峰[12]。本研究通過Cre-loxp技術(shù)構(gòu)建了兩種Epha4缺失突變小鼠。Epha4基因分別在Nestin；Epha4fx/fx的孕齡11.5 d時期[9]，GFAP；Epha4fx/fx的 孕 齡 13.5 d時 期[10]被 敲 除（圖 1）。Epha4基因作用于決定RGCs的命運(yùn)。

圖4 Epha4基因敲除小鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞或神經(jīng)前體祖細(xì)胞的增殖和分化

圖5 Epha4基因敲除小鼠皮層細(xì)胞經(jīng)FGF2刺激ERK1/2及FRS2α磷酸化

Nestin；Epha4fx/fx小鼠大腦半球的大小與同籠對照小鼠相比略微減小，并且整個大腦皮層的放射狀厚度明顯減小。另外，皮層增殖區(qū)域的VZ及SVZ的厚度在皮層前部區(qū)域明顯減小（表1）。然而，與Nestin；Epha4fx/fx小鼠不同，GFAP；Epha4fx/fx小鼠皮層或增殖區(qū)域的放射狀厚度與對照同籠小鼠比較沒有明顯區(qū)別，說明Epha4基因缺失影響皮層大小發(fā)生于孕齡11.5 d時期。與對照小鼠相比，發(fā)現(xiàn)在突變小鼠中 Ki67+BrdU+細(xì)胞在總BrdU+細(xì)胞中的比例明顯降低，表明RGCs的分裂能力在兩種突變小鼠中都減弱。與之相對應(yīng)的是Tuj1+BrdU+細(xì)胞在總體BrdU+細(xì)胞中比例增加，表明突變小鼠中RGCs向神經(jīng)元轉(zhuǎn)變能力增強(qiáng)（表2）。

前面報道了EphA4蛋白與FGFR蛋白在體外通過直接作用相互磷酸化，通過FRS2α的酪氨酸磷酸化及活化ERK增強(qiáng)了FGFs信號通路[13-14]。在這篇報道中發(fā)現(xiàn)在孕齡15.5 d時期兩種Epha4突變小鼠中分離的皮層細(xì)胞經(jīng)FGF2刺激時FRS2α及ERK1/2活性比正常小鼠弱，表明FGFs在Epha4缺失的皮層細(xì)胞中活化能力降低。在孕齡10 d或孕齡13.5 d胎鼠皮層中共同敲除FGFR1、FGFR2及FGFR3，F(xiàn)GFs信號缺失引起的皮層表現(xiàn)型與Epha4突變小鼠的表現(xiàn)型相似[3]，推測Epha4基因在RGCs命運(yùn)決定中的作用是由FGFs信號介導(dǎo)的。

總之，本研究表明Epha4基因在胚胎大腦皮層發(fā)育過程中通過FGFs信號通路調(diào)節(jié)RGCs命運(yùn)決定中起重要作用。Epha4基因表達(dá)影響P0時期皮層大小的的關(guān)鍵時期發(fā)生在孕齡13.5 d之前，孕齡13.5 d之后Epha4基因缺失也會瞬間影響皮層神經(jīng)發(fā)育。然而，即使在孕齡10.5 d時期之后Epha4基因表達(dá)缺失也不會影響總體的大腦皮層層狀結(jié)構(gòu)。本研究為研究階段特異性神經(jīng)元的發(fā)育及將來臨床治療神經(jīng)退行性疾病如脊髓損傷、阿爾茲海默癥等提供了有力的理論依據(jù)。

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2016-09-24）

（本文編輯：陳媛媛）

陳清法，韓發(fā)彬.Epha4基因通過FGF信號通路調(diào)節(jié)大腦皮層發(fā)育[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（5）：259-264.

Epha4 gene regulates corticogenesis through FGF signaling

Chen Qingfa, Han Fabin. Institute ofTissue Engineering and Regenerative Medicine, The Liaocheng People's Hospital, Liaocheng 252000,China

Han Fabin, Email:fhan2013@126.com

ObjectiveTo illuminate the function ofEpha4gene in RGC cell fate determination during early corticogenesis.MethodsEpha4gene was deleted in cortical cells at E11.5 or E13.5 using Cre-loxp method. The mice were divided into 3 groups: Group A (control mice),Group B (Nestin；Epha4fx/fxmutant mice) and Group C (GFAP；Epha4fx/fxmutant mice). Nissle staining was used to analyze the morphological changes of the mutant mice. Co-immunofluoresence was used to determine the proliferation and differentiation of RGC. Western blotting was used to detect the signaling pathway in the mutant mice. And the statistical analysis was achieved using Student'st-test.ResultsNissle stainingshowed the size of the cerebral cortex at P0 was smaller than that of controls whenEpha4was deleted at E11.5 (475±66 μmvs709±30 μm,P＜0.05) but not when it was deleted at E13.5 (727±37 μmvs709±30 μm,P＞0.05). BrdU labeling followed by co-immunofluoresence showed the proliferation ability of RGC decreased (Nestin；Epha4fx/fx46±1﹪vsEpha4fx/fx58±2﹪,P＜0.05;GFAP;Epha4fx/fx50±2﹪vsEpha4fx/fx58±2﹪,P＜0.05), while the differentiation ability of RGC increased (Nestin；Epha4fx/fx34±5﹪vsEpha4fx/fx25±1 ﹪ ,P＜0.05;GFAP;Epha4fx/fx35±2 ﹪vsEpha4fx/fx25±1 ﹪ ,P＜0.05). Western blotting showed cortical cells from both deletion mutants revealed lower phosphorylation of ERK and FRS2α in the presence of FGF.ConclusionEpha4gene, in cooperation with an FGF signal, contributes to function in RGC cell fate determination during early corticogenesis. These findings provide important molecular evidence for the clinical treatment of neurodegenerative diseases such as spinal cord injury and Alzheimer disease.

Cerebral cortex; Glial cells;Epha4; FGF; Signal pathway; Cre-loxp

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.05.002

252000 聊城市人民醫(yī)院組織工程與再生醫(yī)學(xué)研究所

韓發(fā)彬，Email：fhan2013@126.com