李建楓，徐衍全，程輝，孫洋

(三亞市人民醫(yī)院，海南三亞572000)

結(jié)直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)及意義

李建楓，徐衍全，程輝，孫洋

(三亞市人民醫(yī)院，海南三亞572000)

目的觀察結(jié)直腸癌組織中miR-31、程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)的表達(dá)情況，分析其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。方法選擇80例結(jié)直腸癌患者，收集其臨床資料(包括性別、年齡、腫瘤直徑、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等)。取患者手術(shù)切除的癌組織和癌旁組織，采用RT-PCR法檢測(cè)miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)，分析miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性，采用簡(jiǎn)單相關(guān)分析法分析癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果癌組織中miR-31相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，PDCD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(P均<0.05)。癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)與TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，與癌癥部位、性別、年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)。相關(guān)性分析顯示，癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.412，P<0.05)。結(jié)論結(jié)直腸癌組織中miR-31表達(dá)升高、PDCD4 mRNA表達(dá)降低，二者異常表達(dá)與結(jié)直腸癌病情進(jìn)展及惡化轉(zhuǎn)移有關(guān)。

結(jié)直腸癌；微小RNA-31；程序性細(xì)胞死亡因子4

結(jié)直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤之一。近年來(lái)，由于人口老齡化及居民生活方式和飲食習(xí)慣的改變等多種因素的影響，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，且發(fā)病人群呈年輕化趨勢(shì)[1]。目前對(duì)于結(jié)直腸癌的治療手段主要以手術(shù)切除為主、放化療為輔，但治療效果并不理想。因此尋找與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)的分子標(biāo)志物，對(duì)于疾病早期干預(yù)和治療具有重要價(jià)值。微小RNA(miRNA)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一類小型內(nèi)源性非編碼RNA調(diào)控因子，在細(xì)胞分化、細(xì)胞周期和凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種miRNA的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有關(guān)[2]，miR-31與結(jié)直腸癌、胃癌等惡性腫瘤關(guān)系的研究也受到廣泛關(guān)注。程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡基因，可抑制蛋白轉(zhuǎn)錄及翻譯，調(diào)控細(xì)胞程序性死亡，從而發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，PDCD4在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)降低或缺失，并可作為抗腫瘤的治療靶點(diǎn)[3]。本研究通過(guò)觀察結(jié)直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA的表達(dá)變化及其與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，旨在為結(jié)直腸癌的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2017年1月在我院行手術(shù)治療的80例結(jié)直腸癌患者，男49例、女31例，年齡40～81(54.8±9.7)歲?；颊呔?jīng)術(shù)后病理檢查確診，結(jié)腸癌29例、直腸癌51例。腫瘤直徑≥4 cm 38例，<4 cm 42例；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期44例，Ⅲ～Ⅳ期36例；細(xì)胞分化程度高分化31例，中分化26例，低分化23例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。患者均為首次診斷和治療；術(shù)前進(jìn)行放化療及其他輔助治療；排除其他惡性腫瘤。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，患者均知情同意。

1.2 臨床資料收集 查閱患者的病歷本，收集患者的性別、年齡、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移等相關(guān)臨床資料。

1.3 癌組織及癌旁組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法。收集癌組織及癌旁(距離癌組織5 cm以上)正常黏膜組織，液氮速凍后，-80 ℃保存。取大腸組織50～100 mg剪碎，TRIzol法提取總RNA，使用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。采用SYBR GreenⅠ熒光定量PCR法進(jìn)行cDNA的定量檢測(cè)。PCR mix的擴(kuò)增采用SYBR?Premix EX TaqTMⅡ(TaKaRa)。miR-31莖環(huán)引物序列為5′-GTCGTATCCAGTGCTGGGTCCGAGTGATTCGCACTGGAT-ACGACCAG-CTA-3′，miR-31上游引物為5′-ACGCGGCAAGATGCTGGCA-3′，下游引物為5′-CAGTGCTGGGTCCGAGTGA-3′；PDCD4 mRNA上游引物為5′-CAGTTGGTGGGCCAGTTTATTG-3′，PDCD4 mRNA下游引物為5′-AGAAGCACGGTAGCCTTATCCA -3′；U6上游引物為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個(gè)循環(huán)，重復(fù)3次。以U6為內(nèi)參基因記錄各樣本反應(yīng)管中的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定閾值時(shí)所對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，即Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-31、PDCD4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織及癌旁組織中miR-31、PDCD4 mRNA的表達(dá)差異 癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為8.751±2.161、3.986±1.232，癌旁組織分別為2.011±1.018、7.192±3.915。癌組織中miR-31的相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，PDCD4 mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(P均<0.01)。

2.2 結(jié)直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)與TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)；而與病灶部位、性別、年齡、腫瘤直徑無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見表1。

2.3 癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性 癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.412，P<0.05)。

3 討論

目前對(duì)于結(jié)直腸癌的病因及具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，學(xué)者普遍認(rèn)為其與遺傳及飲食因素密切相關(guān)，且是一種多基因參與的多階段發(fā)展過(guò)程。結(jié)直腸癌的預(yù)后效果不佳，其早期診斷的存活率僅約為60%[4]，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)深度、TNM分期等均為影響其預(yù)后的重要因素[5，6]。對(duì)結(jié)直腸癌在發(fā)病前進(jìn)行早期診斷及干預(yù)治療對(duì)提高療效、改善預(yù)后具有重要價(jià)值。目前對(duì)于結(jié)直腸癌的篩選方法主要是結(jié)腸鏡檢查和糞便隱血試驗(yàn)等常規(guī)手段，其特異性及敏感性不甚理想。近年來(lái)隨著各種分子檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，探尋與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展及預(yù)后有關(guān)的分子標(biāo)志物成為研究熱點(diǎn)。

表1 結(jié)直腸癌組織中miR-31、PDCD4 mRNA表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度為19～22個(gè)核苷酸，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮重要的基因表達(dá)調(diào)控作用。目前已發(fā)現(xiàn)千余種miRNA，其產(chǎn)生過(guò)程及生物學(xué)功能各有差異。miRNA在細(xì)胞內(nèi)可與其他蛋白質(zhì)結(jié)合生成RNA-誘導(dǎo)沉默復(fù)合體，或通過(guò)與靶分子mRNA結(jié)合，影響mRNA的翻譯及蛋白轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而促進(jìn)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-17-92[7]、miR-1914、miR-1915[8]、miR-21、miR-31、miR-145[9]等多種miRNA的異常表達(dá)均可能參與結(jié)直腸癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，促進(jìn)癌癥的侵襲與轉(zhuǎn)移。王朝杰等[10]報(bào)道，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展與miR-31高表達(dá)有關(guān)，通過(guò)特異性抑制HCT-116細(xì)胞中miR-31表達(dá)可有效抑制細(xì)胞的遷移能力。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中miR-31相對(duì)表達(dá)量高于癌旁組織，且癌組織中miR-31表達(dá)與患者TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)。提示結(jié)直腸組織中miR-31高表達(dá)參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生，并促進(jìn)癌癥的侵襲與轉(zhuǎn)移。miRNA在癌癥患者體內(nèi)發(fā)揮作用的機(jī)制包括：①與靶向mRNA的3′非編碼區(qū)域(3′-UTR)不完全配對(duì)，阻斷其翻譯過(guò)程，從而下調(diào)靶向mRNA表達(dá)；②與靶向mRNA的3′-UTR完全配對(duì)，使靶基因互補(bǔ)區(qū)發(fā)生特異性斷裂，從而產(chǎn)生基因沉默而無(wú)法表達(dá)；③通過(guò)加速靶向mRNA的3′端polyA的脫腺苷酸化，使靶向mRNA迅速降解[11]。有研究顯示，miR-31的靶向mRNA可能是PDCD4[12]。

PDCD4是一種抑癌基因，位于人類染色體10q24中，蛋白序列可編碼485個(gè)氨基酸。是細(xì)胞發(fā)生程序性死亡的調(diào)控因子，同時(shí)還可通過(guò)抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、翻譯及多種信號(hào)通路而發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。研究顯示，PDCD4在肺癌、乳腺癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤組織中均表現(xiàn)為程度不一的減少或缺失，可用于判斷癌癥的惡性程度及患者的生存時(shí)間[13，14]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織中PDCD4 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織，且癌組織中miR-31表達(dá)與患者TNM分期、分化程度及淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移有關(guān)，與文獻(xiàn)[15]報(bào)道一致。說(shuō)明低水平表達(dá)的PDCD4可促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展進(jìn)程。其作用機(jī)制可能在于：結(jié)直腸癌組織中PDCD4通過(guò)發(fā)生甲基化[15]或與上游基因miR-21結(jié)合，導(dǎo)致mRNA發(fā)生降解或表達(dá)沉默，從而使其對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用受到抑制；PDCD4基因還可通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子AP-1或其表達(dá)蛋白與翻譯起始因子eIF4A和eIF4G結(jié)合來(lái)抑制基因轉(zhuǎn)錄或翻譯，誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)化的抑制[16]。

本研究進(jìn)一步對(duì)癌組織中miR-31與PDCD4 mRNA表達(dá)的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，二者呈負(fù)相關(guān)。提示二者可相互作用，共同促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。miR-31可能通過(guò)靶向結(jié)合PDCD4 mRNA的3′-UTR，阻斷其翻譯過(guò)程或發(fā)生基因沉默，而降低或喪失其對(duì)腫瘤細(xì)胞的凋亡作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-31及PDCD4 mRNA均異常表達(dá)，兩者通過(guò)負(fù)調(diào)節(jié)作用，共同參與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可能成為結(jié)直腸癌早期診斷、治療及預(yù)后評(píng)估的新靶點(diǎn)。對(duì)于兩者的具體作用途徑尚待進(jìn)一步研究。

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