馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠體重及免疫功能的影響

何玉華 ， 秦貴信 ， 白明昧

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 左家 132109 ；3.吉林省長春市雙陽區(qū)奢嶺街道辦事處畜牧獸醫(yī)站 ， 吉林 長春 130607)

馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠體重及免疫功能的影響

何玉華1,2， 秦貴信1， 白明昧3

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 吉林 長春 130118 ； 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 吉林 左家 132109 ；3.吉林省長春市雙陽區(qū)奢嶺街道辦事處畜牧獸醫(yī)站 ， 吉林 長春 130607)

為了更好的了解馬鈴薯糖苷生物堿的毒性作用，對馬鈴薯的皮和芽進(jìn)行提取，利用其提取的α-茄堿、 α-卡茄堿的混合物對小鼠進(jìn)行灌胃。觀測提取物對小鼠體重、死亡率、免疫器官指數(shù)、血清免疫球蛋白的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，馬鈴薯糖苷生物堿中的α-茄堿(α-solanine)和 α-卡茄堿(α-chaconine)對小鼠有一定的毒性作用，能夠抑制小鼠體重的增長，不同濃度的馬鈴薯糖苷生物堿使小鼠免疫器官指數(shù)降低，IgA,IgM含量升高，300 mg/kg體重馬鈴薯糖苷生物堿呈現(xiàn)的對生長的抑制和對免疫功能的毒性最大，與對照組相比差異顯著(Plt;0.05)，并對小鼠有致死作用。

糖苷生物堿 ； 小鼠 ； 體重 ； 免疫功能

我國將啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，預(yù)計(jì)2020年50%以上的馬鈴薯將作為主糧消費(fèi)，馬鈴薯或成第四主糧[1]，馬鈴薯淀粉渣、馬鈴薯莖、葉等副產(chǎn)品作為飼料的開發(fā)也將會(huì)成為非常規(guī)飼料開發(fā)的一項(xiàng)重要研究內(nèi)容。然而，這些馬鈴薯副產(chǎn)品可能含一些有毒物質(zhì)。

Banp[1]等在19世紀(jì)初首次發(fā)現(xiàn)了馬鈴薯中含有生物堿。主要是以茄啶為糖苷配基構(gòu)成的茄堿和卡茄堿，共計(jì)6種：β-茄堿和γ-茄堿是α-茄堿三糖的部分水解產(chǎn)物；β-卡茄堿和 γ-卡茄堿是α-卡茄堿三糖的部分水解產(chǎn)物[2]。馬鈴薯在生產(chǎn)、儲(chǔ)運(yùn)和加工過程中以及受到機(jī)械或化學(xué)損傷、光照及物理損傷后，會(huì)導(dǎo)致糖苷生物堿的迅速合成、累積。有關(guān)資料報(bào)道，馬鈴薯淀粉渣中α-solanine、α-chaconine總含量為0.047 4 mg/100g[3]。α-茄堿(α-solanine)和 α-卡茄堿(α-chaconine)是馬鈴薯糖苷生物堿的主要形式，含量占馬鈴薯總糖苷生物堿的95%，比例取決于品種類型或馬鈴薯解剖部位，一般比例為1∶2 到1∶7。一般成熟的馬鈴薯中糖苷生物堿含量1～10 mg/100 g，最高不超過20 mg/100 g，發(fā)芽或變綠時(shí)含量大大增加，可達(dá)500 mg/100 g，如果超過安全標(biāo)準(zhǔn)，容易引起中毒發(fā)生[4]。所以本試驗(yàn)將馬鈴薯皮、芽中粗提的糖苷生物堿α-茄堿、α-卡茄堿的混合物對小鼠進(jìn)行灌胃，觀測其對小鼠的體重、死亡率、免疫器官指數(shù)、血清免疫球蛋白的影響，探討馬鈴薯糖苷生物堿對小鼠的毒性作用，研究馬鈴薯皮、芽提取物的灌胃劑量與毒性之間的關(guān)系，為馬鈴薯及其副產(chǎn)品作為飼料的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品的制備 取發(fā)芽的馬鈴薯數(shù)個(gè)，把馬鈴薯削皮(2～3 mm)，之后收集皮、芽的新鮮樣品。稱取40 g馬鈴薯皮、芽的新鮮混合樣品，置于500 mL 的圓底燒瓶中，加入乙醇-乙酸混合液(體積比為100∶30)，在磁力攪拌器中攪拌15 min，過濾。收集濾液、樣品將其放入索氏脂肪抽提器中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度至60 ℃～65 ℃，抽提16 h，將濾液減壓旋轉(zhuǎn)回收至浸膏狀，用5%硫酸將殘留物溶解、過濾。濾液中加入濃氨水調(diào)節(jié)pH 值為10～11，冷凍、離心。沉淀用1%濃度的氨水進(jìn)行洗滌，直到洗滌液澄清，取沉淀進(jìn)行干燥，即得到馬鈴薯糖苷生物堿粗提品。馬鈴薯糖苷生物堿的粗提品中含有α-茄堿和 α-卡茄堿等其他的糖苷生物堿。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 4周齡清潔級(jí)雄性小鼠48只，體重(20±2) g，由吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。在室溫條件下常規(guī)飼養(yǎng)1周，適應(yīng)環(huán)境，用于試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)儀器 TGL-18B-C臺(tái)式高速離心機(jī)(常州萬合儀器廠) ；FA1004N 電子分析天平(上海平軒科學(xué)儀器有限公司)；ACB-4A1超凈工作臺(tái)(藝思高科技有限公司)；小鼠灌胃裝置、手術(shù)剪、手術(shù)刀、2 mL注射器等動(dòng)物解剖器械。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將48只4周齡雄性小鼠隨機(jī)分為5組，每組12 只，其中A組為對照組，飼喂基礎(chǔ)日糧。 B、C、D、E為試驗(yàn)組，(37.5 mg/kg體重·d 組、75 mg/kg體重·d組、150 mg/kg體重·d組、300 mg/kg體重·d組)。

1.4.2 血液采集和組織樣本采樣 (1)于21 日清晨，首先對所有小鼠稱重，每組取4只小鼠眼球釆血，采取的血液，室溫放置4 h后，放入4 ℃冰箱過夜，第2天2 000 r/min離心10 min，吸取上清液，于-20 ℃保存;(2)采用頸椎脫臼的方法將小鼠處死后，將試驗(yàn)組和對照組小鼠分別進(jìn)行剖檢，打開腹腔，取出肝臟、脾臟、胸腺，剝除脂肪組織和結(jié)締組織，稱量其重量；(3)迅速釆取肝臟、腎臟和脾臟進(jìn)行稱重，取脾臟、胸腺放于存有生理鹽水的平皿中，洗凈后用濾紙吸干，剔除結(jié)締組織和脂肪后稱濕重，分別計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.4.3 測定指標(biāo)及方法

(1)體重測量：每隔7 d早晨8時(shí)飼喂前對小鼠進(jìn)行稱重，共稱量3周，把小鼠放在燒杯中進(jìn)行稱量，并記錄重量，精確到0.01。

(2)器官指數(shù)：肝臟指數(shù)(mg/g)=肝臟重/體重；脾臟指數(shù)(mg/g)=脾臟重/體重；胸腺指數(shù)(mg/g)=胸腺重/體重。

(3)血清免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM的測定。采用IgG、IgA、IgM試劑盒(免疫比濁法)，購自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SAS8.1統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，兩組間比較用t檢驗(yàn)，各組間比較用ANOVA方法。試驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，采用 SPSS20.0 軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠體重的影響 從表1可知，灌注馬鈴薯糖苷生物堿粗提品，試驗(yàn)第1周，各組小鼠體重雖然均呈上升趨勢，各組之間差異均不顯著(Pgt;0.05)，但是隨著灌注劑量的增加，增重率降低；第2周開始，A組、B組、C組體重呈上升趨勢，D組、E組體重下降，D組、E組與A組、B組、C組相比差異顯著(Plt;0.05)；第3周，A組、B組、體重呈上升趨勢，C組、D組、E組體重下降，D組、E組與A組、B組、C組相比差異顯著(Plt;0.05)，試驗(yàn)結(jié)束后D組體重降低3.1%、E組降低7%。

2.2 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠免疫器官指數(shù)的影響 從表2可知，灌注馬鈴薯糖苷生物堿粗提品后，胸腺指數(shù)降低，D組、E組與A組、B組、C組相比差異顯著(Plt;0.05)；脾臟指數(shù)降低，C組、D組、E組與A組、B組、C組相比差異顯著(Plt;0.05)；肝臟指數(shù)降低，C組、D組、E組與A組、B組相比差異顯著(Plt;0.05)。

2.3 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠血清免疫球蛋白的影響 從表3可知，灌注馬鈴薯糖苷生物堿粗提品后血清中的IgG含量先升高后降低，各組之間差異不顯著(Pgt;0.05)，D組中IgG 含量最高；IgA、IgM均升高，C組、D組、E組與A組、B組相比差異顯著(Plt;0.05)，E組的IgA、IgM含量最高。

表1 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠體重的影響

注：同行數(shù)據(jù)中，肩標(biāo)有相同字母表示差異不顯著(Pgt;0.05)，肩標(biāo)字母完全不同表示差異顯著(Plt;0.05)，下表同

表2 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠免疫器官指數(shù)的影響 (mg/g)

表3 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠血清免疫球蛋白的影響 (g/L)

3 討論

3.1 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠生長性能的影響 本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，隨著添加劑量的升高，D組、E組小鼠的體重下降，D組、E組與A組、B組、C組相比差異顯著(Plt;0.05)，試驗(yàn)結(jié)束后D組體重降低3.1%、E組降低7%。季宇彬[4]的研究表明，把茄堿通過給小鼠灌胃后得出，低劑量組(177 mg/kg體重、236 mg/kg體重)沒有死亡現(xiàn)象，隨劑量的增加(315 mg/kg體重、420 mg/kg體重、560 mg/kg體重)時(shí)，小鼠死亡數(shù)量增加，高劑量(747 mg/kg體重)3 d之內(nèi)全部死亡。試驗(yàn)過程當(dāng)中發(fā)現(xiàn)未死亡的小鼠有輕度的胃腸炎的癥狀，食欲下降，出現(xiàn)便秘、嘔吐、流涎等現(xiàn)象。而死亡小鼠呈現(xiàn)頭部腫脹、體溫升高、腹瀉、便血等癥狀。在一定程度上說明馬鈴薯皮中的α-茄堿(α-solanine)和 α-卡茄堿(α-chaconine)對小鼠生長發(fā)育有一定的影響[5]。

Baker等[6]使用強(qiáng)飼法將馬鈴薯芽的生物堿提取物作用于倉鼠，試驗(yàn)結(jié)果表明，馬鈴薯芽的生物堿提取物對胃腸道有一定的毒性作用，出現(xiàn)胃脹、十二指腸潰瘍、小腸出血、壞死 。

生物堿還能夠干擾Na+和Ca2+跨細(xì)胞膜的運(yùn)輸。Michalska 等[7]研究表明，α-茄堿能夠抑制大鼠十二指腸上皮細(xì)胞細(xì)胞膜上Ca2+的運(yùn)輸, 而α-卡茄堿則對于Na+的主動(dòng)運(yùn)輸則起到明顯的抑制效果，且抑制的作用強(qiáng)于α-茄堿。因此，胃腸道脹氣很可能因?yàn)樯飰A對離子通道的影響進(jìn)而影響到細(xì)胞內(nèi)外的離子平衡所致。

3.2 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠免疫器官指數(shù)的影響 本試驗(yàn)中，灌注馬鈴薯糖苷生物堿粗提品后，胸腺指數(shù)、脾臟、肝臟指數(shù)降低，C組、D組、E組與A組、B組相比差異顯著(Plt;0.05)?？娠@著降低體液免疫和細(xì)胞免疫的免疫反應(yīng)活性，降低機(jī)體抵抗能力。 其主要原因有以下兩個(gè)方面：(1)馬鈴薯糖苷生物堿粗提品中的α-茄堿和 α-卡茄堿本身能夠降低免疫功能；(2) 也有可能是α-茄堿和 α-卡茄堿通過抑制腸道中有益微生物的增值，進(jìn)而抑制其有益代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生而降低免疫功能。

內(nèi)臟器官指數(shù)通常是毒理學(xué)試驗(yàn)過程中，反應(yīng)藥物對動(dòng)物內(nèi)臟損害程度的靈敏而有效的一項(xiàng)指標(biāo)[8]，能夠很好的反映試驗(yàn)用藥對各個(gè)器官的影響，尤其是反映毒性大小的一項(xiàng)重要的指標(biāo)。臟器指數(shù)有所增加表示臟器會(huì)有水腫、充血、增生、肥大等情況發(fā)生，臟器指數(shù)下降則表示臟器有所萎縮、發(fā)生退行性的變化等[9]。馬鈴薯糖苷生物堿粗提品中含有α-茄堿和α-卡茄堿等糖苷生物堿，有關(guān)α-茄堿和α-卡茄堿的研究結(jié)果表明，將單劑量為100 mg/kg體重 α-茄堿或100 mg/kg體重比例為1∶2.5的α-茄堿和α-卡茄堿混合物給予倉鼠，導(dǎo)致了類似的胃腸道脹氣，但并沒有其他器官的組織病理學(xué)改變[10]。

3.3 馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠血清免疫球蛋白的影響 本試驗(yàn)中，灌注馬鈴薯糖苷生物堿粗提品后血清中的IgG含量先升高后降低，各組之間差異不顯著(Pgt;0.05)，D組中IgG 含量最高；IgA、IgM均升高，C組、D組、E組與A組、B組相比差異顯著(Plt;0.05)，E組的IgA、IgM含量最高。

血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM是人體內(nèi)的3種免疫球蛋白，我們又稱抗體，是檢查體液免疫水平常用的方法，通常檢測IgG、IgA、IgM這3 類免疫球蛋白就可以代表血清免疫球蛋白的總體水平。

這3種抗體結(jié)構(gòu)與功能都是不一樣的。其中IgG是主要的再次免疫反應(yīng)抗體。IgM是主要的初次免疫抗體。IgA是黏膜免疫中的主要分泌型抗體。免疫球蛋白的主要作用是介導(dǎo)動(dòng)物的體液免疫，血清中抗體含量的高低在某種程度上反映了動(dòng)物機(jī)體對某些疾病的抵抗力[11]。血清免疫球蛋白的測定是檢查體液免疫水平常用的方法，通常檢測IgG、IgA、IgM這3類免疫球蛋白就可以代表血清免疫球蛋白的總體水平。

IgG抗體激活補(bǔ)體，中和多種毒素，本試驗(yàn)中隨著馬鈴薯皮添加量的增多IgG先升高后降低，說明在一定毒性范圍內(nèi)IgG的分泌能力能隨著毒素的增加能被激發(fā)出來，一旦超過某一毒性范圍，這種分泌能力就會(huì)下降。

IgA和IgM跟消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)的關(guān)系比較密切，是黏膜免疫中的主要分泌型抗體[12]，本試驗(yàn)中IgA,IgM含量增加，而且在灌注試驗(yàn)過程中會(huì)觀察到小鼠有輕度的胃腸炎癥狀，腸道是病菌、毒素等進(jìn)入機(jī)體的第一道屏障，可能會(huì)對腸道黏膜造成損傷，導(dǎo)致gA,IgM上升。

4 小結(jié)

馬鈴薯糖苷生物堿粗提品對小鼠有一定的毒性作用，能夠抑制小鼠體重的增長，不同濃度的馬鈴薯糖苷生物堿使小鼠免疫器官指數(shù)降低，IgA,IgM含量升高，300 mg/kg體重馬鈴薯糖苷生物堿呈現(xiàn)的對生長的抑制和對免疫功能的毒性最大，與對照組相比差異顯著(Plt;0.05)，并對小鼠有致死作用。

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Effectsofcrudeextractofpotatoglucosidealkaloidonbodyweightandimmunefunctioninmice

HE Yu-hua1,2， QIN Gui-xin1， BAI Ming-mei3

(1.College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University ,Changchun 130118，China ; 2.Jilin Agricultural Science and Technology Department of Animal Science and Technology,Zuojia 132109 , China ; 3. Jilin Province Changchun City Shuangyang District Sheling Street Office of animal husbandry and veterinary station,Changchun 130607，China)

In order to get a better understanding of the toxic effects of the glycoside alkaloids, the potato skin and buds were extracted and the extracts were used in mice. The effects of extracts on body weight, mortality, immune organ index and serum immunoglobulin were observed. The test results showed that solanine (alpha -solanine) and alpha chaconine (alpha -chaconine) of potato glycoalkaloids had toxic effect on mice. Mouse weight growth was inhibited, and the different concentrations of potato glycoalkaloids lead to the decrease of immune organ index of mice. The content of IgA and IgM was increased, and the inhibition of the growth of mice and the toxicity to immune function were the largest in 300 mg/kg, which was significantly different from that of the control group (Plt;0.05), and caused the death of mice.

Glycoside alkaloids ; Mouse ; Weight ; Immunity

QIN Gui-xin

S858.91

A

0529-6005(2017)10-0094-04

2017-02-11

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2012BAD39B03)；吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目[吉農(nóng)院合字(2015)第X022號(hào)]

何玉華(1978-)，女，副教授，博士生，從事動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)的教學(xué)和研究工作，E-mail:874348541@qq.com

秦貴信，E-mail:qgx@jlau.edu.cn