謝翎
摘 要:該文對(duì)SDAY培養(yǎng)基上培養(yǎng)的球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株與原始出發(fā)菌株各自在菌落形態(tài),菌絲生長(zhǎng)速度,產(chǎn)孢量等方面進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明:球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株與原始出發(fā)菌株的菌落形態(tài)有一定差異。且球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因菌株菌絲生長(zhǎng)速度更快,其菌絲生長(zhǎng)速度為(3.73±0.05)㎜/d而原發(fā)菌株菌絲生長(zhǎng)速度為(3.45±0.52)㎜/d。另外,重組菌株的產(chǎn)孢量(0.92±0.02)×108個(gè),明顯低于原始出發(fā)菌株(1.12±0.17)×108個(gè)。
關(guān)鍵詞:球孢白僵菌;生物學(xué)特性;轉(zhuǎn)基因
中圖分類號(hào) Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731(2017)22-0034-02
Abstract:The biological characteristics of Beauveria bassiana tps1 recombination strain and its origin strain were evaluated based on colonial form, rate of colony growth and spore-bearing yield. The results showed that the colonial forms of these two strains are similar. Moreover, the recombination strain (3.73±0.05 ㎜/d) grow faster than the origin strain(3.45±0.52㎜/d). And the spore-bearing yield of the recombination strains was (0.92±0.02)×108 ,while the spore-bearing yield of the origin strain was(1.12±0.17)×108.
Key words:Beauveria bassiana;Biological characteristics;Transgene
1 引言
球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是國(guó)內(nèi)外廣泛用于害蟲生物防治的殺蟲真菌之一,被認(rèn)為是最具開發(fā)潛力的一種昆蟲病原真菌。通過基因改造其環(huán)境適應(yīng)性,是進(jìn)一步擴(kuò)大球孢白僵菌殺蟲劑應(yīng)用的有效手段。我們前期工作中利用含有構(gòu)巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動(dòng)子的質(zhì)粒pBARGPE1對(duì)球孢白僵菌Bb202菌株的海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1進(jìn)行了組成型超量表達(dá)。在此基礎(chǔ)上,本研究對(duì)tps1轉(zhuǎn)基因重組菌株與其原始出發(fā)菌株在生物學(xué)特性以及產(chǎn)孢率進(jìn)行了檢測(cè)。
2 材料與方法
2.1 菌株來源 供試的白僵菌Bb202菌株由本實(shí)驗(yàn)室保存,其寄主為松褐天牛,采自日本。球孢白僵菌tps1基因,組成型表達(dá)重組菌株,由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建。
2.2 培養(yǎng)基 SADY固體培養(yǎng)基:葡萄糖4%、酵母浸出粉1%、蛋白胨1%、瓊脂2%。高壓滅菌鍋中滅菌后備用。SDY液體培養(yǎng)基:葡萄糖4%、酵母浸出粉1%、蛋白胨1%。高壓滅菌鍋中滅菌后備用。
2.3 實(shí)驗(yàn)方法
2.3.1 菌落形態(tài)的觀察 將保存的球孢白僵菌原發(fā)菌株和球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株分別配成1×106孢子/mL濃度的孢懸液,并用微量移液器取3μL點(diǎn)于薩氏培養(yǎng)基SDAY培養(yǎng)基平板正中心,25℃恒溫培養(yǎng)并觀察菌落形態(tài)特征。
2.3.2 菌落生長(zhǎng)速度測(cè)定 按前述方法將球孢白僵菌原發(fā)菌株和球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因菌株分別接種在SDAY斜平板上,置于25℃恒溫培養(yǎng)。每48h,定時(shí)用精密卡尺檢測(cè)菌落直徑并記錄、分析比較各菌株的菌落生長(zhǎng)速度,共記錄10d。
2.3.3 產(chǎn)孢量測(cè)定 將上述方法培養(yǎng)12d的樣本用于產(chǎn)孢量的測(cè)定。即在菌株培養(yǎng)到第12天的平板上,用直徑為5㎜的打孔器在菌落中央到邊緣的中點(diǎn)處取出一定面積的菌落塊,放入試管中,再加入適量的吐溫-80和無菌水,加上棉塞,置于搖床上搖一夜,使分生孢子充分搖散,制成孢子懸液。然后用膠頭滴管取一滴混勻的孢子懸液,滴加到血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上,在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù),測(cè)定孢子量。每種菌株重復(fù)3次,統(tǒng)計(jì)每種菌株的產(chǎn)孢量,比較球孢白僵菌原發(fā)菌株與球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因菌株在SDAY平板培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量。計(jì)算公式如下:
1㎝2菌落含孢量=(平均每小格孢子數(shù)×4×106×稀釋倍數(shù))/打孔面積
3 結(jié)果與分析
3.1 菌落形態(tài)比較 在SDAY培養(yǎng)基上,分別對(duì)球孢白僵菌原發(fā)菌株和球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)一段時(shí)間,結(jié)果發(fā)現(xiàn)2種菌株的菌落外觀初期菌落形態(tài)及色澤無差異,但產(chǎn)孢后孢子色澤不同。生長(zhǎng)后期,菌落表面凹凸形態(tài)及放射溝也有差別(表1、圖1)。
3.2 菌落生長(zhǎng)速度比較 由表2可知,2種菌株在SDAY培養(yǎng)基上營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量存在差異。10d內(nèi)菌落平均生長(zhǎng)直徑在34.5~37.3mm。從總體上來看,球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株的菌落生長(zhǎng)速度較快,其菌落平均生長(zhǎng)速度達(dá)(3.73±0.05)mm/d,而原發(fā)菌株的菌落平均生長(zhǎng)速度為(3.45±0.52)mm/d。分析同時(shí)表明在生長(zhǎng)初期,轉(zhuǎn)基因菌株的菌落生長(zhǎng)速度較快,而到生長(zhǎng)后期,2種菌株的菌落生長(zhǎng)速度差別不大。
4 討論
TPS在海藻糖合成的第一步中起作用,催化UDP葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸形成海藻糖-6-磷酸。將tps1基因?qū)肭蜴甙捉┚心苁顾e累海藻糖,海藻糖不僅是一種可存儲(chǔ)的糖類物質(zhì),而且是一種重要的脅迫保護(hù)劑,因此可以提高球孢白僵菌在脅迫環(huán)境中的抗逆性。
為評(píng)價(jià)球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株生物學(xué)特性,本文通過菌落形態(tài)、菌落生長(zhǎng)速度(營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)量)、產(chǎn)孢量等指標(biāo),以反映轉(zhuǎn)基因后菌株性狀變化。前期研究表明,球孢白僵菌tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株在脅迫環(huán)境中,抗逆性明顯增強(qiáng)。而在產(chǎn)孢量與菌落生長(zhǎng)速度的變化,也會(huì)對(duì)球孢白僵菌的生產(chǎn)應(yīng)用造成影響。
本研究發(fā)現(xiàn),tps1轉(zhuǎn)基因工程菌株的菌落生長(zhǎng)速度略快于初始菌株,但其產(chǎn)孢量明顯下降。這表明tps1的基因改造加快了菌體的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)(菌絲生長(zhǎng)),但其生殖生長(zhǎng)(產(chǎn)孢)卻受到了一定抑制。
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(責(zé)編:張宏民)endprint