陳 婷
(杭州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,浙江 杭州 310053)
杭白菊提 取物效應(yīng)成分木犀草素和芹菜素在大鼠肝組織中分布情況的測(cè)定方法
陳 婷
(杭州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,浙江 杭州 310053)
目的:分析用HPLC(高效液相色譜)法測(cè)定大鼠肝組織中木犀草素和芹菜素水平的效果。方法:對(duì)大鼠的肝組織進(jìn)行處理,并用HPLC法測(cè)定其肝組織中木犀草素和芹菜素的水平。結(jié)果:用HPLC法測(cè)定大鼠肝組織中木犀草素和芹菜素水平的準(zhǔn)確度、精密度及專屬性均符合要求。結(jié)論:用HPLC法可準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定大鼠肝組織中木犀草素和芹菜素的水平。
杭白菊提取物;高效液相色譜法;木犀草素;芹菜素
杭白菊(Chrysanthemum morifolium Ramat,CME)是一種菊科多年生草本植物的頭狀花序,多產(chǎn)于浙江桐鄉(xiāng)、海寧、嘉興等地。中醫(yī)認(rèn)為,杭白菊具有疏風(fēng)散熱、養(yǎng)肝明目、清心補(bǔ)腎的功效?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究證實(shí),杭白菊提取物具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心血管和抗癌等作用[1-4]。木犀草素和芹菜素是杭白菊提取物的主要效應(yīng)成分。為了分析用HPLC法測(cè)定大鼠肝組織中木犀草素和芹菜素水平的效果,筆者進(jìn)行了以下研究。
1)Agilent 1100型高效液相色譜儀。2)Spectra Max M2型熒光分光光度儀。
1)木犀草素對(duì)照品和芹菜素對(duì)照品(均由中國藥品生物制品檢定所提供,對(duì)照品純度>99%)。2)杭白菊提取物。
Sprague-Dawley大鼠,雄性,體重為200~230 g(由浙江醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物質(zhì)量合格證:醫(yī)動(dòng)字第22-2001001號(hào))。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)、管理標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行飼養(yǎng)和管理。飼養(yǎng)、管理方法是:將大鼠置于溫度為22±2 ℃、濕度為50±10%的空調(diào)間內(nèi)進(jìn)行飼養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)前12 h,對(duì)大鼠進(jìn)行禁食處理。
1)分析柱為Agilent SB-C18型分析柱 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm)。2)保護(hù)柱為Agilent SB-C18型保護(hù)柱(10 mm× 4.6 mm, 5 μm)。3)流動(dòng)相為甲醇、乙腈和0.2%的磷酸溶液(35:10:55,v/v/v)。4)檢測(cè)流速為1.0 mL·min-1,檢測(cè)波長為350 nm,檢測(cè)柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為50 μl。
用甲醇將適量的木犀草素對(duì)照品配制成508.0 μg·mL-1的木犀草素對(duì)照品單一儲(chǔ)備液。用甲醇將適量的芹菜素對(duì)照品配制成502.0 μg·mL-1的芹菜素對(duì)照品單一儲(chǔ)備液。2)用甲醇將木犀草素對(duì)照品單一儲(chǔ)備液和芹菜素對(duì)照品單一儲(chǔ)備液稀釋成不同濃度的對(duì)照品混合液將上述對(duì)照品混合液置于4℃的低溫箱中待用。
采用腹主動(dòng)脈放血法處死大鼠,迅速取出其肝組織,并將其肝組織置于生理鹽水中。2)將肝組織從生理鹽水中取出,用濾紙吸干肝組織表面上的水分,然后對(duì)其進(jìn)行稱重。3)用生理鹽水將肝組織制成肝組織勻漿液,并將肝組織勻漿液置于-20 ℃的低溫箱中待用。
1)將1.0 ml濃度為6.0 mol·L-1的鹽酸溶液緩慢加入到0.5 ml的肝組織勻漿液中,邊加邊漩渦振蕩肝組織勻漿液。2)對(duì)肝組織勻漿液進(jìn)行80 ℃的水浴水解,并不時(shí)對(duì)其進(jìn)行振搖。1.5 h后,將肝組織勻漿液置于冰浴中冷卻。3)在肝組織勻漿液中加入3.0 ml的提取溶劑(乙酸乙酯:正己烷=80:20),并對(duì)肝組織勻漿液進(jìn)行5 min的漩渦振蕩。3)對(duì)肝組織勻漿液進(jìn)行10 min的離心處理,離心速度為3500 rpm。4)完成離心處理后,取肝組織勻漿液的上清液2.0 ml。
用HPLC法測(cè)定肝組織勻漿液中木犀草素和芹菜素的水平。
木犀草素和芹菜素的理論板數(shù)均不低于8000,兩者的分離度均符合要求(大于1.5),兩者儀器精密度試驗(yàn)的RSD分別為0.88%和0.89%。
在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下,木犀草素和芹菜素的分離度良好,組織樣品中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定結(jié)果,可確保分析方法的專屬性。
測(cè)定木犀草素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.7557C-20.52(n=7,r=0.9993),線性范圍為27.60~1473ng·mL-1。測(cè)定芹菜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.7933C-0.7063(n=7, r=0.9998),線性范圍為28.20~1506ng·mL-1。
理論濃度為110.5 ng·mL-1的木犀草素溶液中木犀草素的絕對(duì)回收率為77.9%,方法回收率為97.3%,日內(nèi)測(cè)定精密度為5.1%,日間測(cè)定精密度為4.3%。理論濃度為442.0 ng·mL-1的木犀草素溶液中木犀草素的絕對(duì)回收率為72.9%,方法回收率為95.0%,日內(nèi)測(cè)定精密度為2.9%,日間測(cè)定精密度為2.6%。理論濃度為1104 ng·mL-1的木犀草素溶液中木犀草素的絕對(duì)回收率為74.3%,方法回收率為103.8%,日內(nèi)測(cè)定精密度為1.6%,日間測(cè)定精密度為1.3%。理論濃度為113.0 ng·mL-1的芹菜素溶液中芹菜素的絕對(duì)回收率為77.5%,方法回收率為96.4%,日內(nèi)測(cè)定精密度為5.0%,日間測(cè)定精密度為4.3%。理論濃度為451.8 ng·mL-1的芹菜素溶液中芹菜素的絕對(duì)回收率為73.5%,方法回收率為95.9%,日內(nèi)測(cè)定精密度為4.1%,日間測(cè)定精密度為4.8%。理論濃度為1130 ng·mL-1的芹菜素溶液中芹菜素的絕對(duì)回收率為76.4%,方法回收率為102.4%,日內(nèi)測(cè)定精密度為1.6%,日間測(cè)定精密度為3.4%。詳見表1。
表1 肝組織樣品中木犀草素和芹菜素的回收率和測(cè)定精密度 (n=5)Tab 1 Recovery and precision for luteolin and apigenin in liver sample(n=5)
杭白菊是一種菊科多年生草本植物的頭狀花序。木犀草素和芹菜素是杭白菊提取物的主要效應(yīng)成分。為了分析用HPLC法測(cè)定大鼠肝組織中木犀草素和芹菜素水平的效果,筆者對(duì)SD大鼠的肝組織進(jìn)行處理,并用HPLC法測(cè)定其肝組織中木犀草素和芹菜素的水平。本次研究的結(jié)果顯示,用HPLC法測(cè)定大鼠肝組織中木犀草素和芹菜素水平的準(zhǔn)確度、精密度及專屬性均符合要求。
綜上所述,用HPLC法可準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定大鼠肝組織中木犀草素和芹菜素的水平。
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R917
B
2095-7629-(2017)14-0149-02
浙江醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)??蒲许?xiàng)目(菊花提取物(CME)效應(yīng)成分的分布和代謝物研究2009XZA02)
陳婷,女,1982年10月出生,浙江杭州人,漢族,碩士學(xué)位,副教授,研究方向?yàn)樗幬锓治?/p>