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(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建福州 350002;2.福州市經(jīng)濟(jì)作物站,福建福州 350003)

橄欖果實游離氨基酸測定方法的優(yōu)化

彭真汾1,王威1,謝倩1,葉清華1,陳清西1,*,許長同2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院,福建福州 350002;2.福州市經(jīng)濟(jì)作物站,福建福州 350003)

探索一種適于橄欖果實游離氨基酸含量測定的方法。通過單因素實驗初篩茚三酮顯色法中的條件,如pH、顯色劑含量、加熱溫度和加熱時間,并通過穩(wěn)定性、精密性、重復(fù)性和加樣回收實驗進(jìn)行方法學(xué)驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn):茚三酮顯色法的最佳反應(yīng)條件為最大吸收波長568 nm、pH6.6的磷酸緩沖液、0.5 mL 2%茚三酮溶液、加熱溫度100 ℃和加熱時間25 min,在30 min內(nèi)OD值改變0.41%,穩(wěn)定性RSD=0.34%(n=9)、精密性RSD=0.09%(n=9)、重復(fù)性RSD=1.71%(n=6)、回收率達(dá)100.34%、RSD=2.21%(n=6)。表明茚三酮顯色法測定橄欖果實游離氨基酸含量在此條件下穩(wěn)定且精密性、重復(fù)性和回收率良好,可用于橄欖果實游離氨基酸的快速簡便測定。

茚三酮顯色法,橄欖果實,游離氨基酸

橄欖[Canariumalbum(Lour.)Raeusch.]為橄欖科(Burseraceae)橄欖屬(Canarium)植物[1],主要分布于我國閩粵兩省,是我國南方特有的熱帶、亞熱帶果樹[2-3]。橄欖果實營養(yǎng)價值高,富含維生素C、鈣等營養(yǎng)物質(zhì)[2-3],兼具較高的藥用價值[4-8],是一種藥食兩用的水果[9]。研究表明,氨基酸是橄欖果實中除多酚和糖之外另一對果實風(fēng)味有重要影響的組分[2-3,10]。

氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位,是參與人體正常代謝和生理活動的重要物質(zhì),具有抗菌[11]、保肝保腎[12]、降血脂[13]等作用,對人體健康十分重要。根據(jù)氨基酸的狀態(tài),可分為結(jié)合態(tài)的水解氨基酸和游離態(tài)的游離氨基酸[14-15]。游離氨基酸一方面能形成芳香性氣味物質(zhì),增加植物氣味感官;另一方面其本身可劃分為呈味氨基酸和藥用氨基酸,增加食物的風(fēng)味和藥用價值[16-17],其比例和種類是評價植物品質(zhì)優(yōu)劣的主要指標(biāo)之一[18]。因此,測定游離氨基酸含量對于橄欖果實品質(zhì)評價具有重要的作用。

目前,測定游離氨基酸的常用方法主要有色譜法[19-20]、氨基酸自動分析儀法[21]和分光光度計法[22]等。色譜法能對氨基酸進(jìn)行分離,同時測定多種氨基酸組分,但一般需對氨基酸進(jìn)行衍生化才能測定,技術(shù)及成本要求較高[23];氨基酸自動分析儀是專門測定氨基酸含量的儀器,但其一方面需對氨基酸進(jìn)行柱后衍生,另一方面儀器價格昂貴且用途單一,存在一定的局限性;分光光度計法能測定某種氨基酸或游離氨基酸總量,雖不能進(jìn)行氨基酸分離分析測定,但此方法快捷簡便、成本較低,在大多實驗室具有可操作性[22]。當(dāng)只需對植物氨基酸含量進(jìn)行初步測定時,具有明顯的優(yōu)勢。

本實驗利用分光光度計法進(jìn)行橄欖果實游離氨基酸含量的測定優(yōu)化,并通過方法學(xué)進(jìn)行驗證,探索一種適于橄欖果實游離氨基酸含量測定的方法。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

“長營”橄欖 于2015年11月17日采自福建省閩侯縣城關(guān)農(nóng)場,采樣品后,置于4 ℃保溫箱中帶回實驗室,洗凈,晾干,取果肉置于液氮中,后用冷凍干燥機(jī)凍干并粉碎,過40目篩保存于-40 ℃冰箱中備用；亮氨酸、十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)、茚三酮(苯駢戊三酮)、無水乙醇 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

LGJ-25C型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司;FW177中草藥粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Allegra 64R臺式高速冷凍離心機(jī) 貝克曼庫爾特(美國)、DK-S22電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設(shè)備有限公司;UV WinLab V6紫外可見分光光度計 鉑金埃爾默儀器(上海)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 橄欖果實游離氨基酸溶液的提取 稱取橄欖粉末0.5 g(精確至0.0001 g)于50 mL離心管中,按料液比1∶41 (g/mL)加入60%乙醇,在超聲功率270 W、超聲溫度50 ℃下超聲提取20 min,后在常溫下10000 r/min離心10 min,吸取上清液1 mL于20 mL具塞試管中,用蒸餾水稀釋至刻度,作為橄欖果實游離氨基酸溶液。

1.2.2 試劑配制

1.2.2.1 亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品100 mg定容于100 mL容量瓶中,配制濃度為1 mg/mL的母液;吸取7.5、10和20 mL母液于100 mL的容量瓶中,分別配制濃度為0.075、0.1和0.2 mg/mL的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2.2 磷酸緩沖液的配制 首先配制0.2 mol/L Na2HPO4溶液作為A液,配制0.2 mol/L NaH2PO4溶液作為B液,再通過添加一定比例的A、B液來調(diào)得相應(yīng)pH的磷酸緩沖液[24]。

1.2.2.3 2%茚三酮溶液的制備 稱取2.0 g(精確至0.0001 g)茚三酮粉末,加入少許無水乙醇溶解,后用蒸餾水定容于100 mL棕色容量瓶中,搖勻后置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 茚三酮顯色法 分光光度計法測定游離氨基酸含量,是根據(jù)茚三酮與游離氨基酸在弱酸條件下的間接氧化還原的顯色原理實現(xiàn)的。首先α-氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛,茚三酮被還原后與另一分子氨和茚三酮脫水縮合生成藍(lán)紫色物質(zhì)[24-25]。本文參照吳月娜[26]方法優(yōu)化并稍作改進(jìn)。吸取0.1 mg/mL亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液或橄欖果實游離氨基酸溶液2 mL于20 mL具塞試管中,分別加入一定pH的磷酸緩沖液0.5 mL和一定體積的2%茚三酮溶液,于一定溫度恒溫水浴鍋中加熱一定時間后冷卻,蒸餾水定容至刻度,在最大吸收波長下測定吸光度。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 最大吸收波長的選擇 按1.2.3項下進(jìn)行茚三酮顯色法的操作,固定反應(yīng)條件磷酸緩沖液pH6.6、2%茚三酮溶液0.5 mL、加熱溫度100 ℃、加熱時間15 min,考察不同波長(400～700 nm)對吸光度的影響。

1.2.4.2 pH的選擇 按1.2.3項下進(jìn)行茚三酮顯色法的操作,固定反應(yīng)條件2%茚三酮溶液0.5 mL、加熱溫度100 ℃、加熱時間15 min、測定波長568 nm,考察不同pH(5.8、6.2、6.6、7.0、7.4、7.8)對吸光度的影響。

1.2.4.3 顯色劑用量的選擇 按1.2.3項下進(jìn)行茚三酮顯色法的操作,固定反應(yīng)條件磷酸緩沖液pH6.6、加熱溫度100 ℃、加熱時間15 min、測定波長568 nm,考察不同體積(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL)2%茚三酮溶液對吸光度的影響。

1.2.4.4 加熱溫度的選擇 按1.2.3項下進(jìn)行茚三酮顯色法的操作,固定反應(yīng)條件磷酸緩沖液pH6.6、2%茚三酮溶液0.5 mL、加熱時間15 min、測定波長568 nm,考察不同加熱溫度(60、70、80、90、100 ℃)對吸光度的影響。

1.2.4.5 加熱時間的選擇 按1.2.3項下進(jìn)行茚三酮顯色法的操作,固定反應(yīng)條件磷酸緩沖液pH6.6、2%茚三酮溶液0.5 mL、加熱溫度100 ℃、測定波長568 nm,考察不同加熱時間(10、15、20、25、30、35、40 min)對吸光度的影響。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制 分別吸取0.2 mg/mL的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品0.5、0.625、0.75、0.875、1、1.125、1.25、1.375、1.5、1.625和1.75 mL,并用蒸餾水分別補(bǔ)足至2 mL于20 mL具塞試管中,加入pH6.6磷酸緩沖液0.5 mL和2%茚三酮溶液0.5 mL,搖勻,于100 ℃恒溫水浴鍋中加熱25 min,冷卻,蒸餾水定容至刻度,在波長568 nm下測定吸光度。以亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得回歸方程為:y=10.482x-0.4947,R2=0.9996。亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液在0.05～0.175 mg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.6 方法學(xué)驗證實驗 以下方法學(xué)驗證實驗均以茚三酮顯色法優(yōu)化實驗篩選出的最佳條件進(jìn)行。

1.2.6.1 穩(wěn)定性實驗 按1.2.1項下通過改變料液比配制高(1∶20 (g/mL))、中(1∶30 (g/mL))、低(1∶40 (g/mL))濃度的游離氨基酸溶液,在568 nm處分別測定吸光度,每隔5 min測定1次,共測定30 min。

1.2.6.2 精密性實驗 按1.2.2.1項下方法配制高(0.2 mg/mL)、中(0.1 mg/mL)、低濃度(0.075 mg/mL)的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法測定吸光度,重復(fù)測定6次。

1.2.6.3 重復(fù)性實驗 稱取6份0.5 g(精確至0.0001 g)橄欖粉末,按1.2.1項下方法制備游離氨基酸溶液,后按1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法測定吸光度。

1.2.6.4 加樣回收實驗 稱取6份0.5 g(精確至0.0001 g)橄欖粉末,按1.2.1項下方法制備游離氨基酸溶液,后按1.2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制方法測定吸光度,計算得出游離氨基酸含量,后依據(jù)其含量在游離氨基酸溶液中分別加入低、中、高含量的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品粉末,測定吸光度,計算回收率。

1.2.7 橄欖果實游離氨基酸含量的測定與計算 吸取1.2.1項下制備的橄欖果實游離氨基酸溶液2.0 mL代替1.2.5中亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液,并以2.0 mL蒸餾水作為空白對照,按1.2.5項下進(jìn)行實驗,測定吸光度。游離氨基酸含量的計算公式如下:

式中:c為游離氨基酸濃度(mg/mL),從標(biāo)曲上獲得;V為提取液總體積(mL);n為稀釋倍數(shù);m為橄欖粉末質(zhì)量(g)。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)整理和圖表的繪制采用Excel 2003完成,顯著性分析采用SPSS 17.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果

2.1.1 最大波長的選擇 由圖1可知,橄欖游離氨基酸溶液和亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的最大波長均在568 nm處,與吳月娜[26]的結(jié)果一致,且張鑒棠[27]等研究得出除賴、脯、羥脯氨酸外,其余常見氨基酸的最大吸收峰相同,因此選擇568 nm作為游離氨基酸檢測波長。

圖1 波長掃描圖

2.1.2 pH的選擇α-氨基酸和茚三酮適宜在弱酸性條件下反應(yīng)[24]。通過設(shè)置一系列的弱酸性環(huán)境來尋找最佳pH。由圖2可知,亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品在不同的pH條件下,其與茚三酮的顯色反應(yīng)有所不同,呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢,在pH6.6時達(dá)到最大值,表明在pH6.6條件下亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品與茚三酮顯色最佳。

圖2 pH條件的選擇

2.1.3 顯色劑用量的選擇 由圖3可知,隨著顯色劑用量的增加,吸光度呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的趨勢,在2%茚三酮顯色劑用量為0.5 mL時吸光度達(dá)到最大值,再增加顯色劑的用量對吸光度無顯著(p<0.05)改變,從節(jié)省顯色劑含量的角度出發(fā),選擇0.5 mL的顯色劑用量最佳。

圖3 顯色劑用量的選擇

2.1.4 加熱溫度的選擇α-氨基酸與茚三酮反應(yīng)需要在共熱的條件下生成藍(lán)紫色的二酮茚-二酮茚胺,達(dá)到顯色的目的[24]。由圖4可知,隨著加熱溫度的升高,吸光度逐漸升高。在60、70 ℃的水浴環(huán)境下加熱時,并未出現(xiàn)藍(lán)紫色產(chǎn)物,在80、90、100 ℃時顏色逐漸加深,100 ℃時顏色最深,顯色反應(yīng)最好,因此選擇100 ℃為反應(yīng)溫度。

圖4 加熱溫度的選擇

表1 穩(wěn)定性實驗結(jié)果

2.1.5 加熱時間的選擇 在α-氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)中,加熱時間的長短主要取決于反應(yīng)是否完全[28]。由圖5可知,隨著加熱時間的增加,吸光度先增加后趨于穩(wěn)定。在25 min時達(dá)到最大吸光度,往后增加加熱時間,已沒有顯著(p<0.05)變化,表明在加熱時間25 min時,亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與茚三酮已反應(yīng)完全,因此選擇25 min為加熱時間。

圖5 加熱時間的選擇

表3 重復(fù)性實驗結(jié)果

表4 加樣回收實驗結(jié)果

2.2方法學(xué)驗證結(jié)果

2.2.1 穩(wěn)定性實驗 通過穩(wěn)定性實驗結(jié)果(見表1)發(fā)現(xiàn)高、中、低濃度的橄欖游離氨基酸溶液RSD值分別為0.25%(n=3)、0.29%(n=3)和0.48%(n=3),平均RSD為0.34%;5 min內(nèi)OD值平均改變0.11%,30 min內(nèi)改變0.41%<1%,表明配制的游離氨基酸溶液在30 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.2 精密性實驗 通過精密性實驗結(jié)果(見表2)發(fā)現(xiàn)高、中、低濃度的亮氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的RSD值分別為0.19%(n=3)、0.02%(n=3)和0.07%(n=3),平均RSD為0.09%<2%,表明精密性良好。

表2 精密性實驗結(jié)果

2.2.3 重復(fù)性實驗 通過重復(fù)性實驗結(jié)果(見表3)發(fā)現(xiàn)橄欖游離氨基酸RSD為1.71%<3%(n=6),表明方法重復(fù)性良好。

2.2.4 加樣回收實驗 通過加樣回收實驗結(jié)果(見表4),發(fā)現(xiàn)平均回收率為100.34%,在95%～105%之間,RSD=2.21%<3%,表明回收率結(jié)果良好。

3 討論

在茚三酮與游離氨基酸反應(yīng)過程中,反應(yīng)條件如pH、茚三酮溶液、加熱溫度和時間等都會對結(jié)果產(chǎn)生影響。其中,由于反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)品的選擇與pH對測定結(jié)果的影響較大,使各學(xué)者優(yōu)化工藝結(jié)果不盡相同,均存在一定差異[22,29-32]。標(biāo)準(zhǔn)品的選擇主要造成pH的差異[27]，本實驗在參考了王學(xué)奎[24]和吳月娜[26]的基礎(chǔ)上選擇了亮氨酸作為標(biāo)準(zhǔn)品,亮氨酸為中性氨基酸,溶液本身呈中性,減少對pH選擇的影響。從實驗結(jié)果可知,橄欖選擇中性氨基酸亮氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品優(yōu)化獲得最佳顯色磷酸緩沖液pH為6.6,此結(jié)果與李紅武[29]選擇中性氨基酸纈氨酸、酸性氨基酸谷氨酸和堿性氨基酸組氨酸的中性混合液組成為標(biāo)準(zhǔn)品獲得的pH6.7磷酸緩沖液相接近,與邵金良[33]以酸性氨基酸茶氨酸為標(biāo)準(zhǔn)品得出最佳pH為8.0的磷酸緩沖液不同,不同研究選取的磷酸緩沖液pH的不同,主要是因為各種α-氨基酸由于自身酸度不同,使得中性、酸性和堿性氨基酸溶液pH存在顯著差異[34],通過調(diào)整磷酸緩沖液來使反應(yīng)體系pH為弱酸性,以滿足茚三酮的顯色條件。并且反應(yīng)溶液pH還會影響氨基酸與茚三酮顯色反應(yīng)的成色速度、產(chǎn)物顏色以及分子內(nèi)其他基團(tuán)對茚三酮反應(yīng)的靈敏度,造成反應(yīng)時長的不同和穩(wěn)定性的差異[34]。其中,反應(yīng)時長主要根據(jù)具體顏色變化而定,若反應(yīng)時間太短則反應(yīng)不完全[28]。本實驗在加熱10 min時就有淡紫色顏色出現(xiàn),隨著反應(yīng)時長的增加,反應(yīng)物的顏色越來越深,在25 min時達(dá)到藍(lán)紫色,并通過穩(wěn)定性實驗得知其在30 min內(nèi)均有良好的穩(wěn)定性;而茚三酮顯色法測定青天葵中游離氨基酸含量的方法[26]加熱時長為19 min,要求盡量在5 min內(nèi)完成測定,與之相比,本實驗優(yōu)化結(jié)果的穩(wěn)定性更佳。

4 結(jié)論

茚三酮法測定橄欖果實游離氨基酸含量的最佳條件為:pH6.6的磷酸緩沖液、0.5 mL 2%的茚三酮溶液、沸水浴反應(yīng)25 min,冷水冷卻后在568 nm下測定游離氨基酸含量。此方法操作簡便、穩(wěn)定性、重復(fù)性、精密性良好,回收率可達(dá)到100.34%。

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OptimizationoftestingmethodforfreeaminoacidofChineseolive

PENGZhen-fen1,WANGWei1,XIEQian1,YEQing-hua1,CHENQing-xi1,*,XUChang-tong2

(1.College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;2.Fuzhou Technique Extension Station for Cash Crops,Fuzhou 350003,China)

The aim of this article was to exploring optimal method of testing the free amino acid of Chinese olive.The conditions of Ninhydrin Colorization method,such as pH,chromogenic agent content,heating temperature and heating time,were selected through single factor experiment,and through the methodology experiment included stability test,exactness test,repeatability test and sample recovery test to verify it. The results showed that the optimal reaction conditions of Ninhydrin Colorization method,such as the maximum absorption wavelength was 568 nm,the optimal pH of phosphate buffer was pH6.6,the optimal content of 2% chromogenic agent was 0.5 mL,the optimal heating temperature was 100 ℃ and the optimal heating time was 25 min.The methodology validation results showed that the OD was change 0.41% in 30 minutes,the stability of RSD was equal to 0.34%(n=9),the exactness of RSD was equal to 0.09%(n=9),the repeatability test of RSD was equal to 1.71%(n=6),the sample recovery test of RSD was equal to 2.21%(n=6)and the recovery rate was 100.34%. It stated that Ninhydrin chromogenic method of testing free amino acids for Chinese olive was feasible,and it performed very well in the area of the stability,the exactness,the repeatability and recovery rate under this condition. Therefore the method was sui

Table for testing free amino acids for Chinese olive quickly and easily.

ninhydrin colorization method;Chinese olive;free amino acid

2017-05-16

彭真汾(1992-)，女，碩士研究生，主要從事果樹生理生態(tài)研究，E-mail：390689340@qq.com。

*

陳清西(1964-)，男，博士，教授，主要從事園藝植物栽培生理和科研工作，E-mail：cqx0246@163.com。

農(nóng)業(yè)科技園區(qū)花果良種選育及集約化種植技術(shù)研究與示范(2013NZ0002-4)。

TS255.7

A

1002-0306(2017)22-0263-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.051