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(貴州大學(xué)a.農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550025)

·種子生產(chǎn)·

貴州優(yōu)異白肉火龍果B 7的離體快繁技術(shù)研究

劉小翠a,b，文曉鵬a，夏道強(qiáng)b，喬光a

(貴州大學(xué)a.農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.生命科學(xué)學(xué)院， 貴陽 550025)

貴州優(yōu)異白肉火龍果B 7具有較強(qiáng)的抗寒性，適宜在喀斯特地區(qū)推廣種植。本研究以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、NAA、IAA、IBA、KT、ZT和TDZ，優(yōu)化最佳增殖、生根培養(yǎng)基，建立并優(yōu)化火龍果的離體快繁體系，為工廠化育苗奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明：最優(yōu)增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，平均增殖系數(shù)為4.6，增殖苗健壯，長勢好；最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA 1.5 mg/L，根長勢較好，平均生根系數(shù)為7.6；經(jīng)煉苗移栽后，成活率達(dá)96%。

火龍果； 組織培養(yǎng)； 快速繁殖

火龍果(Hylocereusundatus)又名紅龍果、仙蜜果、青龍果等，屬仙人掌科量天尺屬果用栽培種，原產(chǎn)于中美洲熱帶沙漠地區(qū)，具有耐熱、耐旱等特點(diǎn)，外形獨(dú)特，營養(yǎng)豐富，病蟲害少，產(chǎn)量高，具有較高的營養(yǎng)價值、藥用價值以及觀賞價值[1-4]。貴州屬南亞熱帶和中亞熱帶氣候，在喀斯特高溫干旱地區(qū)火龍果已成為新、特、優(yōu)農(nóng)業(yè)項(xiàng)目。作為貴州省“十二五”規(guī)劃重點(diǎn)支持產(chǎn)業(yè)，火龍果已表現(xiàn)出巨大的經(jīng)濟(jì)、社會和生態(tài)效益。

表1 激素對火龍果莖段增殖的影響

處理號 細(xì)胞分裂素(mg/L) 生長素(mg/L) KTTDZZT6?BANAAIBA2，4?D增殖系數(shù)生長勢12．00．13．4±0．3c生長良好，苗高1～3cm22．00．11．0±0．0h形成愈傷32．00．11．0±0．0h形成愈傷42．00．14．6±0．3a長勢良好，苗高2～4cm50．11．2±0．1h長勢較弱，苗高1～2cm60．50．11．6±0．2g長勢較弱，苗高1～2cm71．00．12．6±0．4ef長勢較弱，苗高1～3cm81．50．13．0±0．3d長勢較好，苗高1～3cm92．50．14．0±0．4b長勢較好，苗高2～4cm103．00．12．9±0．3de長勢較弱，苗高1～3cm112．00．12．8±0．2def長勢較好，苗高1～3cm122．00．12．5±0．4f長勢較弱，有愈傷形成132．01．2±0．2h長勢較弱，有愈傷形成142．00．21±0．0h長勢弱，易褐化，無增殖

注：同一列中不同字母表示在0.05水平差異顯著。下同。

有報道表明，火龍果幼芽、嫩莖及部分成熟枝條在氣溫低于5 ℃時易受凍，低溫持續(xù)時間越長，對火龍果產(chǎn)量和品質(zhì)影響越大[4]。近年來，由于氣候異常，貴州省極端災(zāi)害天氣持續(xù)時間呈上升趨勢，低溫嚴(yán)重影響火龍果的栽培及推廣。貴州省果樹研究所挖掘的優(yōu)異白肉火龍果新種質(zhì)B 7具較強(qiáng)的抗寒性[5]，在生產(chǎn)上有廣闊的發(fā)展前景。采用傳統(tǒng)的扦插或種子繁殖，速度較慢且受繁殖母株少的限制，很難滿足大面積產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的需求。本研究以貴州優(yōu)異白肉火龍果種質(zhì)B 7為試材，建立并優(yōu)化離體快繁技術(shù)，實(shí)現(xiàn)工廠化育苗，以期為該種質(zhì)的推廣生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)以優(yōu)異白肉火龍果B 7成熟胚為外植體，于2015年7月取自貴州省果樹研究所火龍果資源圃。

1.2 方 法

1.2.1 無菌系的建立

選取大小均一、健康飽滿的種子，流水下沖洗干凈，用0.1%HgCl2消毒7～8 min，無菌水沖洗5次，蒸餾水浸種12 h后用無菌濾紙吸干表面水分，剝掉種皮接種在MS+GA32.0 mg/L培養(yǎng)基上，以此建立無菌系。

1.2.2 增殖培養(yǎng)基的篩選

增殖培養(yǎng)基共設(shè)14個處理(表1)，剪取2～3 cm無菌系幼嫩莖段作為外植體，接種在不同處理的培養(yǎng)基中。每處理接種5株，重復(fù)5次。組培苗培養(yǎng)條件為：溫度(25±2)℃，光周期12 h/d，光照強(qiáng)度1 800～2 000 lx；30 d后觀察生長情況，計算增殖系數(shù)。

1.2.3 生根培養(yǎng)基的篩選

將生長良好的增殖苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，生根培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基附加不同濃度IBA(0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/L)，共6個處理。每處理接種5株，重復(fù)5次，30 d后統(tǒng)計生根情況。

1.2.4 移 栽

取生根情況均勻一致，根數(shù)3～4條，苗高2～3 cm的生根苗，通過7 d自然室溫?zé)捗绾?，洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到滅菌的營養(yǎng)土里，封蓋塑料薄膜保濕，7 d后去除薄膜，30 d后觀察統(tǒng)計成活情況。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

增殖系數(shù)以萌發(fā)的腋芽數(shù)與原接種外植體數(shù)的比值表示，數(shù)據(jù)分析采用DPS數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，采用鄧肯氏多重極差法在0.05水平進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無菌系試管苗的建立

無菌系的建立是組織培養(yǎng)的基礎(chǔ)，種子經(jīng)12～15 min的表面滅菌，效果良好，7 d時統(tǒng)計污染率僅為5%。浸種能顯著提高種子萌芽率，經(jīng)12 h的浸種后，萌發(fā)率達(dá)90%(圖1 A)。

2.2 激素對增殖的影響

激素的配比對火龍果試管苗的增殖有重要影響。從表1可知，處理1～4對增殖培養(yǎng)基中細(xì)胞分裂素的種類進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6-BA和KT都能很好地誘導(dǎo)外植體增殖，且長勢良好，增殖系數(shù)分別為4.6±0.3和3.4±0.3，表明6-BA更有利于火龍果的增殖培養(yǎng)。添加了TDZ和ZT的培養(yǎng)基中外植體基本都形成了愈傷，沒有增殖。

注：A為無菌系；B為增殖；C為生根；D為移栽。圖1 貴州優(yōu)異白肉火龍果B 7組培快繁體系

處理4～10對增殖培養(yǎng)基中6-BA濃度進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，6-BA濃度在0～2.0 mg/L范圍內(nèi)時，組培苗增殖系數(shù)隨濃度的增大而增加，在濃度為2.0 mg/L時，達(dá)到最大(4.6±0.3)，顯著高于其他處理，且生長勢較好，增殖苗健壯，苗高達(dá)2～4 cm。當(dāng)6-BA濃度繼續(xù)增大時，增殖系數(shù)隨之降低。

處理4、11、12在確定最佳分裂素種類及濃度前提下，對生長素種類進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2，4-D的增殖系數(shù)最低(2.5±0.4)，其次是IBA(2.8±0.2)，且組培苗在這2種培養(yǎng)基中長勢較弱，其中2,4-D還誘導(dǎo)形成了愈傷組織。而添加NAA的培養(yǎng)基中，其增殖系數(shù)高，生長狀態(tài)好，說明NAA有利于白肉火龍果B 7的增殖。

處理4、13、14對最優(yōu)增殖培養(yǎng)基中NAA濃度進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NAA濃度為0 mg/L時，組培苗基本上沒有生長，只是形成了一塊白色的愈傷組織；當(dāng)NAA濃度達(dá)0.2 mg/L時，組培苗出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，生長停滯，無增殖。當(dāng)NAA濃度為0.1 mg/L時，增殖系數(shù)最高，生長情況最好，為最適增殖濃度。由此可得，處理4(MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L)為最佳增殖培養(yǎng)基(圖1 B)。

2.3 激素對生根的影響

由圖2可知，不同IBA濃度對白肉火龍果B 7組培苗生根的影響較大。當(dāng)IBA濃度在0～2.5 mg/L范圍內(nèi)時，平均根數(shù)隨濃度升高呈先增高后降低的趨勢。當(dāng)IBA濃度為1.5 mg/L時，組培苗生根效果最好，接種10 d左右即有根系發(fā)生，生根率達(dá)91%，30 d左右可產(chǎn)生2～4 cm根系，平均根數(shù)達(dá)7.6條(圖1 C)，且小苗長勢旺盛，苗壯，此時可出瓶移栽。當(dāng)生根培養(yǎng)時間較長時，蔓莖上的分枝及氣生根會增多。

2.4 試管苗的移栽

試管苗經(jīng)過開瓶煉苗7 d后，移栽到滅菌的營養(yǎng)土中，移植后澆適量水并保持基質(zhì)濕潤。15 d左右幼苗恢復(fù)生長，30 d時統(tǒng)計移栽成活率達(dá)96%(圖1-D)。

圖2 生長素濃度對生根的影響

3 結(jié)論與討論

2000年，貴州從海南引進(jìn)火龍果種植，短短幾年時間，貴州省火龍果產(chǎn)業(yè)規(guī)模已發(fā)展成為全國之首，在2013年底，羅甸火龍果獲國家質(zhì)檢總局地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，成為全國第一個火龍果地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品[6]?；瘕埞鳛橐粋€重要的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)，為貴州人民帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。但近年貴州冬季低溫持續(xù)時間較長，火龍果受冷害嚴(yán)重，極大限制了火龍果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。前期研究表明，貴州優(yōu)異白肉火龍果B 7具有高耐寒性[5]，適宜貴州目前的氣候條件。利用組織培養(yǎng)技術(shù)可快速繁殖該優(yōu)異種質(zhì)，為其大面積推廣種植奠定基礎(chǔ)。

獲得無菌材料是建立無菌系的前提，消除外植體上的雜菌是離體培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)[7]。若以火龍果幼嫩莖段為外植體建立無菌系，污染率較高，這是由于火龍果莖上芽眼處著生叢刺，不易清洗，消毒劑也難以透入，無法徹底滅菌[8]。因此本研究選用成熟胚作為外植體建立無菌系。謝志亮等對白玉龍火龍果成熟種子無菌萌發(fā)技術(shù)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，采用0.1%HgCl2消毒7～8 min，滅菌效果良好，幾乎無污染，對種子萌發(fā)生長無不良反應(yīng)[9]。鄭思成等報道了火龍果種胚無菌快速催芽技術(shù)，從浸種時間、基本培養(yǎng)基及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等方面進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用15%NaClO3滅菌12～15 min污染率低，浸種12 h，培養(yǎng)基中添加2.0 mg/L的GA3利于種胚萌發(fā)[10]。本研究綜合了以上2種方法來建立無菌系，取得了較低的污染率和較高的萌發(fā)率，且無菌苗長勢健壯。

在組織培養(yǎng)過程中，芽苗的發(fā)育受細(xì)胞分裂素與生長素的調(diào)控，2類激素在不定芽形成、細(xì)胞伸長及頂端優(yōu)勢等方面作用不同，只有當(dāng)二者比例適當(dāng)，才能互相協(xié)同作用，有利于不定芽的形成[8]。在進(jìn)行培養(yǎng)基篩選時，應(yīng)以較低的植物激素濃度，達(dá)到理想的繁殖系數(shù)為最優(yōu)，這樣可以避免由于過高的外源激素造成組培苗畸變、退化等現(xiàn)象，還可以節(jié)約成本[11]。本研究在增殖培養(yǎng)過程中篩選了最優(yōu)細(xì)胞分裂素和生長素的種類及濃度，在供試的細(xì)胞分類素中，TDZ和ZT分裂能力明顯較強(qiáng)于KT和6-BA，在2.0 mg/L時組培苗產(chǎn)生大量愈傷，無法增殖。相比于KT，6-BA更適合白肉火龍果B 7的增殖。從不同濃度6-BA對火龍果增殖的影響來看，較低或較高濃度都不能獲得最大增殖系數(shù)，當(dāng)濃度為2.0 mg/L時，獲得的增殖系數(shù)最高，增殖苗健壯，長勢好。在供試的生長素中，IBA和2,4-D均無法實(shí)現(xiàn)高頻增殖，只有較低濃度的NAA(0.1 mg/L)可獲得較高增殖系數(shù)。

關(guān)于火龍果組培快繁的研究，已有大量報道。彭綠春[11]等研究獲得的最大增殖系數(shù)為6.4；黃文靜等[12]得到最大增殖系數(shù)為4.9，最大生根數(shù)為6.8；劉洪章等[13]和劉穎等[14]獲得的最大增殖系數(shù)為3.2，最大生根數(shù)為5.1；張領(lǐng)等[15]獲得的最大增殖系數(shù)為12，最大生根數(shù)為7.2；楊紅超等[16]研究得到最大增殖系數(shù)為3.5，最大生根數(shù)為7.2。利用本研究優(yōu)化的最佳增殖培養(yǎng)基可獲得最大增殖系數(shù)為4.6±0.3，最佳生根培養(yǎng)基可獲得最多平均根數(shù)為7.6條。本試驗(yàn)通過對貴州優(yōu)異白肉火龍果B 7的增殖及生根培養(yǎng)基的篩選，建立了高頻離體快繁體系，得到最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，最適生根培養(yǎng)基為MS+IBA 1.5 mg/L。較之前人研究[12-16]，存在較大差異，其原因可能是火龍果品種差異、取材的生理狀態(tài)不同以及試驗(yàn)設(shè)計的激素配比差異所導(dǎo)致[11]。

對植物而言，組織培養(yǎng)在某種程度上可以算作一種逆境脅迫，因此常常會發(fā)生體細(xì)胞無性系變異[17]。保持原有優(yōu)良性狀的火龍果組培苗對于該品種的推廣生產(chǎn)非常重要。火龍果組培苗在經(jīng)過離體快速增殖及長期繼代培養(yǎng)后，極有可能發(fā)生變異。因此，對組培苗遺傳穩(wěn)定性的檢測還需進(jìn)一步研究。

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Studies on Tissue Culture and Rapid Propagation of Excellent White Pitaya B 7 in Guizhou

LIUXiaocuia,b，WENXiaopenga，XIADaoqiangb，QIAOGuanga

2016-08-26

國家自然基金(31401838)；貴州省重大專項(xiàng)資助項(xiàng)目(201260006-1)；貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研資助項(xiàng)目(2012018)。

劉小翠(1991—)，女，貴州遵義人；在讀碩士研究生，研究方向：分子細(xì)胞生物學(xué)；E-mail:651078369@qq.com。

喬 光(1981—)，男，山西人；博士，研究方向：果樹分子生物學(xué)；E-mail：13518504594@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.01.121

S 668.9

A

1001-4705(2017)01-0121-04