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·論著·

1株豬鼻支原體特異性單克隆抗體的制備及鑒定

田瑞雨1,4，熊祺琰1，倪博1，王佳1,2，韋艷娜1，馮志新1，邵國青1,3

目的制備與鑒定豬鼻支原體單克隆抗體，用于豬鼻支原體診斷及致病機(jī)理的研究。方法將豬鼻支原體全菌蛋白免疫小鼠，利用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體。鑒定其抗體亞型并對純化單抗的效價、特異性進(jìn)行鑒定。將該單抗用于菌落免疫雜交試驗、間接免疫熒光試驗。結(jié)果獲得了1株豬鼻支原體單抗，命名為Mhr-08。該單抗的亞型屬于IgG1，輕鏈為κ型。ELISA測定該純化單抗效價為1∶102 400，Western-blot檢測結(jié)果表明，該單抗與豬鼻支原體全菌蛋白在43 kDa處出現(xiàn)特異性反應(yīng)條帶，與豬其他支原體、大腸桿菌及KM2培養(yǎng)基無交叉反應(yīng)；該單抗為豬鼻支原體表面膜蛋白抗體，可成功應(yīng)用于菌落免疫雜交試驗；將其用于間接免疫熒光試驗可成功檢測出黏附于豬氣管上皮細(xì)胞上的豬鼻支原體。結(jié)論成功制備和鑒定出1株豬鼻支原體單克隆抗體，該特異性單抗的獲得為豬鼻支原體的診斷及致病機(jī)理的研究提供了工具。

豬鼻支原體；單克隆抗體；特異性

豬鼻支原體(Mycoplasmahyorhinis)是豬呼吸道中存在的一種常見病原菌[1]，可引起豬的關(guān)節(jié)炎、結(jié)膜炎、中耳炎、咽鼓管炎及肺炎等多種慢性炎癥[2-7]，通常由母豬或大豬經(jīng)呼吸道傳染給小豬，進(jìn)而從呼吸道侵染全身引發(fā)疾病的發(fā)生。豬鼻支原體也是實驗室細(xì)胞培養(yǎng)物的常見污染物[8]，同時近年來研究者發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體與人胃癌、大腸癌有高度相關(guān)性，并已經(jīng)從胃癌組織中直接分離到了豬鼻支原體[9]，而且Namiki等人發(fā)現(xiàn)豬鼻支原體可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞惡性程度增加[8]，Duan等人發(fā)現(xiàn)它還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移[10]。

高敏感及高特異性的診斷方法對疾病控制具有重要意義。目前，豬鼻支原體的實驗室診斷方法主要包括病原的分離與鑒定、雙抗體夾心ELISA、間接免疫熒光試驗、膠體金免疫層析法、PCR方法等[11-12]，其中免疫學(xué)試驗中所用抗體的質(zhì)量直接影響檢測效果。豬的不同支原體之間存在許多交叉抗原，針對豬鼻支原體特異性單克隆抗體可為該病診斷方法的建立提供重要工具。因此，本研究制備獲得1株特異性單抗，可為豬鼻支原體特異性檢測方法的建立提供工具，同時也為豬鼻支原體致病機(jī)理的研究提供重要材料。

1 材料與方法

1.1主要材料和試劑 豬鼻支原體由本實驗室分離，PCR鑒定[13]并保存；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、聚乙二醇(PEG4000)購自Sigma公司；HRP、FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗均購自武漢博士德生物工程公司；亞型鑒定試劑盒購自proteintech公司；其他試劑均為分析純等級。

1.2豬鼻支原體全菌抗原的制備 豬鼻支原體在KM2無細(xì)胞培養(yǎng)基中生長至對數(shù)期，將培養(yǎng)物于12 000 r/min離心30 min收集菌體。用無菌PBS緩沖溶液洗滌3次后，將菌體重懸于PBS緩沖液中，以55%功率，超聲3 s，暫停5 s,超聲破碎5 min即為免疫用抗原，BCA試劑盒測定蛋白濃度，分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3BALB/c小鼠的免疫 將豬鼻支原體全菌抗原與弗氏完全佐劑等體積混合，并充分乳化，皮下多點注射接種6周齡雌性BALB/c 小鼠10只(每只接種量25 μg)。4周后皮下注射弗氏不完全佐劑處理的抗原(佐劑與抗原1∶1乳化)，25 μg/只接種。4周后腹腔注射等量生理鹽水混合的抗原，細(xì)胞融合前3 d，用等量不加佐劑的抗原直接加強(qiáng)免疫1次，即可進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立 按常規(guī)方法，將小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，于96孔細(xì)胞板中進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞融合后第7 d，培養(yǎng)板孔底長出肉眼可見的克隆，吸取上清液，經(jīng)間接ELISA方法(見1.7)篩選只與豬鼻支原體反應(yīng)而不與豬肺炎支原體、豬滑液支原體、絮狀支原體反應(yīng)的陽性雜交瘤細(xì)胞。采用有限稀釋法將細(xì)胞懸液連續(xù)稀釋至統(tǒng)計上每孔加樣僅含單個細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至96孔板培養(yǎng)，經(jīng)過數(shù)次克隆化操作，直至所有克隆化細(xì)胞孔檢測陽性率為100%時，即可確定已獲得分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。將獲得的陽性雜交瘤細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。

1.5腹水的制備及單克隆抗體的純化 取6周齡健康雌性小鼠,腹腔注射0.5 mL液體石蠟致敏，一到兩周后，每只小鼠腹腔注射1～2×106個雜交瘤細(xì)胞，觀察小鼠狀態(tài)。7～10 d后待小鼠腹腔明顯膨大后收集腹水，離心取上清液即為腹水。以飽和硫酸銨法純化單克隆抗體。

1.6單抗類型及亞型鑒定 應(yīng)用小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒進(jìn)行測定。

1.7間接ELISA測定純化抗體效價 將豬鼻支原體全菌蛋白以10 μg/mL包被于ELISA反應(yīng)板，用含5% 牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉，將該單克隆抗體及鼠陰性血清對照用封閉液從1∶200開始做2倍遞增稀釋，37 ℃作用1 h，洗滌后加入1∶10 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，作用30 min后洗滌3次，TMB顯色10 min，酶標(biāo)儀測定OD450-630nm值。

1.8單抗特異性鑒定 利用Western-blot方法對該單抗的特異性進(jìn)行鑒定，按照常規(guī)方法進(jìn)行。將豬鼻支原體、豬肺炎支原體、絮狀支原體、豬滑液支原體及大腸桿菌全菌蛋白每種15 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，經(jīng)半干式電轉(zhuǎn)印裝置恒壓15V轉(zhuǎn)印20 min電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF膜)，用含3% BSA 的PBS 37 ℃封閉2 h，TBST洗滌后，以該純化單抗(1∶1 000稀釋)4 ℃過夜孵育。洗滌后加入1∶5 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，作用1 h后洗滌3次，ECL顯色拍照。

1.9 單抗與膜蛋白的反應(yīng)性鑒定

1.9.1支原體膜蛋白的提取 將豬鼻支原體菌液300 mL 12 000 r/min，4 ℃，離心30 min，收集菌體沉淀。菌體沉淀用無菌PBS反復(fù)洗滌3次，離心棄上清。向沉淀內(nèi)加入3 mL PBS混勻，重懸液放置-70 ℃凍存。取凍存的豬鼻支原體重懸液測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整至2 mg/mL，加入等體積含2%的吐溫的PBS，混勻后，37 ℃孵育90 min，超速離心機(jī)50 000 g離心1 h，取上清0.22 μm濾器過濾即豬鼻支原體膜蛋白，分裝-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9.2Western-blot檢測純化單抗與膜蛋白反應(yīng)性

按照1.8方法，將豬鼻支原體全菌蛋白及膜蛋白同時進(jìn)行Western-blot鑒定，確定該單抗的目的蛋白是否屬于膜蛋白。

1.10菌落免疫雜交試驗 將豬鼻支原體菌液以KM2培養(yǎng)基稀釋1 000倍，取100 μL稀釋后菌液涂布固體平板，大約1周后支原體在平板上長出單菌落，將PVDF膜放在菌落上，稍用力按壓5 min，然后將膜取下晾干，以3% BSA的PBS 37 ℃封閉2 h。TST洗滌3次后加入豬鼻支原體單抗(1∶200稀釋)，4 ℃過夜；洗滌后加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃ 作用1 h，洗滌后，ECL顯色。

1.11間接免疫熒光鑒定試驗 將豬鼻支原體按照107CCU/mL接種于豬氣管上皮細(xì)胞，1 mL/孔，37 ℃粘附6 h，PBS洗滌3次后，以4%多聚甲醛固定15 min；洗滌3次后加入含0.2% Triton X-100的PBS透化處理3 min，洗滌后以5% BSA封閉30 min，加入待鑒定的單抗，4 ℃過夜；洗滌后加入FITC 標(biāo)記的羊抗小鼠二抗，37 ℃作用1 h，洗滌后于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立 以洗滌的豬鼻支原體全菌抗原為免疫原免疫小鼠，融合的雜交瘤細(xì)胞經(jīng)間接ELISA篩選陽性克隆，對陽性孔進(jìn)行3次亞克隆，最終獲得1株穩(wěn)定分泌特異性抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為Mhr-08。

2.2亞型鑒定 該特異性單抗在酶標(biāo)板的G1和κ孔呈陽性，OD450值最高，其余孔不顯色，表明該單抗的亞型屬于IgG1，輕鏈為κ型(見表1)

表1 純化的Mhr-08單抗亞型鑒定結(jié)果
Tab.1 Subtype identification of the purified monoclonal antibody

IgAIgMIgG1IgG2aIgG2bIgG3κλOD4500．1030．1131．5990．110．1250．1521．2480．146

2.3純化抗體效價測定 經(jīng)ELISA檢測方法檢測，選擇P/N值≥2的最大稀釋度為該單抗ELISA的效價，因此判定該單抗效價為1∶102 400(見表2)。

表2 純化的Mhr-08單抗ELISA效價
Tab.2 The ELISA titer of the purified monoclonal antibody

抗體稀釋度(Dilutionmultipleoftheantibody)豬鼻支原體單抗(MonoclonalantibodyagainstM．hyorhinis)鼠陰性血清(Micenegativeserum)OD450-630nm抗體稀釋度(Dilutionmultipleoftheantibody)豬鼻支原體單抗(MonoclonalantibodyagainstM．hyorhinis)鼠陰性血清(Micenegativeserum)OD450-630nm1∶2000．7810．0841∶128000．1860．0281∶4000．6490．0551∶256000．130．0271∶8000．5260．0411∶512000．0960．0291∶16000．4390．0311∶1024000．0640．0291∶32000．3520．0291∶2048000．0450．0281∶64000．2580．0281∶4096000．0360．029

2.4單抗特異性鑒定 將豬鼻支原體、豬肺炎支原體、絮狀支原體、豬滑液支原體及大腸桿菌全菌蛋白及KM2培養(yǎng)基分別進(jìn)行SDS-PAGE(圖1A)，并用該豬鼻支原體單抗做Western-blot鑒定，得出該單抗與豬鼻支原體全菌蛋白在43 kDa左右有特異性條帶，且與其他支原體無交叉反應(yīng)(圖1B)。

M: Protein molecular weight standard; 1: M. hyorhinis; 2: M. hyopneumoiae; 3: M. flocculare; 4: M. hyosynoviae; 5: E. coli; 6: KM2 mediumA: SDS-PAGE of the whole bacteria protein; B: Western-blot identification of specificity of the prepared monoclonal antibody圖1 豬鼻支原體單抗特異性鑒定Fig.1 Specificity identification of M. hyorhinis monoclonal antibody

2.5單抗與豬鼻支原體膜蛋白反應(yīng) 將豬鼻支原體全菌蛋白及膜蛋白同時進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印后用該單抗孵育，可以看到膜蛋白與全菌蛋白一樣在43 kDa處出現(xiàn)特異性條帶。說明該單抗目的蛋白為豬鼻支原體膜蛋白。

M: Protein molecular weight standard; 1: the whole M. hyorhinis protein; 2: M. hyorhinis membrane protein.圖2 單抗與豬鼻支原體膜蛋白反應(yīng)Fig.2 Reaction of the prepared monoclonal antibody to Mycoplasma hyorhinis membrane protein

2.6菌落免疫雜交 該單抗與轉(zhuǎn)移到PVDF膜上的豬鼻支原體菌落出現(xiàn)特異性反應(yīng)，如圖3。

圖3 單抗用于菌落免疫雜交檢測(箭頭表示陽性雜交菌落)Fig.3 Colony immunobinding with the prepared monoclonal antibody(arrow indicates the positive colony)

2.7間接免疫熒光鑒定 將豬鼻支原體與豬氣管上皮細(xì)胞孵育6 h，洗去未結(jié)合支原體，加入該單抗檢測黏附細(xì)胞的豬鼻支原體，結(jié)果顯示出現(xiàn)特異性熒光，未感染支原體的陰性對照細(xì)胞無熒光，說明該單抗可特異性檢測豬鼻支原體，如圖4。

A: Negative control; B: Cytoadhesion of Mycoplasma hyorhinis圖4 單抗用于間接免疫熒光檢測豬鼻支原體黏附豬氣管上皮細(xì)胞(400×)Fig.4 Indirect immunofluorescence detection of Mycoplasma hyorhinis adhesion to swine tracheal epithelial cells with the prepared monoclonal antibody(400×)

3 討 論

豬鼻支原體在豬場感染率極高，常與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型等病原混合感染，造成嚴(yán)重的豬呼吸道綜合征，致使斷奶仔豬的死亡率顯著升高，給我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[14-15]。此外，豬鼻支原體還與多種人類腫瘤的發(fā)生有關(guān)，屬于人獸共患性病原體。目前，豬鼻支原體病的診斷技術(shù)尚不完善，也沒有商業(yè)化的試劑盒，研制高特異性高靈敏度的抗體對診斷具有重要意義，同時也是該病的致病機(jī)理研究的必要工具。

通過大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白免疫小鼠是制備單克隆抗體的常用方法，但是由于對豬鼻支原體表面蛋白的了解十分有限，本實驗利用超聲波裂解破碎的豬鼻支原體全菌蛋白免疫小鼠制備單抗。由于支原體體外培養(yǎng)對營養(yǎng)要求復(fù)雜，需要在培養(yǎng)基中加入血清提供支原體生長所需要的營養(yǎng)成分，為排除血清干擾，本研究制備抗原時，利用PBS將抗原離心洗滌3次，將支原體充分洗滌干凈，避免產(chǎn)生針對血清的單抗。

豬的不同支原體之間存在許多交叉抗原，比較基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)豬肺炎支原體、豬鼻支原體和絮狀支原體之間共同編碼序列占總數(shù)的58.9%以上[16]。為獲得只針對豬鼻支原體的特異性單抗，在雜交瘤細(xì)胞株篩選的過程中，以豬鼻支原體全菌蛋白為包被抗原，同時將豬肺炎支原體、絮狀支原體、豬滑液支原體的全菌蛋白作為對照，篩選僅與豬鼻支原體反應(yīng)的細(xì)胞。最終制備的單抗純化后再次經(jīng)Western-blot鑒定，證明與豬其他支原體、大腸桿菌及KM2培養(yǎng)基均無交叉反應(yīng)，為豬鼻支原體特異性單抗。支原體缺乏細(xì)胞壁，菌體外層由細(xì)胞膜構(gòu)成，細(xì)胞膜表面的膜脂蛋白是支原體與宿主互作的關(guān)鍵成份，也是診斷技術(shù)和疫苗研制的重要靶標(biāo)。本試驗獲得的單克隆抗體可以有效地和豬鼻支原體表面膜蛋白結(jié)合，菌落免疫雜交結(jié)果同樣也證實其可以有效結(jié)合豬鼻支原體表面，膜抗原單抗的獲得對于豬鼻支原體致病機(jī)制和診斷技術(shù)研究而言有重要幫助。

本研究成功制備了1株針對豬鼻支原體的單克隆抗體，Western-blot證明，該單抗特異性好，僅與豬鼻支原體反應(yīng)，與豬其他支原體及培養(yǎng)基不反應(yīng)，且為豬鼻支原體的膜蛋白抗體，成功應(yīng)用于菌落免疫雜交、間接免疫熒光等試驗，該單抗的獲得為豬鼻支原體病原診斷、致病機(jī)理的研究提供了實用工具。

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PreparationandidentificationofamonoclonalantibodyagainstMycoplasmahyorhinis

TIAN Rui-yu1,4, XIONG Qi-yan1, NI Bo1, WANG Jia1,2, WEI Yan-na1, FENG Zhi-xin1, SHAO Guo-qing1,3

(1.InstituteofVeterinaryMedicine,JiangsuAcademyofAgriculturalSciences/KeyLaboratoryofVeterinaryBiologicalEngineeringandTechnology,MinistryofAgriculture/NationalCenterforEngineeringResearchofVeterinaryBio-products,Nanjing210014,China;2.KeyLaboratoryofFoodQualityandSafetyofJiangsuProvince-StateKeyLaboratoryBreedingBase,Nanjing210014,China;3.JiangsuCollaborativeInnovationCenterforMeatProduction,ProcessingandQualityControl,Nanjing210095,China;4.CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

The aim of this study was to produce a monoclonal antibody againstMycoplasmahyorhinis, which would be useful in the diagnosis and pathogenesis researches ofM.hyorhinis. BALB/c mice were immunized with whole cell protein ofM.hyorhinis, and then the monoclonal antibody (McAb) was prepared by hybridoma technique. The isotype of the McAb was identified, and then the titer and specificity were analyzed. The prepared McAb was used to detectM.hyorhinisin the colony immunoboltting assay and indirect immunofluorescence assay. A hybridoma cell line was obtained, and was named Mhr-08. The McAb belonged to IgG1 isotype, and the light chain was κ type. The titer was detected to be 1∶102 400 by ELISA. The result of Western-blot indicated that this McAb strongly reacted to a 43 kDa protein ofM.hyorhinis, without cross-reaction with other swine mycoplasmas,Escherichiacolior KM2 medium. It revealed that the McAb recognized a surface membrane protein and was successfully applied to detectM.hyorhinisin colony immunoboltting assay. The mycoplasmas bound to the tracheal epithelial cells was successfully detected by using this McAb in indirect immunofluorescence assay. In conclusion, a McAb againstM.hyorhiniswas successfully prepared, which provides as a useful tool for the diagnosis and pathogenesis researches.

Mycoplasmahyorhinis; monoclonal antibody; specificity

s: Shao Guo-qing, Email: gqshaonj@163.com；Xiong Qi-yan, Email: qiyanxiongnj@163.com

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.11.003

國家重點研發(fā)計劃(No. 2016YFD0500702)

邵國青，Email：gqshaonj@163.com；

熊祺琰，Email: qiyanxiongnj@163.com

1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所·農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室·國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；

2.省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室，南京 210014；

3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心，南京 210095；

4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095

R375

A

1002-2694(2017)11-0962-05

Supported by the National Key Research and Development Plan(No. 2016YFD0500702)

2017-04-17編輯王曉歡