丁 月, 張 晶, 田 景 玉, 姜 鵬 飛, 周 大 勇,, 宋 亮,

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

紫外線(xiàn)對(duì)刺參體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與凋亡的影響

丁 月1, 張 晶1, 田 景 玉1, 姜 鵬 飛2, 周 大 勇1,2, 宋 亮1,2

( 1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院, 遼寧 大連 116034；2.大連工業(yè)大學(xué) 國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心， 遼寧 大連 116034 )

通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀，檢測(cè)紫外線(xiàn)對(duì)刺參體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化及凋亡的影響。將鮮活刺參隨機(jī)等分3組：對(duì)照組刺參為未經(jīng)UVA照射；UVA組刺參為經(jīng)UVA(15 W/m2)照射30 min；藥物處理-UVA組刺參為鈣離子螯合劑(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)灌入刺參體腔內(nèi)后，再經(jīng)UVA照射30 min。刺參經(jīng)室溫避光分別靜置0、1、2、3和4 h后采集其體腔細(xì)胞待檢。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，UVA組刺參體壁“化皮”程度隨靜置時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸加重，并伴隨“吐腸”現(xiàn)象的發(fā)生；其體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸升高，2 h時(shí)達(dá)到最高值，隨后下降；體腔細(xì)胞凋亡率在3 h后達(dá)到最高值，隨后降低。藥物處理-UVA組刺參體壁“化皮”程度隨靜置時(shí)間延長(zhǎng)而未見(jiàn)明顯變化；其體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度和細(xì)胞凋亡率均顯著低于UVA組。推斷紫外線(xiàn)照射刺參導(dǎo)致刺參體壁發(fā)生“化皮”現(xiàn)象，其體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高促進(jìn)了細(xì)胞凋亡率的上升。

刺參；體腔細(xì)胞；鈣離子；細(xì)胞凋亡

0 引 言

刺參(Stichopusjaponicas)屬棘皮動(dòng)物(Echinodermata)，海參綱(Holothuroidea)[1]，是沿海漁業(yè)最重要的海參品種之一。刺參易受溫度、鹽濃度、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏、光照以及機(jī)械刺激等應(yīng)激因素的影響，能夠觸發(fā)其發(fā)生“化皮”現(xiàn)象[2-4]。這種現(xiàn)象給刺參的保活保鮮儲(chǔ)運(yùn)行業(yè)帶來(lái)諸多不便。研究證實(shí)，紫外線(xiàn)作為最重要的應(yīng)激因素之一，能夠誘導(dǎo)刺參發(fā)生“化皮”現(xiàn)象，且伴隨細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[5]。但刺參細(xì)胞對(duì)紫外線(xiàn)刺激的生物學(xué)響應(yīng)研究十分有限，此條件下細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與凋亡水平的研究更是鮮有報(bào)道。Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，改變細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度能夠參與調(diào)控許多不同的細(xì)胞功能[6-7]。其中，細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的改變對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控發(fā)揮非常重要的作用，一旦細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)被打亂，細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加，引起鈣超載，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。刺參作為海洋無(wú)脊椎動(dòng)物，其體腔細(xì)胞具有氣體交換、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和貯存、凝塊形成、排泄、免疫防御等功能[9-12]。海洋無(wú)脊椎動(dòng)物體腔細(xì)胞作為一種環(huán)境脅迫的新型細(xì)胞生物傳感器監(jiān)控傳感器的生物學(xué)改變，可以用來(lái)評(píng)估水生生態(tài)系統(tǒng)健康，也可以用來(lái)評(píng)價(jià)水產(chǎn)動(dòng)物的鮮活程度[9,13]。因此，本研究采用紫外線(xiàn)(UVA)照射刺參后靜置不同時(shí)間，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀，檢測(cè)其體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及細(xì)胞凋亡水平的變化，同時(shí)觀(guān)察刺參在靜置過(guò)程中體壁“化皮”程度的變化，以探究紫外線(xiàn)照射對(duì)體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與細(xì)胞凋亡變化的影響，進(jìn)一步探討刺參“化皮”現(xiàn)象的可能機(jī)制，以期為刺參等海珍品?；畋ｕr技術(shù)可控靶點(diǎn)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

刺參：大連劉家橋市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)，產(chǎn)自大連金州周邊海域。

流式細(xì)胞儀，BD FACSVerseTM；激光掃描共聚焦顯微鏡，Leica DMi8；凋亡試劑盒，美國(guó)醫(yī)療器械有限公司；Ca2+熒光探針Fluo-3 AM，碧云天生物技術(shù)有限公司；鈣離子螯合劑(BAPTA-Na)，艾美捷科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

將體長(zhǎng)(12.5±1.6) cm、體質(zhì)量(128.3±7.2) g鮮活刺參隨機(jī)等分為3組，每組5只。對(duì)照組為無(wú)紫外線(xiàn)照射的刺參；UVA組為經(jīng)15 W/m2紫外線(xiàn)照射30 min處理的刺參；藥物處理-UVA組為Ca2+螯合劑(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)灌入刺參體腔內(nèi)，再經(jīng)15 W/m2紫外線(xiàn)照射30 min處理的刺參。每組刺參分別室溫避光靜置0、1、2、3和4 h。

1.2.2 刺參體腔細(xì)胞的制備

每組刺參斷尾處理，收集體腔液，300目濾布過(guò)濾除雜，制備體腔細(xì)胞。

1.2.3 激光共聚焦檢測(cè)體腔細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+濃度

采用Fluo-3 AM對(duì)體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度進(jìn)行檢測(cè)。取體腔液500 μL，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入HBSS溶液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度約為1×106cells/mL，加入終濃度5 μmmol/L 的Fluo-3 AM,輕輕混勻，室溫避光孵育20 min。用激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530 nm。掃描Ca2+的熒光強(qiáng)度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀對(duì)體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的檢測(cè)

Fluo-3 AM對(duì)體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+標(biāo)記方法同“1.2.3”。制成1×106個(gè)/mL，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，激發(fā)光為氬離子激光，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525～530 nm。每組檢測(cè)的細(xì)胞量在105個(gè)以上，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀對(duì)體腔細(xì)胞凋亡率的檢測(cè)

取體腔液500 μL，2 000 r/min離心5 min，棄去上清液，利用1×Binding Buffer制備100 μL濃度為1×106個(gè)/mL體腔細(xì)胞懸液，分別加入5 μL 的Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，再加入400 μL的1×Binding Buffer，輕輕混勻，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 UVA對(duì)刺參體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的影響

2.1.1 基于激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

利用Fluo-3 AM標(biāo)記刺參體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，在激光掃描共聚焦顯微鏡下檢測(cè)體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化的情況，如圖1所示。與對(duì)照組相比較，UVA組刺參體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)，并且隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸上升，靜置2 h達(dá)到最高值，隨后下降。藥物處理-UVA組刺參體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的熒光強(qiáng)度雖高于對(duì)照組(P<0.05)，但顯著低于UVA組刺參(P<0.05)。結(jié)果表明，UVA照射刺參能夠?qū)е缕潴w腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中持續(xù)保持高水平；Ca2+螯合劑灌入刺參體腔內(nèi)，經(jīng)UVA照射后，其體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度相比較于UVA組發(fā)生了大幅度的降低。推測(cè)刺參細(xì)胞體腔細(xì)胞內(nèi)的游離Ca2+主要來(lái)源于其細(xì)胞外Ca2+。

2.1.2 基于流式細(xì)胞儀檢測(cè)體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度

利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度變化的情況，如圖2所示。與對(duì)照組相比，UVA組刺參體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+峰圖向右遷移(圖2(a))，表明Ca2+的熒光強(qiáng)度明顯升高(P<0.05)；UVA照射后，室溫避光靜置0、1、2、3和4 h 的熒光強(qiáng)度先升高，到2 h左右達(dá)到峰值，而反應(yīng)超過(guò)2 h后逐漸降低(圖2(c))；定量結(jié)果表明，UVA照射刺參后，靜置不同時(shí)間的體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度是對(duì)照組體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的2倍以上。與對(duì)照組相比，藥物處理組-UVA的刺參體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+峰圖也向右遷移(圖2(b))。

(a) UVA組的Ca2+熒光成像

(b) 藥物處理-UVA組的Ca2+熒光成像

(c) Ca2+熒光強(qiáng)度定量分析

圖1 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測(cè)體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化

Fig.1 Changes of Ca2+concentration in coelomocytes detected by laser scanning confocal microscopy

在室溫避光靜置0、1、2、3和4 h后測(cè)得的Ca2+強(qiáng)度熒光強(qiáng)度先逐漸升高，到3 h左右達(dá)到最大值，之后熒光強(qiáng)度逐漸降低；其體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度明顯低于UVA組刺參體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度(P<0.05，圖2(c))。此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了UVA照射刺參能夠?qū)е缕潴w腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的升高。

2.2 UVA對(duì)刺參體腔細(xì)胞凋亡水平的影響

通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)UVA對(duì)刺參體腔細(xì)胞凋亡水平的影響，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比，UVA組經(jīng)紫外照射后，體腔細(xì)胞凋亡率增大，并且隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，在靜置3 h后達(dá)到最大(P<0.05，圖3(a))。其中，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為(6.73±0.77)%，經(jīng)UVA照射，室溫避光靜置0、1、2、3和4 h后，測(cè)得UVA組的細(xì)胞凋亡率逐漸升高，靜置3 h達(dá)到最大，隨后下降，分別為(8.96±1.41)%、(12.65±1.15)%、(17.13±2.20)%、(22.48±1.75)%和(9.59±0.64)%(圖3(c))。與對(duì)照組相比，藥物處理-UVA組刺參體腔細(xì)胞凋亡率也呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)(P<0.05，圖3(b))，但其在室溫避光靜置0、1、2、3和4 h后，測(cè)得的細(xì)胞凋亡率變化趨勢(shì)與UVA組相似，分別為(7.34±2.49)%、(9.02±1.37)%、(12.57±0.70)%、(14.35±0.62)%和(9.04±0.50)%；其體腔細(xì)胞凋亡率明顯低于UVA組(P<0.05，圖3(c))。結(jié)果表明，UVA照射刺參能夠引起其體腔細(xì)胞發(fā)生凋亡；本研究在UVA照射的同時(shí)加用了Ca2+螯合劑(BAPTA-Na，IC50=1.47 mmol/L)，發(fā)現(xiàn)其凋亡率雖然沒(méi)有恢復(fù)正常對(duì)照水平，但UVA照射引起的體腔細(xì)胞凋亡減少，推測(cè)是由于Ca2+螯合劑抑制了刺參細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低其細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度，減少了UVA對(duì)體腔細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

(a) UVA組Ca2+熒光強(qiáng)度流式峰

(b) 藥物處理-UVA組Ca2+熒光強(qiáng)度流式峰

(c) Ca2+熒光強(qiáng)度定量分析

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)體腔細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化

Fig.2 Changes of Ca2+concentration in coelomocytes detected by flow cytometer

2.3 UVA對(duì)刺參體壁組織的影響

由圖4可以看出，鮮活刺參未經(jīng)UVA照射、室溫避光靜置不同時(shí)間，其體態(tài)表皮整體完好，有彈性；鮮活刺參經(jīng)UVA照射30 min后，室溫避光靜置過(guò)程中，體表發(fā)生明顯變化。經(jīng)UVA照射后，刺參表皮受損；靜置1 h后發(fā)生“吐腸”現(xiàn)象；靜置3 h后參體癱軟；靜置4 h后白色真皮層暴露，體壁組織出現(xiàn)“黏液化”現(xiàn)象。結(jié)果表明，刺參經(jīng)UVA照射后，隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng)，“化皮”現(xiàn)象逐漸加重；在這一過(guò)程中，刺參出現(xiàn)吐腸，體壁組織出現(xiàn)許多黏液，體壁原有的機(jī)械剛性變差。Ca2+螯合劑處理的刺參，經(jīng)UVA照射30 min后，室溫避光靜置過(guò)程中，其體表彈性有所下降，但沒(méi)有發(fā)生明顯的損傷變化，即UVA引起的刺參體壁損傷程度明顯降低。結(jié)果表明，經(jīng)UVA照射，刺參體壁組織發(fā)生一定損傷，其損傷程度與此過(guò)程中體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度、凋亡水平有一定的時(shí)序性，推測(cè)UVA照射刺參發(fā)生“化皮”現(xiàn)象可能的原因是UVA照射導(dǎo)致體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，引起細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而造成刺參體壁組織一定程度上的損傷。

3 結(jié) 論

體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度主要受到胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放和胞外鈣離子進(jìn)出的調(diào)節(jié)，不同時(shí)空Ca2+濃度的微小變化可以編碼出復(fù)雜的信號(hào)調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)而影響細(xì)胞的各項(xiàng)功能[14]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，UVA照射刺參后，體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度是對(duì)照組的2倍以上；體腔細(xì)胞凋亡率是對(duì)照組的2倍以上，且都顯著高于藥物處理組-UVA的；同時(shí)，UVA組刺參出現(xiàn)“吐腸”，參體癱軟，暴露白色真皮層現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，刺參體壁發(fā)生“化皮”現(xiàn)象，推測(cè)出紫外線(xiàn)照射使體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高，促進(jìn)了細(xì)胞凋亡，引起了刺參體壁組織損傷。

綜上所述，紫外線(xiàn)照射導(dǎo)致刺參體壁發(fā)生“化皮”現(xiàn)象的過(guò)程中，其體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高促進(jìn)了細(xì)胞凋亡水平上升。本研究從Ca2+通道作為細(xì)胞感知外界環(huán)境變化應(yīng)答器的角度，探討了刺參“化皮”現(xiàn)象可能的機(jī)制，一定程度上對(duì)刺參等海珍品?；畋ｕr技術(shù)的可控靶點(diǎn)研究提供了指導(dǎo)意義。

(a) UVA組細(xì)胞凋亡流式散點(diǎn)圖

(b) 藥物處理-UVA組細(xì)胞凋亡流式散點(diǎn)圖

(c) 細(xì)胞凋亡率的定量分析

(a) 對(duì)照組

(b) UVA組

(c) 藥物處理-UVA組

圖4 紫外線(xiàn)誘導(dǎo)刺參“化皮”過(guò)程中體壁組織形態(tài)的變化

Fig.4 Morphological changes of “melting” sea cucumber induced by UVA radiation

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EffectofUVAonintracellularfreecalciumconcentrationandapoptosisofseacucumberStichopusjaponicascoelomocytes

DINGYue1,ZHANGJing1,TIANJingyu1,JIANGPengfei2,ZHOUDayong1,2,SONGLiang1,2

( 1.SchoolofFoodScienceandTechnology,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China；2.NationalEngineeringResearchCenterofSeafood,DalianPolytechnicUniversity,Dalian116034,China)

Effect of UVA on intracellular free calcium concentration and apoptosis of sea cucumberStichopusjaponicascoelomocytes were investigated by laser scanning confocal microscope and flow cytometer. FreshS.japonicaswas randomly divided into 3 groups:S.japonicasin the control group was not irradiated by UVA;S.japonicasin the UVA group was irradiated by UVA with the intensity of 15 w/m2for 30 min; andS.japonicasin the Ca2+-suppression group was irradiated by UVA with the intensity of 15 w/m2for 30 min after injecting with calcium chelation agent (BAPTA sodium salt, IC50=1.47 mmol/L) into the coelomic cavity.S.japonicaswere incubated at room temperature in dark for 0, 1, 2, 3 and 4 h, respectively. Compared with the control group, the “melting” degree of body wall of UVA group was gradually increased with the prolonging incubation time, and accompanied by the phenomenon of “spit intestinal”; intracellular free calcium concentration of coelomocytes increased gradually with the prolonging incubation time, which reached the highest level after 2 h of incubation and then decreased; apoptosis rates of coelomocytes achieved the highest after 3 h of incubation and then decreased. The “melting” degree of body wall of the Ca2+-suppression group was not obvious; intracellular free calcium concentration and apoptosis rates of coelomocytes were significantly lower than UVA group. The above results indicated that the “melting” ofS.japonicasbody wall was induced by UVA irradiation, in which promoted the apoptosis of coelomocytes by the up-regulation of intracellular free calcium concentration.

Stichopusjaponicas; coelomocytes; calcium ions; apoptosis

丁月,張晶,田景玉,姜鵬飛,周大勇,宋亮.紫外線(xiàn)對(duì)刺參體腔細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度與凋亡的影響[J].大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,36(6):391-396.

DING Yue, ZHANG Jing, TIAN Jingyu, JIANG Pengfei, ZHOU Dayong, SONG Liang. Effect of UVA on intracellular free calcium concentration and apoptosis of sea cucumberStichopusjaponicascoelomocytes[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2017, 36(6): 391-396.

2016-11-09.

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31401562)；遼寧省農(nóng)業(yè)領(lǐng)域青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2015002)；遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2014220).

丁 月(1991-)，女，碩士研究生；通信作者：宋 亮(1980-)，男，講師.

TS254.9

A

1674-1404(2017)06-0391-06