木質纖維素生物煉制的研究進展

林海龍

(國投生物科技投資有限公司，北京 100034)

木質纖維素生物煉制的研究進展

林海龍

(國投生物科技投資有限公司，北京 100034)

木質纖維素是一種廣泛存在的可再生生物質資源，主要由纖維素、半纖維素和木質素組成。如何更有效地綜合利用木質纖維素是當前面臨的世界性難題。本文中，筆者梳理了木質纖維素生物化學法轉化生產以燃料乙醇為代表的生物基產品，特別是轉化過程中關鍵技術環(huán)節(jié)的研究現狀及難點，深入探討了木質素的生物轉化利用趨勢，并綜述了合成生物學在這些領域的研究趨勢和最新成果。本文力圖描繪出木質纖維素生物煉制研究全景，為后續(xù)研究提供潛在思路。

木質纖維素；生物煉制；燃料乙醇；木質素生物降解

木質纖維素是植物細胞壁的主要成分，包含了纖維素、半纖維素和木質素三大組分。地球上每年通過光合作用產生的木質纖維素類生物質高達1 000億t以上，然而只有少數部分被人類所利用。美國每年可收集利用的木質纖維素類生物質高達13億t，中國也有8億t左右[1]，這些生物質的有效利用必將減少化石資源的開采。目前，以化石資源為主要的能源利用形式導致了一系列的社會問題，如環(huán)境污染、能源危機等。因此，世界各國都在加大力度開發(fā)木質纖維素這一可再生資源，以緩解能源危機、環(huán)境污染等問題，達到可持續(xù)發(fā)展的目標。

木質纖維素的轉化利用可分為熱化學法和生物化學法。熱化學法包括高溫分解(pyrolysis)、高溫液化(liquefaction)和氣化(gasification)等。高溫分解在300～1 000 ℃、無氧條件下進行[2]，其產物主要為合成氣(CO、CO2、 CH4和H2等)、生物油(bio-oil)以及生物碳(bio-char)。另外，根據木質纖維素熱裂解反應的變化，其產物也明顯不同。當木質纖維素快速高溫分解時，主要產物為生物油，而慢速高溫分解的主要產物為生物碳。木質纖維素的高溫液化是將物料在含有較多水分的條件下，在250～370 ℃將生物質轉變?yōu)樯镉蚚3]；而氣化則是在900～1 200 ℃條件下，將生物質裂解為CO、CO2、H2O、H2和CH4等，同時有副產物焦油和焦炭等的生成[4]。生物化學法的一般流程是預處理破壞植物細胞壁的緊密結構，酶水解將木質纖維素中的纖維素和半纖維素降解為可被微生物發(fā)酵的糖，最后通過微生物發(fā)酵生產各種生物基產品，如燃料乙醇、丁醇等(圖1)[5-6]。相比而言，生物化學法反應條件溫和，預處理溫度在60～220 ℃，酶水解溫度50 ℃左右，發(fā)酵溫度20～60 ℃。本文中，筆者主要介紹木質纖維素的生物化學法轉化利用生產以燃料乙醇為代表的生物基產品。

圖1 木質纖維素生物煉制生產燃料乙醇的工藝流程Fig.1 Schematic diagram of biorefinery for converting lignocellulosic biomass to bio-ethanol

1 燃料乙醇

燃料乙醇可用來部分代替汽油，緩解石油危機。目前，燃料乙醇主要與汽油以一定比例混合使用(通常乙醇添加比例為10%)，形成新型混合燃料(E10汽油)。燃料乙醇取代甲基叔丁基醚添加到汽油中，減少對地下水和空氣的污染，可提高汽油的辛烷值，增強汽油的抗爆性能。另外，乙醇的氧含量高達34.7%，因此，乙醇與汽油的混用一定程度上解決了汽油在油缸內燃燒供氧不足的問題，從而使汽油燃燒更加充分，減少CO和其他有害氣體的生成，降低對環(huán)境的污染。目前，美國是燃料乙醇的最大生產國(原料主要為玉米)，年產量4 500萬t左右[7]；巴西是第二大燃料乙醇生產國(原料為甘蔗)，年產量2 150萬t左右[7]；中國是第三大燃料乙醇生產國(原料為玉米、木薯和小麥等)，年產量為250萬t左右[7]。

相比已規(guī)?；a的玉米乙醇，木質纖維素乙醇目前還處于規(guī)模化生產的起始階段。歐美有幾家公司已經建立了較大規(guī)模的木質纖維素乙醇生產廠進行試運行。這些公司包括：在美國堪薩斯建立的以玉米秸稈為原料年產7.5萬t乙醇的Abengoa公司、在意大利Crescentino建立的以草為原料年產4.0萬t乙醇的Beta Renewables公司、在美國愛荷華州建立的以玉米秸稈為原料年產9.0萬t乙醇的DuPont公司、在美國愛荷華州建立的以玉米秸稈為原料年產6.0萬t乙醇的POET/DSM公司、在巴西建立的以甘蔗渣為原料年產3.2萬t乙醇的Raizen公司以及年產6.5萬t乙醇的Granbio公司等[8]。

2 木質纖維素轉化為可發(fā)酵糖

木質纖維素原料來源廣泛、價格低廉且能被來源于微生物的水解酶類降解。木質纖維素的這些特點為微生物發(fā)酵法大規(guī)模產糖提供了可能，進而為系統(tǒng)生產種類多樣的生物基產品提供了豐富的原料。這些生物基化學品包括大宗化學品(如乙醇)、精細化學品(如酶制劑、手性化合物)、食品元素(如維生素、抗氧化劑)以及藥品(如天然產物)等[9]。從生物質中獲取發(fā)酵糖，然后糖通過微生物發(fā)酵生產各種產品的技術路線也被稱為 “糖平臺”技術?！疤瞧脚_”技術主要包括預處理和酶水解生產可發(fā)酵糖的過程。

2.1 預處理方法

木質纖維素的預處理過程是將木質纖維素轉化為可發(fā)酵糖的關鍵步驟。木質纖維素中的半纖維素包裹著纖維素，并與木質素交織形成復雜的木質素碳水化合物復合體(lignin carbohydrates complex)。木質纖維素復雜的結構使得纖維素酶很難與直接纖維素接觸，從而導致纖維素生物降解效率低下。同時，纖維素的高聚合度和高結晶度等特點也影響了纖維素的生物降解[6]。因此，預處理是實現木質纖維素高效轉化利用的至關重要一步。目前常用的預處理方法包括：物理法、化學法、物理化學法和生物法等[10]。

物理法預處理主要是通過物理的方式破壞生物質的細胞壁結構，使纖維素暴露出來，從而提高纖維素的可及性。物理法預處理包括研磨粉碎、β-射線和微波等。機械預擠壓處理方法是物理法中最常用的一種預處理方法，這種預處理方法在較高溫度下(>300 ℃)對生物質進行機械剪切研磨，能夠有效地破壞生物質細胞結構，擾亂纖維素的結晶區(qū)，從而提高纖維素的酶解效率[11]。這種預處理方法主要缺點是能耗高，因而在工業(yè)化應用過程中的前景有限。

與物理法預處理不同，化學法預處理主要是通過化學反應切斷木質素碳水化合物復合體中的化學鍵，破壞或去除生物質中的半纖維素或者木質素，從而提高纖維素的酶促反應可及性，以提高酶解效率[12]?；瘜W法預處理主要包括稀酸預處理、堿預處理、有機溶劑預處理和濕式氧化預處理等，其中，稀酸預處理主要是將半纖維素在預處理過程中水解為單糖，從而把半纖維素從纖維素表面剝離，使纖維素暴露出來便于生物降解[13]。這種預處理方法成本低，操作較為簡單，但預處理過程中會導致糖的降解以及抑制物(如酚類、糠醛和呋喃等)的生成。同時，稀酸對設備具有腐蝕性，增加了設備的運行及維護成本[14-16]。堿預處理的應用也較為廣泛，該方法能有效切斷木質素與碳水化合物之間的化學鍵，從而打散木質纖維素結構。同時，堿還能溶解、去除部分木質素，從而提高木質纖維素的酶解轉化效率。然而，該方法常常需要大量的水對預處理后的底物進行沖洗除鹽、脫毒，導致下游處理成本大大提高，不利于工業(yè)化應用[14]。

由于物理法和化學法各有優(yōu)點，吸收這兩種方法優(yōu)點的物理化學法預處理逐漸受到廣泛關注[17]。物理化學法預處理主要是在高溫高壓的條件下，破壞木質纖維素不同組分之間的連接，同時可去除部分木質素或者半纖維素[18-20]。物理化學法有蒸汽爆破法、氨纖維膨脹法(AFEX)等[17]。其中，蒸汽爆破預處理方法應用較為廣泛，該法主要是利用蒸汽作為介質，進入植物細胞內部，在壓力瞬間釋放的作用下破碎細胞壁結構。另外，在高溫高壓的作用下，催化劑(H2SO4和SO2)的存在能顯著提高蒸汽爆破的預處理效果，達到較好的半纖維素去除率以及糖回收率[18]。和酸催化預處理類似，蒸汽爆破預處理過程中也會產生大量抑制物，這些抑制物對后續(xù)酶解發(fā)酵產生較為強烈的抑制影響。蒸汽爆破預處理的相關技術難題仍有待進一步解決[21-22]。AFEX采用的氨氣呈弱堿性，因此具有堿預處理的一些特征，但由于是弱堿，從而避免了過多副反應的發(fā)生，產生的抑制物較少[23]。另外，氨的揮發(fā)性使得氨氣回收利用較為方便，殘留在木質纖維素中的氨還能作為后續(xù)微生物發(fā)酵的氮源[24]。

生物法預處理對木質纖維素也具有較好的預處理效果。該預處理方法主要利用白腐菌、軟腐菌等微生物選擇性地對木質纖維素中的木質素進行降解。然而，由于生物降解反應速率過慢，該預處理方法所需時間較長(長達數周)，因此較難在工業(yè)化生產中得到廣泛應用[10,25]。目前，稀酸預處理、蒸汽爆破預處理和AFEX預處理都已經實現了中試規(guī)模以上的放大測試。

此外，近年來還出現了一些較為新穎的預處理方式，如co-solvent enhanced lignocellulosic fractionation(CELF)預處理[26-27]、sulfite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose(SPORL)預處理[28-30]、對甲苯磺酸預處理技術以及flowthrough預處理[31]等。美國加州大學河濱分校的Wyman教授課題組開發(fā)的CELF預處理技術主要利用低沸點的四氫呋喃作為溶劑，分離木質纖維素的3種組分(纖維素、半纖維素和木質素)，所得預處理底物纖維素含量高，更容易被纖維素酶催化水解、大大降低了酶用量[32]。美國農業(yè)部Zhu課題組開發(fā)的SPORL預處理結合了稀酸預處理和磺化預處理的特點，以亞硫酸鹽為反應劑，在酸性條件(pH 2～4)及較高溫度(160～180 ℃)下進行預處理[28-30]，該預處理方式適用于處理結構較為致密的軟木以及硬木，且可利用傳統(tǒng)制漿造紙產業(yè)的設備作為反應器。最近，該課題組還利用對甲苯磺酸(pTsOH)作為水溶性助溶劑，有效分離了纖維素、半纖維素和木質素，大大提高了所得纖維素的可及性，提高了纖維素酶催化水解效率。該預處理技術所采用的pTsOH可重復利用，預處理溫度較低(<80 ℃)，時間較短(<60 min)，并且無需添加任何其他催化劑，因而具有較好的應用前景[33-34]。

2.2 酶水解

木質纖維素酶水解的主要目標是將其中的纖維素和半纖維素水解為可發(fā)酵單糖。纖維素是由葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接起來的聚合物。半纖維素則是由幾種不同類型的單糖構成的多聚體，這些單糖主要為木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖等，其中最多的是木糖。水解纖維素的酶主要包含3種核心酶：纖維二糖水解酶(CBH)、內切葡聚糖酶(EG)和β-葡萄糖苷酶(βG)[35-36]。內切葡聚糖酶在低結晶區(qū)纖維素鏈的中間隨機地進行切割，產生還原末端和非還原末端的纖維素鏈。纖維二糖水解酶CBH I 和 CBH II通過其自身的吸附結構域吸附在纖維素鏈上，分別從還原末端和非還原末端對纖維素鏈進行水解，產生纖維二糖。β-葡萄糖苷酶水解纖維二糖，產生葡萄糖。半纖維素的水解主要依靠內切木聚糖酶、外切木聚糖酶、木糖苷酶和內切甘露聚糖酶等[35]。不同的纖維素酶和半纖維素酶通過相互協(xié)同作用提高木質纖維素的降解轉化效率。Gao等[37]研究了水解AFEX預處理玉米秸稈的最優(yōu)酶配比，發(fā)現CBHI+CBHII+EG的含量在最優(yōu)的酶配比中占了77.4%，說明纖維二糖水解酶和內切葡聚糖酶在水解木質纖維素中至關重要的作用。

影響木質纖維素酶水解效率的因素很多，包括底物的孔隙率、酶所能接觸到的底物面積、纖維素的結晶度和聚合度、木質素的含量以及酶的活力等[6]。其中，木質素主要通過疏水作用和靜電作用與纖維素酶進行無效吸附，從而阻礙酶與底物的高效接觸、降低酶的水解效率[38]。另外，預處理產生的抑制物，特別是木質素衍生出的酚類物質，對酶活有較大的抑制[39]。酶水解的產物(單糖和寡糖)對木質纖維素的酶水解也具有強烈的抑制作用[16]。這些因素都或多或少地限制了木質纖維素酶水解的效率。

2.3 木質纖維素制糖的瓶頸

2.3.1 高底物濃度酶水解的低糖轉化率

高底物濃度酶水解是實現木質纖維素生物煉制工業(yè)化的必要條件。然而，纖維素和半纖維素的轉化率(糖轉化率)隨著酶水解底物濃度的提高而直線下降，導致高底物濃度下糖轉化率偏低[40]。造成這種現象的可能原因包括：1)水含量下降。木質纖維素底物濃度提高造成了反應體系中水含量的下降。水是纖維素和半纖維素酶水解的底物之一，同時也是酶的溶劑，在酶水解過程中非常重要。水含量的下降、物料黏度的提高在一定程度上影響了酶水解的效果。2)木質素含量的提高。木質纖維素底物濃度的提高導致了木質素含量的提高，而木質素是影響酶水解的一大負面因素。3)抑制物濃度的提高。木質纖維素預處理產生的抑制物隨著木質纖維素底物進入酶水解，木質纖維素濃度的提高必然引起抑制物濃度的提高。即使是產生抑制物較少的AFEX預處理方法，酶的水解效率也會明顯受到預處理抑制物的影響[41]。4)傳質問題。高底物濃度酶水解往往伴隨一段時間的物料高黏度特性，從而引起傳質問題[42]。5)產物的反饋抑制。高底物濃度酶解產生高產物濃度(高糖濃度)，從而造成對酶反應的強烈反饋抑制。Kristensen等[40]研究了限制高底物濃度酶水解糖轉化率的因素，發(fā)現隨著底物濃度的提高，酶在底物上的吸附減少是造成糖轉化率下降的重要原因。Jin 等[43]通過同步糖化共發(fā)酵法(SSCF)將酶水解與微生物發(fā)酵在同一個反應器中同時進行，SSCF過程雖然降低了酶水解產物糖對酶反應的抑制作用，但仍然呈現糖轉化率隨底物濃度的提高而下降的現象。進一步研究發(fā)現，除存在預處理抑制物的抑制效應外，發(fā)酵產物乙醇的不斷積累也是造成糖轉化率顯著下降的重要因素。因此，及時將抑制物和產物乙醇移除后，在高底物濃度下也獲得了較高的糖轉化率。

2.3.2 高纖維素酶用量

高纖維素酶用量導致酶使用成本居高不下是制約木質纖維素生物煉制產業(yè)化發(fā)展的另一需要解決的關鍵問題。據估算，木質纖維素乙醇的生產成本中，酶的成本占15.7%[44]。為此，人們在改進預處理方法[45]、酶配方[37]以及酶回收利用[46]等方面做了大量工作。最近，Sousa等[45]在AFEX預處理基礎上發(fā)明了萃取氨(EA)預處理技術。該技術移除了大約45%的木質素，并將纖維素I型轉變?yōu)槔w維素III型，從而大大提高了酶解效率、降低了60%的酶用量。諾維信公司在其第三代纖維素酶Cellic Ctec 3中添加了多糖單加氧酶(GH61)，大大提高了木質纖維素的降解效率。Jin等[46-47]利用纖維素酶在酶水解殘留固體上的吸附特性，高效快速回收纖維素酶并將酶用量減少40%。近年來，合成生物學與系統(tǒng)生物學技術的飛速發(fā)展，也為新纖維素酶的挖掘、新纖維素降解體系的構建、分子酶機器的構建提供了技術支撐。

2.3.2.1 新纖維素酶的挖掘和纖維素降解體系的重構

自然界一些特殊環(huán)境，比如動物瘤胃、昆蟲腸道以及人跡罕至的原始森林、沼澤地區(qū)等，這些環(huán)境中的微生物能快速降解木質纖維素。這些環(huán)境及微生物的多樣性為新纖維素酶的挖掘提供了豐富的酶源[48-49]。由于特定環(huán)境下的微生物在長期進化中形成了高度的生存依賴關系[50]，因此，群落中主要產纖維素酶菌株的純培養(yǎng)相對較為困難。近年來，宏基因組、宏轉錄組及宏蛋白組技術的快速發(fā)展可以直接讀取原始環(huán)境中微生物群落的基因組、轉錄組和蛋白組信息，為鑒定纖維素酶基因、研究酶表達水平、調取新纖維素酶基因、表達純化異源蛋白、研究降解機理奠定基礎[48,51]。例如，美國能源部等多家研究機構直接從白蟻腸道中提取總DNA和總RNA，建立了宏基因庫，通過測序發(fā)現其中存在著多達數百種的纖維素、半纖維素水解相關的基因[52-53]。因此，組學工具的大規(guī)模應用顯著增強了人們對纖維素酶的篩選和應用。另外，系統(tǒng)生物學和合成生物學的基因組、代謝組、流量組以及計算模擬技術也為微生物群落研究提供了豐富的工具[50]。

目前，從自然界中篩選高效降解纖維素的微生物群落，鑒定其群落結構，研究混菌發(fā)酵動力學，解析其高效降解轉化的機理，進而模擬構建類似系統(tǒng)或者通過改造進一步強化其功能等[54-56]，為建立新的纖維素降解體系提供了新思路。

2.3.2.2 分子酶機器的構建

自然界中的生物質降解過程是多種木質纖維素酶系協(xié)同作用完成的[57]。不同種類的酶、不同的酶組分之間在降解木質纖維素過程中具有協(xié)同作用，即復合酶組分的降解效率會明顯高于單個酶解效率的總和。因此，控制酶系中酶的組成、比例和活力，增強協(xié)同作用，是提高酶解效率的有效手段[57-58]。纖維小體(cellulosome)是一種能高效降解結晶纖維素和非結晶纖維素的天然多酶復合體，活力是里氏木霉纖維素酶活力的50倍[58]。目前在多種細菌和真菌中均發(fā)現了纖維小體。纖維小體的主體結構是支架蛋白(scaffoldin)，纖維素酶通過錨定域特異性地與支架蛋白上的黏附域結合。隨著測序及蛋白解析技術的發(fā)展，基因組測序和腳手架蛋白、纖維小體組分序列信息的披露使得人工設計纖維小體成為可能[57,59]。目前已經有多種設計型的纖維小體實現了體外構建。纖維小體各種配比的纖維素酶組分也可以被有效組裝到骨架蛋白上。構建的設計型纖維小體的總纖維素酶活優(yōu)于單組分纖維素酶[59-62]。目前，設計型纖維小體的體內組裝研究進展相對緩慢，嵌合型纖維小體還無法高效地異源表達。隨著合成生物學與系統(tǒng)生物學在微生物蛋白分泌表達研究上的深入，這一問題最終將會獲得突破[58,63]。

3 木質纖維素發(fā)酵

3.1 酶解發(fā)酵工藝

木質纖維素轉化為燃料乙醇或其他生物基產品主要步驟有：預處理、酶水解、發(fā)酵以及纖維素酶和半纖維素酶的發(fā)酵生產(圖1)。將酶解發(fā)酵各個步驟分開在獨立的反應器中進行，為分步酶解發(fā)酵工藝(SHF)；將酶水解和發(fā)酵整合在同一個反應器進行，為同步酶解發(fā)酵工藝或同步糖化發(fā)酵工藝(SSF)；葡萄糖和木糖共發(fā)酵情況則被稱為同步糖化共發(fā)酵(SSCF)。發(fā)酵產酶、酶解和發(fā)酵3個涉及生物反應的步驟全整合在一個反應器中進行，為統(tǒng)合生物加工(CBP)(圖2)[64]。SSF和SSCF將酶解產物糖及時消耗移除，降低了糖對酶的反饋抑制，同時也減少了染菌機會。由于微生物菌株的生長溫度與酶解的最佳溫度(50 ℃)不同，導致SSF/SSCF一般在30～35 ℃下進行，酶解效率受限[65]。CBP的研究主要集中在酵母體系和梭菌體系。在酵母中表達纖維素酶，或者改造梭菌(如Clostridiumthermocellum)使其既能高效降解木質纖維素，同時還能高效生產乙醇[66]。由于CBP消除了外加酶的需求，同時結合了SSCF的優(yōu)勢，其成本大大降低，被譽為生產木質纖維素乙醇的終極技術。但由于CBP體系過于復雜，目前還沒有菌株能達到CBP工業(yè)化的要求。

圖2 不同酶解發(fā)酵工藝的對比Fig.2 Comparison of different processes for enzymatic hydrolysis and fermentation

3.2 木質纖維素水解液發(fā)酵存在的問題

木質纖維素在酶水解后產生了主要含有葡萄糖和木糖的水解液。水解液通過微生物發(fā)酵可生產乙醇。由于傳統(tǒng)的釀酒酵母不能利用木糖，因此，科學家們通過基因工程改造將木糖代謝途徑導入酵母中，使得釀酒酵母具有發(fā)酵木糖的能力。目前所知的木糖代謝途徑主要有木糖還原酶-木糖醇脫氫酶途徑和木糖異構酶途徑。將這兩個途徑導入釀酒酵母而獲得成功的代表菌種有美國普度大學的Saccharomycescerevisiae424A(LNH-ST) (導入了木糖還原酶-木糖醇脫氫酶途徑)[67]和荷蘭代爾夫特理工大學的SaccharomycescerevisiaeRWB 218(導入了木糖異構酶途徑)[68]。但即使擁有木糖代謝能力的釀酒酵母也通常先利用葡萄糖，葡萄糖利用完后再利用木糖，即糖代謝物阻遏效應(carbon catabolite repression)。釀酒酵母沒有專門的木糖轉運蛋白，木糖轉運入釀酒酵母細胞內需要依靠葡萄糖轉運體系。而葡萄糖轉運蛋白對葡萄糖的親和力要大于對木糖的親和力，從而導致有葡萄糖存在的情況下木糖極少被轉運入細胞內[69]。這也是木糖晚于葡萄糖利用的一個原因。

木質纖維素高濃度水解液中的高濃度抑制物對后期酵母發(fā)酵極為不利，特別是對木糖發(fā)酵的抑制更為明顯[70]?；蚬こ谈脑旌蟮慕湍冈谝掖紖捬醢l(fā)酵條件下，由于還原力或能量供應的不平衡，不能在木糖上生長[71-72]。在利用木質纖維素水解液發(fā)酵過程中，酵母先發(fā)酵利用葡萄糖，待葡萄糖消耗完之后才能利用木糖。因此，發(fā)酵木糖時不僅受預處理抑制物的抑制，同時還受發(fā)酵前期積累乙醇的影響，使木糖發(fā)酵速率大大下降[70]。另外，由于木糖發(fā)酵時酵母停止生長，細胞活力下降，菌體死亡，木糖利用速率會隨之降低，從而導致整體發(fā)酵速率下降。為解決葡萄糖先于木糖發(fā)酵帶來的問題，Jin 等[73]發(fā)明了兩步法SSCF工藝：在SSCF中，先加入半纖維素酶將半纖維素水解釋放出木糖，進而進行木糖發(fā)酵，隨后再加入纖維素酶，水解纖維素釋放出葡萄糖并進行葡萄糖發(fā)酵。SSCF工藝技術使得木糖先于葡萄糖發(fā)酵，避免了葡萄糖發(fā)酵造成的產物抑制。SSCF工藝同時利用發(fā)酵開始時的營養(yǎng)豐富和微氧環(huán)境，大大提升了木糖的發(fā)酵效率。

近年來，隨著基因工程菌的不斷改進以及預處理和發(fā)酵策略的優(yōu)化，木糖的利用率及乙醇產率有了很大的提高。Demeke等[74]構建的釀酒酵母GS1.11-26在小麥秸稈和干草的水解液中發(fā)酵，乙醇的最終產率達到0.48 g/g(以混合糖計)，是最大理論產率的94%。Zhu等[75]使用重組酵母SyBE005對于稀酸預處理的玉米秸稈(不去除抑制劑)進行SSCF，最終乙醇質量濃度達47.2 g/L，產率65.5%。Fujii等[76]利用重組釀酒酵母MA-R4對桉樹水解液進行發(fā)酵，發(fā)酵72 h得到乙醇53.5 g/L，產率82.8%。Qureshi等[77]利用重組釀酒酵母DQ1對干酸法預處理并生物脫毒后的玉米秸稈進行SSCF，最終乙醇質量濃度達71.4 g/L，產率80.3%。Zhu等[78]對玉米秸稈進行氨水預處理，用重組酵母SyBE005進行SSCF，分批補料發(fā)酵，最終乙醇質量濃度為68.8 g/L，產率79.8%，木糖利用率89%。為了提高木糖利用率，提高木糖轉運效率是有效手段之一。Gon?alves等[79]研究了己糖轉運蛋白基因過表達的重組酵母菌株對木糖攝取的影響，獲得的重組酵母菌株DLG-K1T7在完全合成培養(yǎng)基中發(fā)酵72 h，木糖利用率為85%，乙醇的最終產率為0.38 g/g。此外，利用兩種不同功能的菌株共培養(yǎng)也顯示出其獨特的優(yōu)勢。Zhang等[80]利用可降解纖維素的重組釀酒酵母BY4743和可降解木聚糖的重組巴斯德畢赤酵母GS115共培養(yǎng)，進行葡萄糖/木糖共發(fā)酵，在不添加水解酶情況下，發(fā)酵預處理小麥秸稈80 h后乙醇質量濃度達32.6 g/L，達到理論產率的82.6%。Zhu等[81]通過木糖利用釀酒酵母CGMCC NO.6634和抑制物耐受酵母CGMCC No.2757共培養(yǎng)發(fā)酵玉米秸稈干酸預處理后的水解物(不除去抑制物)，通過SSCF發(fā)酵120 h，最終乙醇質量濃度達70.2 g/L，產率89.0%。

3.3 合成生物學和系統(tǒng)生物學促進木質纖維素乙醇的發(fā)展

預處理過程中產生的抑制物(如糠醛、羥甲基糠醛和乙酸等)和高濃度的產物如乙醇等對微生物的發(fā)酵產生了負面影響[82]，從而使以木糖為代表的戊糖發(fā)酵受到抑制。因此，實現木質纖維素的高效煉制需要使微生物既能同步高效發(fā)酵己糖和戊糖，又能提升對水解抑制物和發(fā)酵產物的耐受能力。

由于微生物在糖利用和抗逆性方面涉及基因、蛋白、調控因子和應激行為等多個層面，很難通過簡單的基因工程或代謝工程改造實現微生物發(fā)酵性能的完美提升[83]?；诖x工程的適應性進化工程可使微生物迅速獲得優(yōu)異表型，但是存在基因靶點不清楚、負突變干擾等問題[84-85]。多組學技術的發(fā)展為進化工程打開了全新視角，也為反向代謝工程提供了可靠的靶點[82]。另外，系統(tǒng)生物學和合成生物學提升了人們對于微生物生理、代謝過程的綜合認識，了解了代謝途徑之間相互作用及其調控網絡的復雜性。利用復雜代謝網絡的精確計算機模擬，可以通過改變最少的基因，來獲得最優(yōu)化生長或者在特定條件下生產某一產品的能力[86]。系統(tǒng)地整合微生物組學數據、基因表達譜、蛋白質組學以及代謝組學的全新策略，使研究者對細胞代謝的研究更加深入，從而可對菌株進行理性設計。合成生物學提供的新工具可以將廣泛的遺傳多樣性引入到同一個微生物宿主中，再結合選育、高通量篩選技術、適應性進化，從而完成一系列遺傳改造，實現優(yōu)化生物過程工程的目標[87-88]。因此，合成生物學和系統(tǒng)生物學為構建利用木質纖維素水解液發(fā)酵高效菌株提供了系統(tǒng)性的技術支撐。

4 木質素的生物降解轉化

木質纖維素生物煉制過程中的纖維素和半纖維素降解轉化后，殘留的木質素常進行燃燒產熱發(fā)電。近幾年來，木質素的生物轉化利用也引起了領域內的普遍關注。木質素是一種復雜的酚類聚合物，其在自然界中的降解是一個緩慢的過程，基本都是由氧氣參與的氧化反應[89-91]。木質素的降解過程中，一些好氧真菌和好氧細菌起著至關重要的作用[50]?？梢越到饽举|素的真菌屬于擔子菌(如白腐真菌的Phanerochaetechrysosporium和褐腐真菌的Postiaplacenta,Gloeophyllumtrabeum)、子囊菌以及半知菌(如軟腐真菌的Daldiniaconcentric)[89-90,50,92]。

白腐真菌可以分泌多種胞外木質素酶(如木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶) 深度降解木質素，白腐真菌相比褐腐真菌和軟腐真菌具有較強的降解木質素能力，部分白腐真菌(如Trametesversicolor) 無選擇性地降解木質纖維素中的木質素、纖維素和半纖維素，有些白腐真菌先選擇性地降解利用木質素，然后再降解利用纖維素和半纖維素，還有一部分白腐真菌 (如Phellinusnigrolimitatus) 只降解利用木質素[89,93]。在木質素被白腐真菌降解的過程中，木質素單體的丙酸側鏈和芳香環(huán)被氧化切斷，芳香環(huán)上的甲基也被脫去[92]。褐腐真菌主要降解木質纖維素中的纖維素和半纖維素，對木質素的修飾只局限于去甲基化、部分氧化及降低木質素的聚合度。褐腐真菌對木質素的這些修飾主要通過鐵和氧化還原中介物進行芬頓反應[94]。一些軟腐真菌，如Daldiniaconcentrica，可以深度降解木質素，但降解效率低于白腐真菌[89-90]。另外，白腐真菌不能降解愈創(chuàng)木基木質素[89]。

細菌中，屬于放線菌的鏈霉菌屬具有部分降解木質素的能力[89]，這些細菌能分泌木質素降解酶，如胞外過氧化物酶、過氧化氫酶和苯酚氧化酶[89,95-96]，將木質素降解為水溶性的可被酸沉淀的木質素片段[97]，其中有Cɑ—Cβ鍵的切斷、去甲基化和Cα的氧化[89]。其他細菌的木質素降解能力比鏈霉菌弱，只能通過胞內酶降解低分子量的木質素，其中以假單胞菌(Pseudomonas)降解能力最強[89,98]。另外，紅球菌屬(Rhodococcus)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、鞘脂菌屬(Sphingobium)、芽孢桿菌屬(Bacillum)、無色菌屬(Achromobacter)、貪銅菌屬(Cupriavidus)和平革菌屬(Phanerochaete)也被發(fā)現具有降解芳香族化合物的能力[50]。

木質素降解酶(通常為胞外酶)主要包括木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶以及漆酶[90,99]。木質素過氧化物酶和錳過氧化物酶是亞鐵血紅素過氧化物酶，具有高的氧化還原電勢，而漆酶是含銅的氧化酶，氧化還原電勢較低[99]。木質素過氧化物酶的底物特異性差，能與不同種類的木質素化合物反應。錳過氧化物酶主要氧化酚類底物，而不能與非酚類的木質素化合物反應。在沒有脂肪酸存在的情況下，錳過氧化物酶也能氧化非酚類木質素化合物[100]。漆酶在沒有中介物的情況下只氧化酚類化合物。在中介物 (如2,2’-azinobis (3-e t h y l b e n z t h i a z o l i n e-5-sulphonate) 和1-hydroxybenzotriazole) 存在時，漆酶也能氧化難降解的非酚類化合物[89,101]。白腐真菌的次級代謝產物藜蘆基醇能加強木質素過氧化物酶的反應[102]。木質素過氧化物酶作用于木質素時，產生正離子自由基，從而引發(fā)各種各樣的反應，例如Cɑ—Cβ鍵的切斷和開環(huán)反應。錳過氧化物酶和漆酶作用于木質素時產生含苯氧基的自由基，引起諸如Cɑ—Cβ鍵的切斷、去甲基化、烷基-苯基斷裂和Cɑ氧化等反應[103]。白腐真菌能分泌木質素過氧化物酶、錳過氧化物酶以及漆酶[90]。但木質素高效降解菌P.chrysosporium卻不能分泌漆酶[91]。

木質素降解菌或木質素降解酶可用于生物法去除原料中的木質素[104-105]。另外，木質素降解微生物還可用于轉化木質素生產燃料和化學品[50,98,106-107]。比如,Sainsbury 等[106]改造了RhodococcusjostiiRHA1，使其能從木質素中制取香草醛。Lin 等[108]系統(tǒng)改造了Pseudomonasputida，使其能高效降解木質素生產生物塑料PHA。

5 展望

燃料乙醇是木質纖維素生物煉制最容易產業(yè)化的大宗產品之一。雖然目前的低油價對木質纖維素燃料乙醇的發(fā)展造成了一定的沖擊，美國能源部在不久前依然宣布繼續(xù)資助2007年成立的四大生物能源研究中心。2017年9月，國家發(fā)改委、國家能源局、財政部等十五部門聯合印發(fā)了《關于擴大生物燃料乙醇生產和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》，該方案為推進纖維素乙醇在2025年實現規(guī)?；a提供了政策支撐。這些均顯示了世界主要經濟體對木質纖維素生物煉制的信心。我國目前年產7～9億t農作物秸稈，其中有一半以上不能被綜合利用，甚至被直接焚燒在農田里，造成了嚴重的環(huán)境污染。因此，木質纖維素的生物煉制對于提高生物質的綜合利用，以及保護環(huán)境、保障能源安全和人類社會的可持續(xù)發(fā)展等具有重要意義。

[1] 石元春.中國生物質原料資源[J].中國工程科學,2011,13(2):16-23.

[2] ROY P,DIAS G.Prospects for pyrolysis technologies in the bioenergy sector:a review[J].Renew Sustainable Energy Rev,2017,77:59-69.

[3] LI C,ASTON J E,LACEY J A,et al.Impact of feedstock quality and variation on biochemical and thermochemical conversion[J].Renew Sustainable Energy Rev,2016,65:525-536.

[4] RICHARDSON Y,BLIN J,JULBE A.A short overview on purification and conditioning of syngas produced by biomass gasification:catalytic strategies,process intensification and new concepts[J].Prog Energy Combust Sci,2012,38:765-781.

[5] NIGAM P S,SINGH A.Production of liquid biofuels from renewable resources[J].Prog Energy Combust Sci,2011,37:52-68.

[6] LYND L R,WEIMER P J,VAN ZYL W H,et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology[J].Microbiol Mol Biol Rev,2002,66:506-577.

[7] 郭孝孝,羅虎,鄧立康.全球燃料乙醇行業(yè)進展[J].當代化工,2016,45(9):2244-2248.

[8] LYND L R,LIANG X,BIDDY M J,et al.Cellulosic ethanol:status and innovation[J].Curr Opin Biotechnol,2017,45:202-211.

[9] HONG K K,NIELSEN J.Metabolic engineering ofSaccharomycescerevisiae:a key cell factory platform for future biorefineries[J].Cell Mol Life Sci,2012,69:2671-2690.

[10] AGBOR V B,CICEK N,SPARLING R,et al.Biomass pretreatment:fundamentals toward application[J].Biotechnol Adv,2011,29:675-685.

[11] ALVIRA P,TOMS-PEJE,BALLESTEROS M J,et al.Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis:a review[J].Bioresour Technol,2010,101:4851-4861.

[12] CARA C,MOYA M,BALLESTEROS I,et al.Influence of solid loading on enzymatic hydrolysis of steam exploded or liquid hot water pretreated olive tree biomass[J].Process Biochem,2007,42:1003-1009.

[13] KARIMI K,TAHERZADEH M J.A critical review on analysis in pretreatment of lignocelluloses:degree of polymerization,adsorption/desorption,and accessibility[J].Bioresour Technol,2016,203:348-356.

[14] HAYES D J.An examination of biorefining processes,catalysts and challenges[J].Catal Today,2009,145:138-151.

[15] J?NSSON L J,MARTN C.Pretreatment of lignocellulose:formation of inhibitory by-products and strategies for minimizing their effects[J].Bioresour Technol,2016,199:103-112.

[16] QING Q,YANG B,WYMAN C E.Xylooligomers are strong inhibitors of cellulose hydrolysis by enzymes[J].Bioresour Technol,2010,101:9624-9630.

[17] TADESSE H,LUQUE R.Advances on biomass pretreatment using ionic liquids:an overview[J].Energy Environ Sci,2011,4:3913-3929.

[18] KANG Y,BANSAL P,REALFF M J,et al.SO2-catalyzed steam explosion:the effects of different severity on digestibility,accessibility,and crystallinity of lignocellulosic biomass[J].Biotechnol Prog,2013,29:909-916.

[19] LI J,GELLERSTEDT G,TOVEN K.Steam explosion lignins; their extraction,structure and potential as feedstock for biodiesel and chemicals[J].Bioresour Technol,2009,100:2556-2561.

[20] SHEN F,SADDLER J N,LIU R,et al.Evaluation of steam pretreatment on sweet sorghum bagasse for enzymatic hydrolysis and bioethanol production[J].Carbohydr Polym,2011,86:1542-1548.

[21] CANTARELLA M,CANTARELLA L,ALBERTO GALLIFUOCO A S,et al.Effect of inhibitors released during steam-explosion treatment of poplar wood on subsequent enzymatic hydrolysis and SSF[J].Biotechnol Prog,2004,20:200-206.

[22] LI H,CHEN H.Detoxification of steam-exploded corn straw produced by an industrial-scale reactor[J].Process Biochem,2008,43:1447-1451.

[23] CHUNDAWAT S P S,VISMEH R,SHARMA L N,et al.Multifaceted characterization of cell wall decomposition products formed during ammonia fiber expansion (AFEX) and dilute acid based pretreatments[J].Bioresour Technol,2010,101:8429-8438.

[24] LAU M W,BALS B D,CHUNDAWAT S P S,et al.An integrated paradigm for cellulosic biorefineries:utilization of lignocellulosic biomass as self-sufficient feedstocks for fuel,food precursors and saccharolytic enzyme production[J].Energy Environ Sci,2012,5:7100-7110.

[25] AGBOR V B,CICEK N,SPARLING R,et al.Biomass pretreatment:fundamentals toward application[J].Biotechnol Adv,2011,29:675-685.

[26] NGUYEN T Y,CAI C M,KUMAR R,et al.Co-solvent pretreatment reduces costly enzyme requirements for high sugar and ethanol yields from lignocellulosic biomass[J].ChemSusChem,2015,8:1716-1725.

[27] NGUYEN T Y,CAI C M,OSMAN O,et al.CELF pretreatment of corn stover boosts ethanol titers and yields from high solids SSF with low enzyme loadings[J].Green Chem,2016,18:1581-1589.

[28] LI X,LUO X,LI K,et al.Effects of SPORL and dilute acid pretreatment on substrate morphology,cell physical and chemical wall structures,and subsequent enzymatic hydrolysis of lodgepole pine[J].Appl Biochem Biotechnol,2012,168:1556-1567.

[29] WANG G S,PAN X J,ZHU J Y,et al.Sulfite pretreatment to overcome recalcitrance of lignocellulose (SPORL) for robust enzymatic saccharification of hardwoods[J].Biotechnol Prog,2009,25:1086-1093.

[30] ZHANG D S,YANG Q,ZHU J Y,et al.Sulfite (SPORL) pretreatment of switchgrass for enzymatic saccharification[J].Bioresour Technol,2013,129:127-134.

[31] ZHANG L,PU Y,CORT J R,et al.Revealing the molecular structural transformation of hardwood and softwood in dilute acid flowthrough pretreatment[J].ACS Sustainable Chem Eng,2016,4:6618-6628.

[32] ALIZADEH H,TEYMOURI F,GILBERT T I,et al.Pretreatment of switchgrass by ammonia fiber explosion (AFEX)[J].Appl Biochem Biotechnol,2005,121:1133-1141.

[33] BIAN H,CHEN L,GLEISNER R,et al.Producing wood-based nanomaterials by rapid fractionation of wood at 80 ℃ using a recyclable acid hydrotrope[J].Green Chem,2017,19:3370-3379.

[34] CHEN L,DOU J,MA Q,LI N,et al.Rapid and near-complete dissolution of wood lignin at≤ 80 ℃ by a recyclable acid hydrotrope[J].Sci Adv,2017,3(9):e1701735.

[35] TAHERZADEH M J,KARIMI K.Enzyme-based hydrolysis processes for ethanol from lignocellulosic materials:a review[J].BioResources,2007,2:707-738.

[36] KHARE S K,PANDEY A,LARROCHE C.Current perspectives in enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass[J].Biochem Eng J,2015,102:38-44.

[37] GAO D,CHUNDAWAT S P S,KRISHNAN C,et al.Mixture optimization of six core glycosyl hydrolases for maximizing saccharification of ammonia fiber expansion (AFEX) pretreated corn stover[J].Bioresour Technol,2010,101:2770-2781.

[38] LI X,ZHENG Y.Lignin-enzyme interaction:mechanism,mitigation approach,modeling,and research prospects[J].Biotechnol Adv,2017,35:466-489.

[39] OLIVA-TARAVILLA A,TOMAS-PEJO E,DEMUEZ M,et al.Phenols and lignin:key players in reducing enzymatic hydrolysis yields of steam-pretreated biomass in presence of laccase[J].J Biotechnol,2016,218:94-101.

[40] KRISTENSEN J B,FELBY C,J?RGENSEN H.Yield-determining factors in high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose[J].Biotechnol Biofuels,2009,2:11.

[41] HUMPULA J F,UPPUGUNDLA N,VISMEH R,et al.Probing the nature of AFEX-pretreated corn stover derived decomposition products that inhibit cellulase activity[J].Bioresour Technol,2014,152:38-45.

[42] HODGE D B,KARIM M N,SCHELL D J,et al.Soluble and insoluble solids contributions to high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose[J].Bioresour Technol,2008,99:8940-8948.

[43] JIN M,SARKS C,BALS B D,et al.Toward high solids loading process for lignocellulosic biofuel production at a low cost[J].Biotechnol Bioeng,2017,114:980-989.

[44] HUMBIRD D,DAVIS R,TAO L,et al.Process design and economics for biochemical conversion of lignocellulosic biomass to ethanol:dilute-acid pretreatment and enzymatic hydrolysis of corn stover [R/OL].[2017-08-22].https://www.nrel.gov/docs/fy11osti/47764.pdf.

[45] SOUSA L D C,JIN M,CHUNDAWAT S P S,et al.Next-generation ammonia pretreatment enhances cellulosic biofuel production[J].Energy Environ Sci,2016,9:1215-1223.

[46] JIN M,GUNAWAN C,UPPUGUNDLA N,et al.A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity,enzyme recycling,and yeast cells reuse[J].Energy Environ Sci,2012,5:7168-7175.

[47] JIN M,SOUSA L D C,SCHWARTZ C,et al.Toward lower cost cellulosic biofuel production using ammonia based pretreatment technologies[J].Green Chem,2016,18:957-966.

[48] LIU G,QIN Y,LI Z,et al.Development of highly efficient,low-cost lignocellulolytic enzyme systems in the post-genomic era[J].Biotechnol Adv,2013,31:962-975.

[49] MEWIS K,TAUPP M,HALLAM S J.A high throughput screen for biomining cellulase activity from metagenomic libraries[J].J Vis Exp,2011(48):489-495.

[50] XIE S,SYRENNE R,SUN S,et al.Exploration of natural biomass utilization systems (NBUS) for advanced biofuel:from systems biology to synthetic design[J].Curr Opin Biotechnol,2014,27:195-203.

[51] ILMBERGER N,STREIT W R.Screening for cellulase encoding clones in metagenomic libraries[J].Methods Mol Biol,2017,1539:205-217.

[52] NIMCHUA T,THONGARAM T,UENGWETWANIT T,et al.Metagenomic analysis of novel lignocellulose-degrading enzymes from higher termite guts inhabiting microbes[J].J Microbiol Biotechnol,2012,22:462-469.

[53] RASHAMUSE K,TENDAI W S,MATHIBA K,et al.Metagenomic mining of glycoside hydrolases from the hindgut bacterial symbionts of a termite (Trinervitermestrinervoides) and the characterization of a multimodular beta-1,4-xylanase(GH11)[J].Biotechnol Appl Biochem,2017,64:174-186.

[54] WANG C,DONG D,WANG H,MUELLER K,et al.Metagenomic analysis of microbial consortia enriched from compost:new insights into the role ofActinobacteriain lignocellulose decomposition[J].Biotechnol Biofuels,2016,9:22.

[55] ZHU N,YANG J,JI L,et al.Metagenomic and metaproteomic analyses of a corn stover-adapted microbial consortium EMSD5 reveal its taxonomic and enzymatic basis for degrading lignocellulose[J].Biotechnol Biofuels,2016,9:243.

[56] LIANG J,LIN Y,LI T,et al.Microbial consortium OEM1 cultivation for higher lignocellulose degradation and chlorophenol removal[J].RSC Adv,2017,7:39011-39017.

[57] STERN J,KAHN A,VAZANA Y,et al.Significance of relative position of cellulases in designer cellulosomes for optimized cellulolysis[J].PloS ONE,2015,10(5):e0127326.

[58] BAYER E A.Cellulosomes and designer cellulosomes:why toy with Nature?[J].Environ Microbiol Rep,2017,9(1):14-15.

[59] VAZANA Y,MORA?S S,BARAK Y,et al.Designer cellulosomes for enhanced hydrolysis of cellulosic substrates[J].Methods Enzymol,2012,510:429-452.

[60] HENDRIX J,FRIED D,BARAK Y,et al.Conformational dynamics in designer cellulosomes studied by single-pair fret with Mfd-pie[J].Biophys J,2013,104:19a.

[61] MORAIS S,MORAG E,BARAK Y,et al.Deconstruction of lignocellulose into soluble sugars by native and designer cellulosomes[J].MBio,2012,3(6):214104.

[62] ARFI Y,SHAMSHOUM M,ROGACHEV I,et al.Integration of bacterial lytic polysaccharide monooxygenases into designer cellulosomes promotes enhanced cellulose degradation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111:9109-9114.

[63] TANAKA T,KONDO A.Cell-surface display of enzymes by the yeastSaccharomycescerevisiaefor synthetic biology[J].FEMS Yeast Res,2015,15(1):1-9.

[64] LYND L R.Overview and evaluation of fuel ethanol from cellulosic biomass:technology,economics,the environment,and policy[J].Annu Rev Energy Environ,1996,21:403-465.

[65] JIN M,SARKS C,GUNAWAN C,et al.Phenotypic selection of a wildSaccharomycescerevisiaestrain for simultaneous saccharification and co-fermentation of AFEX (TM) pretreated corn stover[J].Biotechnol Biofuels,2013,6:108.

[66] OLSON D G,MCBRIDE J E,JOE SHAW A,et al.Recent progress in consolidated bioprocessing[J].Curr Opin Biotechnol,2012,23:396-405.

[67] SEDLAK M,HO N W Y.Production of ethanol from cellulosic biomass hydrolysates using genetically engineeredSaccharomycesyeast capable of cofermenting glucose and xylose[J].Appl Biochem Biotechnol,2004,113:403-416.

[68] KUYPER M,TOIRKENS M J,DIDERICH J A,et al.Evolutionary engineering of mixed sugar utilization by a xylose fermentingSaccharomycescerevisiaestrain[J].FEMS Yeast Res,2005,5(10):925-934.

[69] BERTILSSON M,ANDERSSON J,LIDEN G.Modeling simultaneous glucose and xylose uptake inSaccharomycescerevisiaefrom kinetics and gene expression of sugar transporters[J].Bioprocess Biosyst Eng,2008,31:369-377.

[70] JIN M,BALAN V,GUNAWAN C,et al.Quantitatively understanding reduced xylose fermentation performance in AFEX TM treated corn stover hydrolysate usingSaccharomycescerevisiae424A (LNH-ST) andEscherichiacoliKO11[J].Bioresour Technol,2012,111:294-300.

[71] KUYPER M,WINKLER A A,DIJKEN J P,et al.Minimal metabolic engineering ofSaccharomycescerevisiaefor efficient anaerobic xylose fermentation:a proof of principle[J].FEMS Yeast Res,2004,4(6):655-664.

[72] KUYPER M,HARTOG M M P,TOIRKENS M J,et al.Metabolic engineering of a xylose-isomerase-expressingSaccharomycescerevisiaestrain for rapid anaerobic xylose fermentation[J].FEMS Yeast Res,2005,5(4/5):399-409.

[73] JIN M,LAU M W,BALAN V,et al.Two-step SSCF to convert AFEX-treated switchgrass to ethanol using commercial enzymes andSaccharomycescerevisiae424A(LNH-ST)[J].Bioresour Technol,2010,101:8171-8178.

[74] DEMEKE M M,DIETZ H,LI Y,et al.Development of a D-xylose fermenting and inhibitor tolerant industrialSaccharomycescerevisiaestrain with high performance in lignocellulose hydrolysates using metabolic and evolutionary engineering[J].Biotechnol Biofuels,2013,6:89.

[75] ZHU J Q,QIN L,LI W C,et al.Simultaneous saccharification and co-fermentation of dry diluted acid pretreated corn stover at high dry matter loading:overcoming the inhibitors by non-tolerant yeast[J].Bioresour Technol,2015,198:39-46.

[76] FUJII T,MURAKAMI K,ENDO T,et al.Bench-scale bioethanol production from eucalyptus by high solid saccharification and glucose/xylose fermentation method[J].Bioprocess Biosyst Eng,2014,37:749-754.

[77] QURESHI A S,ZHANG J,BAO J.High ethanol fermentation performance of the dry dilute acid pretreated corn stover by an evolutionarily adaptedSaccharomycescerevisiaestrain[J].Bioresour Technol,2015,189:399-404.

[78] ZHU J Q,QIN L,LI B Z,et al.Simultaneous saccharification and co-fermentation of aqueous ammonia pretreated corn stover with an engineeredSaccharomycescerevisiaeSyBE005[J].Bioresour Technol,2014,169:9-18.

[79] GONCALVES D L,MATSUSHIKA A,BELISA B,et al.Xylose and xylose/glucose co-fermentation by recombinantSaccharomycescerevisiaestrains expressing individual hexose transporters[J].Enzyme Microb Technol,2014,63:13-20.

[80] ZHANG Y,WANG C,WANG L,et al.Direct bioethanol production from wheat straw using xylose/glucose co-fermentation by co-culture of two recombinant yeasts[J].J Ind Microbiol Biotechnol,2017,44:453-464.

[81] ZHU J Q,LI X,QIN L,et al.In situ detoxification of dry dilute acid pretreated corn stover by co-culture of xylose-utilizing and inhibitor-tolerantSaccharomycescerevisiaeincreases ethanol production[J].Bioresour Technol,2016,218:380-387.

[82] DOS SANTOS S C,SA-CORREIA I.Yeast toxicogenomics:lessons from a eukaryotic cell model and cell factory[J].Curr Opin Biotechnol,2015,33:183-191.

[83] FU Y,CHEN L,ZHANG W.Regulatory mechanisms related to biofuel tolerance in producing microbes[J].J Appl Microbiol,2016,121:320-332.

[84] DRAGOSITS M,MATTANOVICH D.Adaptive laboratory evolution:principles and applications for biotechnology[J].Microb Cell Fact,2013,12(1):64.

[85] FARWICK A,BRUDER S,SCHADEWEG V,et al.Engineering of yeast hexose transporters to transport D-xylose without inhibition by D-glucose[J].Proc Natl Acad Sci USA,2014,111(14):5159-5164.

[86] KING Z A,LLOYD C J,FEIST A M,et al.Next-generation genome-scale models for metabolic engineering[J].Curr Opin Biotechnol,2015,35:23-29.

[87] BASSALO M C,LIU R,GILL R T.Directed evolution and synthetic biology applications to microbial systems[J].Curr Opin Biotechnol,2016,39:126-133.

[88] GHIM C M,KIM T,MITCHELL R J,et al.Synthetic biology for biofuels:building designer microbes from the scratch[J].Biotechnol Bioprocess Eng,2010,15:11-21.

[89] ERIKSSON K E L,BLANCHETTE R A,ANDER P.Biodegradation of lignin[M]// Microbial and enzymatic degradation of wood and wood components.Springer Series in Wood Science.Berlin:Springer-Verlag,1990.

[90] REID I D.Biodegradation of lignin[J].Can J Bot,1995,73:1011-1018.

[91] KIRK T K,FARRELL R L.Enzymatic "combustion":the microbial degradation of lignin[J].Annu Rev Microbiol,1987,41(1):465-505.

[92] GEIB S M,FILLEY T R,HATCHER P G,et al.Lignin degradation in wood-feeding insects[J].Proc Natl Acad Sci USA,2008,105:12932-12937.

[93] BLANCHETTE R A.Degradation of the lignocellulose complex in wood[J].Can J Bot,1995,73:999-1010.

[94] WONG D W.Structure and action mechanism of ligninolytic enzymes[J].Appl Biochem Biotechnol,2009,157:174-209.

[95] GODDEN B,BALL A S,HELVENSTEIN P,et al.Towards elucidation of the lignin degradation pathway in actinomycetes[J].J Gen Microbiol,1992,138:2441-2448.

[96] ZIMMERMAN W,UMEZAWA T,BRODA P,et al.Degradation of a non-phenolic arylglycerolβ-aryl ether byStreptomycescyaneus[J].FEBS Lett,1988,239:5-7.

[97] SUTHERLAND J B,CRAWFORD D L,POMETTO III A L.Metabolism of cinnamic,p-coumaric,and ferulic acids byStreptomycessetonii[J].Can J Microbiol,1983,29:1253-1257.

[98] NIKEL P I,MARTíNEZ-GARCA E,DE LORENZO V.Biotechnological domestication of pseudomonads using synthetic biology[J].Nat Rev Microbiol,2014,12:368-379.

[100] KIRK T K,CULLEN D.Enzymology and molecular genetics of wood degradation by white-rot fungi[M]//YOUNG R A,AKHTAR M.Environmentally friendly technologies for the pulp and paper industry.New York:John Wiley & Sons,Inc.,1998:273-307.

[101] BOURBONNAIS R,PAICE M G.Oxidation of non-phenolic substrates:an expanded role for laccase in lignin biodegradation[J].FEBS Lett,1990,267:99-102.

[102] HAMMEL K E,JENSEN K,MOZUCH M D,et al.Ligninolysis by a purified lignin peroxidase[J].J Biol Chem,1993,268:12274-12281.

[103] TUOR U,WARIISHI H,SCHOEMAKER H E,et al.Oxidation of phenolic arylglycerolβ-aryl ether lignin model compounds by manganese peroxidase fromPhanerochaetechrysosporium:oxidative cleavage of anα-carbonyl model compound[J].Biochemistry,1992,31:4986-4995.

[104] WANG F Q,XIE H,CHEN W,et al.Biological pretreatment of corn stover with ligninolytic enzyme for high efficient enzymatic hydrolysis[J].Bioresour Technol,2013,144:572-578.

[105] SONG L,MA F,ZENG Y,et al.The promoting effects of manganese on biological pretreatment withIrpexlacteusand enzymatic hydrolysis of corn stover[J].Bioresour Technol,2013,135:9-92.

[106] SAINSBURY P D,HARDIMAN E M,AHMAD M,et al.Breaking down lignin to high-value chemicals:the conversion of lignocellulose to vanillin in a gene deletion mutant ofRhodococcusjostiiRHA1[J].ACS Chem Biol,2013,8:2151-2156.

[107] POBLETE-CASTRO I,BECKER J,DOHNT K,et al.Industrial biotechnology ofPseudomonasputidaand related species[J].Appl Microbol Biotechnol,2012,93:2279-2290.

[108] LIN L,CHENG Y B,PU Y Q,et al.Systems biology-guided biodesign of consolidated lignin conversion[J].Green Chem,2016,18:5536-5547.

(責任編輯 荀志金)

Researchprogressinbiorefineryoflignocellulosicbiomass

LIN Hailong

(SDIC Biotechnology Investment Co. Ltd.,Beijing 100034,China)

Lignocellulose is an abundant and renewable biomass that is mainly composed of cellulose,hemicellulose and lignin.The utilization of lignocellulosic biomass has attracted worldwide attention.This article reviews the biochemical route of lignocellulosic biomass refinery for bioproducts production (using bio-ethanol as an example) and the remaining challenges.This article also discussed the bioconversion of lignin,which is economically critical for a biorefinery.The application of synthetic biology technologies in biorefinery field is also reviewed aiming to give insights into aspects of biorefinery research and provide suggestions for future research.

lignocellulosic biomass; fuel ethanol; biorefinery; lignin biodegradation

10.3969/j.issn.1672-3678.2017.06.007

2017-08-23

林海龍(1976—)，男，福建福州人，博士，高級工程師，研究方向：燃料乙醇，E-mail：linhailong@sdic.com.cn

TQ9；X71

A

1672-3678(2017)06-0044-11