磁性前列地爾脂微球靶向治療大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)研究

王彥進(jìn)+肖義青+陳振雨

[摘要]目的：探討磁性前列地爾脂微球靶向治療大鼠腹部皮瓣缺血-再灌注損傷的作用機(jī)制及療效。方法：制備大鼠腹部皮瓣缺血再灌注損傷的動物模型，實(shí)驗(yàn)組注射磁性前列地爾脂微球，并在皮瓣外覆蓋銣鐵硼稀土磁鐵；對照組注射生理鹽水；空白組不進(jìn)行血管阻斷及藥物注射。測定三組皮瓣血流量、皮瓣組織丙二醛和一氧化氮含量；皮瓣原位縫合后7d評估皮瓣成活率，并檢測皮瓣組織中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)情況。結(jié)果：與對照組及空白組比較，在皮瓣缺血-再灌注過程中實(shí)驗(yàn)組皮瓣微循環(huán)血量明顯增多、皮瓣組織內(nèi)一氧化氮水平升高、丙二醛水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；皮瓣原位縫合7d后皮瓣成活率顯著提高（P<0.05）。結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)制備的具有磁場順應(yīng)性的前列地爾脂微球可有效提升缺血-再灌注皮瓣部位的藥物濃度、改善皮瓣微循環(huán)、降低缺血-再灌注損傷，進(jìn)而提高皮瓣成活率。

[關(guān)鍵詞]前列地爾脂微球；磁性；靶向治療；缺血再灌注損傷

[中圖分類號]R331.3 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A [文章編號]1008-6455（2017）10-0060-04

Abstract： Objective To investigate the effect of magnetic alprostadil lipid microsphere in targeting treatment of ischemia-reperfusion injury of abdominal flaps in rats. Methods To prepare animal models of ischemia-reperfusion in rat ventral flap. The experimental group was injected magnetic alprostadil lipid microsphere and covered the flap up with rubidium iron boron magnet.The control group was injected with saline. The blank group was only prepared the abdominal flap， without vascular occlusion or drug injection. At the same time point of the experiment， blood flow， MDA and NO concentrations of each group was detected separately， the skin flap survival rate was evaluated 7 days after skin flap suture， and detected VEGF expression simultaneously. Results During the flap ischemia reperfusion process，the microcirculation volume in experimental group was significantly increased， and the flap NO levels increased， while MDA level decreased， the difference was statistically significant（P<0.05）. Survival rate of the flap increased significantly after suture 7d in situ（P<0.05）. Conclusion Targeting treatment using magnetic alprostadil lipid microsphere can effectively improve ischemia-reperfusion flap of drug concentration， improve skin microcirculation， reducing ischemia-reperfusion injury， and enhance the survival rate of flap.

Key words： alprostadil lipid microsphere； magnetic； targeting treatment； ischemia-reperfusion injury

皮瓣技術(shù)是外科治療中一項(xiàng)重要的技術(shù)手段，廣泛應(yīng)用于整形外科、顯微外科等專業(yè)領(lǐng)域。但是，在皮瓣移植過程中往往存在較長時(shí)間的皮瓣缺血缺氧期，再灌注時(shí)會對皮瓣組織造成一定程度的損傷，影響其成活。前列地爾是一種高效生物活性物質(zhì)，可明顯擴(kuò)張血管，改善微循環(huán)。本研究是將前列地爾封入直徑0.2μm的脂微球中，利用脂微球的載體特性[1]，在外磁場作用下，將藥物運(yùn)輸?shù)酱笫蟾共科ぐ耆毖俟嘧p傷部位，觀察皮瓣不同時(shí)期的血流量、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）含量的變化情況，為臨床應(yīng)用磁性前列地爾脂微球改善皮瓣缺血再灌注損傷、促進(jìn)皮瓣成活提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：健康純種成年雌性SD大鼠，購自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)室，SPF級，180～300g，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組三組，每組10只。

1.2 試劑：前列地爾（臺灣，永光）；自制前列地爾脂微球，牛血清白蛋白（上海，天呈）；磁流體-銣鐵硼磁鐵（北京，萊博）；蓖麻油（廣州，丹旺）；乙醚（深圳，多源）；無水乙醇（上海，浩然）；多聚甲醛（美國，Sigma）；MDA含量測定試劑盒（北京，索萊寶）；NO含量測定試劑盒（上海，碧云天）；VEGF抗體（美國，Santa Cruz）；即用型SABC免疫組化試劑盒（武漢，博士德）。endprint

1.3 儀器：激光多普勒血流儀（日本，Omega）；4℃冰箱（青島，澳柯瑪）；-80℃冰箱（青島，海爾）；普通光學(xué)顯微鏡（德國，Leica）；熒光倒置顯微鏡（德國，Leica）；恒溫水浴鍋（深圳，深信）；高速離心機(jī)（美國，Beckman）。

1.4 方法

1.4.1 前列地爾脂微球制備：采用乳化熱固化技術(shù)。取牛血清白蛋白250mg溶于10g/L前列地爾蒸餾水溶液中，添加磁流體0.2ml，與100ml含10%的蓖麻油混合，攪拌10min，超聲乳化；另取蓖麻油100ml加熱至160℃，在攪拌下加入上述乳濁液，160℃保溫10min，攪拌6h；加入乙醚200ml脫脂，離心，棄去油相，沉淀依次用乙醚、乙醇漂洗，最后置換在蒸餾水中，冷凍干燥48h，即成微球粉末[2]。

1.4.2 大鼠腹部島狀皮瓣模型制備：實(shí)驗(yàn)動物術(shù)前1d禁食，10% Na2S將腹部脫毛備用，3%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔內(nèi)注射進(jìn)行全身麻醉，參照Manson等[3]的方法設(shè)計(jì)以腹壁淺血管為蒂的3cm×6cm大小的島狀皮瓣，常規(guī)消毒后于皮下內(nèi)膜層掀起皮瓣備用。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)方法：皮瓣制備完成，用微血管夾夾閉腹壁淺動脈以阻斷血流，使皮瓣缺血；5h后取下微血管夾，使皮瓣再灌注，同時(shí)經(jīng)對側(cè)股動脈插管，實(shí)驗(yàn)組注射磁性前列地爾脂微球，并在皮瓣外覆蓋銣鐵硼稀土磁鐵；對照組注射生理鹽水；空白組僅制備腹部島狀皮瓣，不進(jìn)行血管阻斷及藥物注射。前列地爾脂微球及生理鹽水注射首次劑量為20mg/kg，并以10mg/kg/min維持2h。實(shí)驗(yàn)組及對照組皮瓣再灌注后2h、空白組皮瓣制備后7h，原位縫合皮瓣。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 前列地爾脂微球磁響應(yīng)觀察：將前列地爾脂微球按濃度比1：10加入0.1%生理鹽水中，超聲分散，倒置顯微鏡下觀察微球分散情況；同時(shí)，取混懸液1滴滴于載玻片上，然后將1塊表面強(qiáng)度為3000高斯的銣鐵硼磁鐵置于載玻片一端，鏡下觀察微球運(yùn)動及聚集情況[4]。

1.5.2 皮瓣血流量測定：于缺血前，缺血1h、2h和5h及再灌注5min、0.5h和2h時(shí)，以激光多普勒血流儀測定各組皮瓣血流量，單位nl/s。

1.5.3 皮瓣組織MDA和NO含量測定：三組均于皮瓣術(shù)后即刻、再灌注后0.5h及2h分別取皮瓣邊緣全層組織100mg，按照晏澤等[5]的方法制成勻漿后測定MDA和NO含量。

1.5.4 皮瓣成活率測定：皮瓣原位縫合后7d用坐標(biāo)貼紙法[6]測定皮瓣設(shè)計(jì)面積及成活面積，推算其成活率。皮瓣成活率=成活面積/設(shè)計(jì)面積×100%。

1.5.5 血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）檢測：皮瓣原位縫合7d后取皮瓣全層組織，多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋，取5μm連續(xù)切片，免疫組化法檢測皮瓣組織VEGF表達(dá)[7]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 前列地爾脂微球磁響應(yīng)情況：顯微鏡下可見前列地爾脂微球向銣鐵硼磁鐵一方快速移動聚集，約5min后脂微球幾乎全部集中在磁鐵一側(cè)；隨著滴液和磁鐵之間距離的增大，脂微球移動速度明顯下降。

2.2 皮瓣血流量測定結(jié)果：如表1所示，皮瓣缺血期微循環(huán)血流量隨時(shí)間延長逐漸減少，缺血5h時(shí)皮瓣微循環(huán)血流量為缺血前微循環(huán)血流量的30%左右；再灌注后，實(shí)驗(yàn)組及對照組皮瓣微循環(huán)血量隨時(shí)間延長逐漸增加，且實(shí)驗(yàn)組皮瓣血流量較對照組顯著增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

2.3 NO含量測定結(jié)果：如表2所示，皮瓣術(shù)后即刻三組NO含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；在皮瓣術(shù)后5.5h、7h，即再灌注后0.5h、2h，其NO含量空白組>實(shí)驗(yàn)組>對照組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 MDA含量測定結(jié)果：如表3所示，皮瓣術(shù)后即刻三組MDA含量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；皮瓣術(shù)后5.5h，即再灌注后0.5h，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組皮瓣組織中MDA含量無顯著增加（P>0.05），對照組增加明顯（P<0.05）；再灌注2h時(shí)，與空白組相比，實(shí)驗(yàn)組和對照組皮瓣組織內(nèi)MDA含量均有增加，且對照組顯著高于實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）。

2.5 皮瓣成活率檢測結(jié)果：原位縫合7d后，空白組皮瓣成活率為100%，實(shí)驗(yàn)組為（81.6±7.4）%明顯高于對照組的（42.1±5.6）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。見圖1。

2.6 VEGF檢測結(jié)果：原位縫合7d后，鏡下可見，空白組皮瓣組織有大量毛細(xì)血管新生，血管內(nèi)皮細(xì)胞中有大量VEGF表達(dá)，表現(xiàn)為分布密集的深棕色顆粒（圖2A）；對照組新生血管數(shù)目最少，僅可見稀疏分布的淺棕色VEGF顆粒（圖2B）；實(shí)驗(yàn)組新生血管數(shù)目較空白組少但明顯多于對照組，可見較多VEGF表達(dá)，表現(xiàn)為相對密集的深棕色顆粒（圖2C）。

3 討論

皮瓣移植是整形外科常用的修復(fù)組織缺損和器官再造的重要手段，而缺血再灌注損傷是皮瓣壞死的重要原因，其發(fā)生機(jī)制目前尚不完全清楚。研究表明[8]，缺血再灌注損傷與氧自由基增多誘發(fā)的級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。MDA是脂質(zhì)過氧化物下細(xì)胞膜損傷分解生成的產(chǎn)物，其含量可反應(yīng)組織缺血缺氧的嚴(yán)重程度，通常MDA含量越高，組織缺氧情況越嚴(yán)重。NO是存在于各組織內(nèi)具有明顯血管舒張作用的自由基，已有研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的NO對局部微循環(huán)具有抗缺血再灌注損傷的作用[9]。

前列地爾是天然前列腺素的一種，具有高效生物學(xué)活性，可明顯擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞改善微循環(huán)等。已有研究表明[10-11]，外加磁場可提高磁性藥物在病變部位的靶向分布。脂微球?qū)Σ∽儾课谎苡休^高的親和性。應(yīng)用磁性前列地爾脂微球減少皮瓣移植缺血再灌注損傷，提高皮瓣成活率的作用機(jī)制可能有：①磁性前列地爾脂微球減輕自由基對組織的損傷。本研究表明磁性前列地爾脂微球減少皮瓣移植缺血再灌注損傷過程中自由基的生成，抑制自由基形成的膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而減輕組織結(jié)構(gòu)損傷和功能障礙，這可能是磁性前列地爾脂微球減少缺血再灌注損傷、提高皮瓣移植成活率的重要機(jī)制之一；②磁性前列地爾脂微球增加NO的產(chǎn)生。其可能機(jī)制是磁性前列地爾脂微球通過增加一氧化氮合酶的水平和活性，刺激白介素、腫瘤壞死因子、細(xì)胞生長因子等細(xì)胞因子的產(chǎn)生促進(jìn)NO的生成，從而起到改善微循環(huán)，減少缺血再灌注損傷，增加皮瓣成活率的作用；③磁性前列地爾脂微球增加VEGF表達(dá)和新生血管生成。主要機(jī)制是通過增加血管數(shù)目及血管內(nèi)皮通透性，抑制炎癥因子的釋放，增強(qiáng)皮瓣內(nèi)中性粒細(xì)胞的吞噬功能，增加皮瓣缺血區(qū)域新生血管的生成，從而改善缺血組織的微循環(huán)，提高皮瓣成活率；④磁性前列地爾脂微球減少白細(xì)胞浸潤。其機(jī)制可能是磁性前列地爾脂微球可通過腺苷酸環(huán)化酶-蛋白激酶信號通路，抑制血小板活性因子、補(bǔ)體、腫瘤壞死因子等炎癥介質(zhì)的釋放，減少VEGF、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子等多種生長因子的增加，減少中性粒細(xì)胞等向組織遷移和浸潤，并能抑制白細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的粘附作用，減少白細(xì)胞的激活，抑制白細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，防止組織進(jìn)一步損傷；⑤磁性前列地爾脂微球改善微循環(huán)。本研究結(jié)果表明，磁性前列地爾脂微球可有效改善皮瓣組織循環(huán)血流量，其機(jī)制是通過腺苷酸環(huán)化酶-磷酸二酯酶信號通路，作用于小動脈的平滑肌細(xì)胞和毛細(xì)血管前括約肌，致微循環(huán)開放；可抑制血小板聚集；改善微循環(huán)血液流變學(xué)性狀；減少NF-κB、腫瘤壞死因子等炎癥因子等細(xì)胞因子的釋放，改善微血管通透性增加，減輕組織水腫和血管痙攣；穩(wěn)定凝血功能，減少血栓生成；減少內(nèi)皮素等血管活性物質(zhì)的生成，抑制血管收縮，增加毛細(xì)血管血流灌注。endprint

本次研究中將前列地爾包裹在直徑為0.2μg的脂微球內(nèi)，實(shí)驗(yàn)證實(shí)前列地爾脂微球體的外磁響應(yīng)性好，具有超順磁性。其作用于病變部位具有如下優(yōu)勢：①高靶向性：脂微球進(jìn)入血管后，主要與血小板一起在血管邊緣流動，并可黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞[12]，因此前列地爾脂微球可在外加磁場作用下聚集于病變部位，將藥物運(yùn)輸至病變組織或器官，選擇性的擴(kuò)張?jiān)摬课谎?，促進(jìn)側(cè)枝循環(huán)的建立，改善局部微循環(huán)[13]；②藥效持續(xù)時(shí)間長：前列地爾脂微球載體制劑在脂微球的屏障保護(hù)作用下，肺部對其滅活作用明顯減少[14]，內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)對其的吞噬作用也明顯減弱[15]；③降低不良反應(yīng)發(fā)生率：在脂微球的保護(hù)下，前列地爾脂微球?qū)ρ艿拇碳ぜ把装Y反應(yīng)均顯著降低[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)，注射前列地爾脂微球后，皮瓣微循環(huán)血量在短期內(nèi)增加，遠(yuǎn)期成活率也顯著提高。而對皮瓣組織的取樣檢測發(fā)現(xiàn)，皮瓣組織內(nèi)NO水平增高，MDA水平降低，說明前列地爾脂微球?qū)ζぐ晡⒀h(huán)和皮瓣成活率的影響是通過增加NO含量、降低MDA的水平來實(shí)現(xiàn)的。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了Cordeiro等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)對前列地爾的作用機(jī)制進(jìn)行了更深層次地探討。結(jié)果顯示，具有磁場順應(yīng)性前列地爾脂微球，可更好地提高病變部位的藥物濃度，減少藥物在非病變部位的蓄積，改善皮瓣微循環(huán)，減輕缺血再灌注損傷，有效提高皮瓣成活率。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Wahajuddin，Arora S.Superparamagnetic iron oxide nanoparticles： magnetic nanoplatforms as drug carriers[J].Int J Nanomedicine，2012，7：3445-3471.

[2]Aliabadi M，Shagholani H，Yunessnia Lehi A.Synthesis of a novel biocompatible nanocomposite of graphene oxide and magnetic nanoparticles for drug delivery[J]. Int J Biol Macromol，2017，98：287-291.

[3]Manson，Deak GF.The role of oxygen free radicals in ischemia tissue injury in island skin flaps[J].Ann Surg，1983，198（1）：87-90.

[4]Ji B，Wang M，Gao D，et al.Combining nanoscale magnetic nimodipine liposomes with magnetic resonance image for Parkinson's disease targeting therapy[J]. Nanomedicine （Lond），2017，12（3）：237-253.

[5]晏澤，肖能坎，肖天有，等.任意皮瓣掀起后內(nèi)皮素、一氧化氮動態(tài)變化與皮瓣微循環(huán)血量的關(guān)系[J].西南國防醫(yī)藥，200l，11（l）：7-l0.

[6]Cuzin B.Alprostadil cream in the treatment of erectile dysfunction： clinical evidence and experience[J].Ther Adv Urol，2016，8（4）：249-256.

[7]Evans I.An overview of VEGF-m Mediated signal transduction[J].Methods Mol Biol， 2015，1332：91-120.

[8]姜德華，金男革，玄漢石，等.大鼠急性局灶性腦缺血再灌注腦組織NO含量和NOS活性的變化[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志，2000，13（4）：201.

[9]Wei W，Lai SC，Xie Y，et al.The Protective Effect of Target Temperature Management Combined with Prostaglandin E1 on Ischemia/Reperfusion Injury of Cerebral Micro-vascular Endothelium of ROSC Rat[J].Sichuan Daxue Xuebao（Yixue Ban），2016，47（3）：310-315.

[10]Mosafer J，Teymouri M，Abnous K，et al.Study and evaluation of nucleolin-targeted delivery of magnetic PLGA-PEG nanospheres loaded with doxorubicin to C6 glioma cells compared with low nucleolin-expressing L929 cells[J].Mater Sci Eng C Mater Biol Appl， 2017，72：123-133.

[11]Guo Y，Li S，Wang Y，et al.Diagnosis-Therapy Integrative Systems Based on Magnetic RNA Nanoflowers for Co-drug Delivery and Targeted Therapy[J].Anal Chem，2017，89（4）：2267-2274.

[12]Voronin DV，Sindeeva OA，Kurochkin MA，et al.In Vitro and in Vivo Visualization and Trapping of Fluorescent Magnetic Microcapsules in a Bloodstream[J].ACS Appl Mater Interfaces，2017，9（8）：6885-6893.endprint

[13]Erer D，?zer A，Demirta? H，et al.Effects of alprostadil and iloprost on renal， lung， and skeletal muscle injury following hindlimb ischemia-reperfusion injury in rats[J].Drug Des Devel Ther，2016，10：2651-2658.

[14]McBride AA，Price DN，Muttil P.Pulmonary Delivery of Magnetically Targeted Nano-in-Microparticles[J].Methods Mol Biol，2017，1530：369-378.

[15]Echevarria-Uraga JJ，García-Alonso Montoya I，Miguélez Vidales JL，et al.Magnetic resonance imaging and spectrometric study of the distribution of thermotherapeutic magnetofluid after intra-arterial administration in an experimental model of liver metastases[J].Radiologia，2012，54（3）：251-259.

[16]Soares BL，F(xiàn)reitas MA，Montero EF，et al.Alprostadil attenuates inflammatory aspects and leucocytes adhesion on renal ischemia and reperfusion injury in rats[J]. Acta Cir Bras，2014，29（2）：55-60.

[17]Cordeiro PG，Mastorakos DP，Hu QY，et al.The protective effect of Larginne on ischemia-reperfusion injury in rat skin flaps[J].Plast Reconstr Surg，1998，102 （6）：2040-2048.

[收稿日期]2017-06-26 [修回日期]2017-08-01

編輯/朱婉蓉endprint