丁雯瑾，孫 超，桑玉爾，陳梅梅，范建高，袁 濤

環(huán)境新興污染物雙酚A暴露加重非酒精性脂肪性肝病大鼠脂質(zhì)代謝異常*

丁雯瑾，孫 超，桑玉爾，陳梅梅，范建高，袁 濤

目的探討在非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）背景下新興環(huán)境污染物雙酚A（BPA）對機(jī)體脂質(zhì)代謝的影響。方法將18只SD大鼠隨機(jī)分為正常飲食組、高脂飲食（NAFLD）組和NAFLD/BPA處理組，飼養(yǎng)12 w。采用Western blot法檢測血清和肝組織脂代謝相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果NAFLD組和NAFLD/BPA組肝質(zhì)量分別為（20.5±2.8）g和（20.9±1.9）g、體質(zhì)量為（500.1±19.1）g和（511.1±20.5）g、血清甘油三酯分別為（2.5±0.5）mmol/L 和（2.8±0.9）mmol/L、膽固醇為（2.4±0.7）mmol/L 和（2.8±0.6）mmol/L，游離脂肪酸（FFA）分別為（578.6±48.7）mmol/L 和（602.2±50.3）mmol/L，均顯著高于正常組【（15.2±2.3）g、（432.5±13.2）g、（2.0±0.8）mmol/L、（1.0±0.6）mmol/L 和（487.4±14.9）mmol/L，P＜0.05】；與正常組比，NAFLD 組和NAFLD/BPA 組肝組織脂肪酸合成酶（FAS）分別上調(diào)了2.45倍和1.91倍，靶基因乙酰輔酶A合成酶（ACS）蛋白表達(dá)量分別下降了1.54倍和1.5倍（P＜0.05）。結(jié)論BPA的長期攝入可加重機(jī)體肥胖，促進(jìn)血脂異常。

非酒精性脂肪性肝病；雙酚A；脂質(zhì)代謝；大鼠

雙酚A（bisphenol A，BPA）、鄰苯二甲酸酯和烷基酚是一類新興環(huán)境污染物，亦稱環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，世界衛(wèi)生組織將其定義為：能使內(nèi)分泌功能發(fā)生變化，從而對個體及子孫或者群體產(chǎn)生有害影響的外因性化學(xué)物質(zhì)或混合物[1-3]。BPA是世界上使用最廣泛的工業(yè)化合物之一，不僅產(chǎn)生量大，而且人群暴露途徑多樣，因此對健康的影響較大，而對其研究相對薄弱。有研究證實BPA可以模擬雌激素效應(yīng)，引起人體內(nèi)分泌系統(tǒng)功能紊亂，與代謝性疾病、生殖系統(tǒng)疾病和性激素依賴性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[4-7]。成年人暴露于BPA后患肥胖、2型糖尿病及心臟病的幾率增加[8]。國內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查也發(fā)現(xiàn)中老年人尿BPA濃度與全身型肥胖、腹型肥胖和胰島素抵抗（insulin resistance，IR）呈正相關(guān)[9]。非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發(fā)病機(jī)制尚不明確，通常認(rèn)為與肥胖、IR、脂質(zhì)紊亂、2型糖尿病和心血管疾病有關(guān)。本研究通過建立NAFLD動物模型，研究長期低劑量BPA暴露大鼠肝組織類固醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，SREBP）表達(dá)的變化，以探討在脂肪肝背景下環(huán)境新興污染物BPA與脂質(zhì)代謝的關(guān)聯(lián)，為NAFLD的防治研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、儀器和試劑 4周齡SPF級雄性SD大鼠購自中國科學(xué)院上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司【生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2007-0005】，飼養(yǎng)于清潔級動物房。大鼠飼養(yǎng)實驗室溫度為23±2℃，濕度為50±10%。實行12/12h循環(huán)光線控制。自由攝取食物和水。檢測血甘油三酯（TC）、總膽固醇（TG）和游離脂肪酸（FFA）試劑盒（美國Cell biolabs公司），抗脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）單克隆抗體（美國Santa公司，批號sc-55580），抗靶基因乙酰輔酶A合成酶（anti-acetyl CoA synthetase，ACS）兔多克隆抗體（美國 Abcam公司，批號 ab66038）、抗 SREBP裂解活化蛋白SCP、抗位點(diǎn)1蛋白水解酶（S1P）和抗位點(diǎn)2蛋白水解酶（S2P）兔多克隆抗體（美國Abcam公司，批號分別為 ab140592、ab175191和 ab189797），BPA（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑上海有限公司，將其溶解于DMSO中，終濃度不超過1%）。

1.2 動物模型的建立 動物實驗經(jīng)上海交通大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)并按其實驗動物規(guī)范進(jìn)行。適應(yīng)性飼養(yǎng)大鼠1 w，隨機(jī)分為正常飲食（ND）組、高脂飲食（HFD，88%普通飼料/10%豬油/2%膽固醇）組和高脂飲食/BPA（HFD/BPA）組，每組6只。讓大鼠經(jīng)飲水?dāng)z入BPA，為保證飲水中BPA含量（100 nmol/l），每2 d換水一次。在第12 w末，處死大鼠后稱量體質(zhì)量。取出肝臟，稱量質(zhì)量，計算肝指數(shù)（＝肝濕質(zhì)量/體質(zhì)量×100%）。

1.3 指標(biāo)測定 常規(guī)檢測血TC、TG和FFA水平；采用Western blot法檢測肝組織 FAS、ACS、SCP、S1P 和 S2P 蛋白表達(dá)：取肝組織，提取總蛋白，蛋白上樣量為50 μg，內(nèi)參為GAPDH；加樣后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，待蛋白分離后，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入 PBST 稀釋的抗 FAS（1：1000）、抗 ACS（1：1000）、抗SCP1（1：1000）、抗 S1P（1：1000）和抗 GAPDH（1：5000）4℃孵育過夜。次日，用PBST洗膜5 min×3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1：3000），室溫孵育 1 h。PBST 洗膜10 min×3次，置膜于暗處，待出現(xiàn)亮條帶，取出膜，甩去多余的液體，用保鮮PVDF膜包好，暗室中用X膠片感光、顯影、定影。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料以（±s）表示，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量的比較 NAFLD組和NAFLD/BPA組大鼠體質(zhì)量和肝質(zhì)量明顯重于正常組（P＜0.05），而NAFLD/BPA 組與NAFLD 組比，無顯著差異（P＞0.05，表1）。

表1 大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量與肝指數(shù)（±s）的比較

表1 大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量與肝指數(shù)（±s）的比較

與正常組比，①P＜0.05，②P＜0.01

只 肝質(zhì)量（g） 體質(zhì)量（g） 肝指數(shù)正常組 6 15.2±2.3 432.5±13.2 3.5±0.5 NAFLD 6 20.5±2.8① 500.1±19.1① 4.1±0.3①NAFLD/BPA 6 20.9±1.9① 511.1±20.5② 4.1±0.8①

2.2 大鼠血脂和游離脂肪酸水平比較 見表2。

表2 大鼠血清生化指標(biāo)（±s）的比較

表2 大鼠血清生化指標(biāo)（±s）的比較

與正常組比，①P＜0.05，②P＜0.01；與 NAFLD 組比，③P＜0.05

只 TC（mmol/L） TG（mmol/L） FFA（mmol/L）正常組 6 2.0±0.8 1.0±0.6 487.4±14.9 NAFLD 6 2.5±0.5① 2.4±0.7② 578.6±48.7②NAFLD/BPA 6 2.8±0.9①③ 2.8±0.6② 602.2±50.3②③

2.3 大鼠肝組織SREBP相關(guān)蛋白表達(dá)的變化 與正常組比，NAFLD和NAFLD/BPA組動物肝組織FAS蛋白表達(dá)分別增加了2.45倍和1.91倍，而靶基因乙酰輔酶A合成酶（ACS）蛋白量則下調(diào)1.54倍和1.5倍（P＜0.05）。與此同時，SREBP裂解活化蛋白SCP、S1P和S2P無顯著變化（圖1）。

圖1 各組肝組織SREBP相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

3 討論

近年來，美國食品藥物管理局（FDA）禁止在奶瓶中使用BPA，使其對人類健康的危害進(jìn)一步被重視。美國環(huán)境保護(hù)局甚至設(shè)立BPA日攝入量的最高濃度[10]。BPA是苯酚和丙酮衍生物，多用于罐頭食品和飲料的包裝、瓶類和牙齒填充物所用的密封膠。人群主要通過使用含BPA的包裝物及飲料瓶而廣泛暴露于BPA。本實驗發(fā)現(xiàn)即便是在低濃度下，長期BPA攝入對大鼠的體質(zhì)量和肝質(zhì)量仍有影響。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜連接蛋白-SREBP能調(diào)節(jié)細(xì)胞脂質(zhì)代謝，影響體內(nèi)脂質(zhì)含量的穩(wěn)定。本實驗結(jié)果表明，BPA暴露可進(jìn)一步加重NAFLD大鼠TC和FFA調(diào)節(jié)異常。

本研究尚未發(fā)現(xiàn)高脂飲食的兩組動物間與脂代謝相關(guān)的蛋白表達(dá)存在顯著性差異，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能有以下幾種：①BPA的暴露劑量較低。FDA規(guī)定的BPA安全劑量是 50 μg·kg-1·d-1，本實驗采用的劑量為 100 nmol/l，顯著低于規(guī)定的極限劑量。但即便是低劑量的暴露，SD大鼠已發(fā)生血脂代謝異常；②暴露的時間問題。許多動物實驗證實長期低劑量的BPA攝入仍可發(fā)生許多副作用，若進(jìn)一步延長實驗終點(diǎn)時間，或許各組蛋白表達(dá)量改變會進(jìn)一步顯著。

[1]Sheikh IA，Tayubi IA，Ahmad E，et al.Computational insights into the molecular interactions of environmental xenoestrogens 4-tert-octylphenol，4-nonylphenol，bisphenol A （BPA），and BPA metabolite，4-methyl-2，4-bis （4-hydroxyphenyl） pent-1-ene（MBP） with human sex hormone-binding globulin.Ecotoxicol Environ Saf，2017，135:284-291.

[2]Swan SH.Environmental phthalate exposure in relation to reproductive outcomes and other health endpoints in humans.Environ Res，2008，108（2）:177-184.

[3]Bonefeld-Jorgensen EC，Long M，HofmeisterMV，etal.Endocrine-disrupting potential of bisphenol A，bisphenol A dimethacrylate，4-n-nonylphenol，and 4-n-octylphenolin vitro:new data and a brief review.Environment Health Perspect，2007，115（Suppl 1）:69-76.

[4]Liang H，Xu W，Chen J，et al.The association between exposure to environmental bisphenol A and gonadotropic hormone levels among men.PLoS One，2017，12（1）:e0169217.

[5]Basini G，Bussolati S，Grolli S，et al.Bisphenol A interferes with swine vascular endothelial cell functions.Can J Physiol Pharmacol，2017，95（4）:365-371.

[6]Vandenberg LN，Colborn T，Hayes TB，et al.Hormones and endocrine-disrupting chemicals:Low-dose effects and nonmonotonic dose responses.Endocr Rev，2012，33（3）:378-455.

[7]Fenichel P，Chevalier N，Brucker-Davis F.Bisphenol A:an endocrine and metabolic disruptor.Ann Endocrinol （Paris），2013，74:211-220.

[8]Lang IA，Galloway TS，Scarlett A，et al.Association of urinary bisphenol A concentration with medical disorders and laboratory abnormalities in adults.JAMA，2008，300（11）:1303-1310.

[9]Wang T，Li M，Chen B，et al.Urinary bisphenol A（BPA）concentration associates with obesity and insulin resistance.J Clin Endocrinol Metab，2012，97（2）:e223-227.

[10]Vogel SA.The politics of plastics：the making and unmaking of bisphenol a“safety”.Am J Public Health，2009，99（Suppl 3）:S559-566.

（收稿：2017-02-10）

（本文編輯：陳宗炳）

Changes of lipid metabolism induced by bisphenol A in rats with NAFLD

Ding Wenjin，Sun Chao，Sang Yu’er，et al.Department of Gastroenterology，Xinhua Hospital，Shanghai JiaoTong University School of Medicine，Shanghai 200092，China

Nonalcoholic fatty liver disease；Bisphenol A；Lipid metabolism；Rats

10.3969/j.issn.1672-5069.2017.06.044

國家自然科學(xué)基金資助項目（編號：81400610）；教育部留學(xué)回國人員科研啟動基金項目（編號：201404802）；上海市衛(wèi)生和計劃生育委員會青年科研項目（編號：20134Y043）；上海交通大學(xué)醫(yī)工交叉研究基金資助項目（編號：YG2016MS72）

200092上海市 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院消化科（丁雯瑾，孫超，桑玉爾，陳梅梅，范建高）；環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院（袁濤）

丁雯瑾，女，36歲，博士研究生，主治醫(yī)師。主要從事肝病診斷與治療學(xué)研究。Email:wenjin_ding@163.com

袁濤，Email：taoyuan@sjtu.edu.cn