喬雅麗，董自星，2，*，宋鵬，劉曉光，2，路福平

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津300457）

黑曲霉天冬氨酰氨肽酶的分子克隆與酶學(xué)性質(zhì)解析

喬雅麗1，董自星1，2，*，宋鵬1，劉曉光1，2，路福平1

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.天津科技大學(xué)化工與材料學(xué)院，天津300457）

以黑曲霉CICIM F0510的互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA）為模板，通過PCR擴(kuò)增出一個(gè)新的天冬氨酰氨肽酶基因（vacuolar aspartyl aminopeptidase，vaap），并成功將其在畢赤酵母GS115中進(jìn)行表達(dá)。搖瓶水平上，重組菌GS115（pPIC9K-vaap）的氨肽酶酶活達(dá)到39.7 U/mL。該酶的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為55℃和9.5；在90℃或pH 8.0～10.0孵育1 h后，該酶仍能保持20%或80%以上的酶活；Sn2+和Co2+對(duì)其酶活有明顯促進(jìn)作用，F(xiàn)e3+、Ca2+、EDTA和SDS對(duì)其有抑制作用；該酶對(duì)L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺（Leu-pNA）的Km和Vmax分別是12.96 mmol/L和2.14 μg/（mL·min）。在所測(cè)的8種底物中，Leu-pNA是Vaap最適底物，且它對(duì)丙氨酸對(duì)硝基苯胺（Ala-pNA·HCl）和賴氨酸對(duì)硝基苯胺（Lys-pNA·2HCl）也有一定的水解能力。

天冬氨酰氨肽酶；黑曲霉；分子克??；酶學(xué)性質(zhì)

氨肽酶（Aminopetidases，EC 3.4.11）是一類外切蛋白酶，能水解蛋白或多肽鏈的N端特定肽鍵，釋放出相應(yīng)的游離氨基酸[1]。不同氨肽酶對(duì)N端氨基酸殘基的水解能力存在差異性，同一種氨肽酶對(duì)不同的N端氨基酸殘基的水解能力也不同。根據(jù)底物特異性的不同，可將氨肽酶細(xì)分為天冬氨酰氨肽酶、亮氨酸氨肽酶、纈氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶和脯氨酸氨肽酶等[2]。氨肽酶由于其獨(dú)特的水解和脫苦性能，在食品工業(yè)中特別是營(yíng)養(yǎng)保健品和調(diào)味品的制造方面潛力巨大。與其它蛋白酶復(fù)合使用可以深度水解蛋白質(zhì)，促進(jìn)良好風(fēng)味的形成[3-4]；運(yùn)用氨肽酶和蛋白質(zhì)酶解程度控制工藝，可制備多種功能性多肽[5]；部分特殊種類的氨肽酶還可用作醫(yī)學(xué)上的解毒劑或環(huán)境消毒劑[6]。

氨肽酶廣泛存在于哺乳動(dòng)物、植物和微生物中。由于動(dòng)植物體內(nèi)氨肽酶含量低、成分復(fù)雜，氨肽酶的提取成本較高。因此，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)氨肽酶成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)之一。目前，我國(guó)還沒有實(shí)現(xiàn)氨肽酶的自主生產(chǎn)，工業(yè)上使用的氨肽酶主要由丹麥諾維信、日本田野等公司生產(chǎn)，價(jià)格昂貴，影響了我國(guó)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。據(jù)報(bào)道，目前已有多種不同微生物來源的氨肽酶被克隆表達(dá)，主要是真核和原核微生物[2]。其中，已被克隆表達(dá)的黑曲霉氨肽酶有以下4種：賴氨酸氨肽酶（ApsA）[7]、二肽基氨肽酶（DapB）[8]、脯氨酸氨肽酶（PapA）[9]和苯丙氨酸氨肽酶（ApsC）[10]。

盡管黑曲霉CBS 513.88的基因組序列已經(jīng)于2007年解析完成并公布[11]，但黑曲霉的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中還有許多蛋白的功能未確定。目前已報(bào)道的天冬氨酰氨肽酶主要來源于哺乳動(dòng)物[12]、酵母[13]和米曲霉[14]等，而黑曲霉、植物和細(xì)菌來源的天冬氨酰氨肽酶未見報(bào)道。本文通過對(duì)黑曲霉基因組信息進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的編碼天冬氨酰氨肽酶的基因序列，通過分子克隆技術(shù)成功將該基因在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆與表達(dá)，并系統(tǒng)解析了其酶學(xué)性質(zhì)。為進(jìn)一步闡明其耐熱和耐堿機(jī)制以及挖掘其應(yīng)用價(jià)值等奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種與質(zhì)粒

黑曲霉（Aspergillus niger）CICIM F0510：中國(guó)高校工業(yè)微生物資源與信息中心；大腸桿菌（Escherichia coli）JM109、畢赤酵母（Pichia pastoris）GS115 和質(zhì)粒pPIC9k：保藏于天津科技大學(xué)生物催化與生物轉(zhuǎn)化研究室；黑曲霉采用CD培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，大腸桿菌的培養(yǎng)用LB培養(yǎng)基；畢赤酵母重組菌的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法按照Invitrogen的畢赤酵母操作手冊(cè)進(jìn)行。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶 Xba I、Sac I、Stu I 以及 PyrobestTMDNA聚合酶和T4DNA連接酶：寶生物工程（大連）有限公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物：美國(guó)Thermo公司；質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?、DNA純化回收試劑盒：北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司；cDNA合成試劑盒：Roche公司；G418、真菌RNA快速提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒：Invitrogen公司；化學(xué)合成底物L(fēng)eu-pNA、GlupNA、Arg-pNA·2HCl、Lys-pNA·2 HCl、Met-pNA·HCl、Ile-pNA·2HCl、Pro-pNA·HCl和 Ala-pNA·HCl：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 基因克隆與重組菌的構(gòu)建

質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物的純化、酶切、連接、電轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化子的篩選等均采用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行[15]?；蚩寺∵^程中所用引物（vaap1：5’-GTAGCCAAGAAGAACATCATGGGCC-3’；vaap2：5’-TGCTCTAGACTAAAAGTCAGCAAACTCCTTGTCAATCTCC-3’；下劃線部分為人工引入的限制性酶切位點(diǎn)）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。黑曲霉總RNA的提取與cDNA制備按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)與制備

將畢赤酵母重組菌GS115（pPIC-vaap）在YPD平板上進(jìn)行純化，挑取單菌落接種于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600=2.6，約18 h～20 h）。按1%接種量轉(zhuǎn)接于25 mL BMGY培養(yǎng)基，再于30℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（OD600=2.6，約 16h～18h）。室溫下5 000r/min離心5 min回收酵母細(xì)胞，棄上清，將細(xì)胞重懸于適當(dāng)體積的BMMY培養(yǎng)基中，至OD600值為1.0，于30℃繼續(xù)培養(yǎng)并開始誘導(dǎo)。每隔24小時(shí)補(bǔ)加100%甲醇至終濃度為0.5%以維持誘導(dǎo)。每隔24小時(shí)取樣一次，并測(cè)定酶活，直至120 h。發(fā)酵結(jié)束后，離心（4℃，8000r/min）收集上清液，即為粗酶液，于-20℃保存。將粗酶液用30%～70%的硫酸銨分級(jí)沉淀后，再用截留分子量為50 kDa的透析袋透析，從而對(duì)重組氨肽酶Vaap進(jìn)行初步純化。

1.5 重組氨肽酶活力測(cè)定

重組氨肽酶的酶活測(cè)定按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行[17]。其一般步驟是：將酶液用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）進(jìn)行適當(dāng)稀釋，取稀釋液0.4 mL，加入6 mL 50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）。40℃下預(yù)熱5 min后，加入0.4 mL 26 mmol/L L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺（LNA）乙醇溶液?？瞻讓?duì)照中加入0.4 mL的無(wú)水乙醇，水浴反應(yīng)10 min。反應(yīng)結(jié)束后立即取出，冰浴5 min終止反應(yīng)。測(cè)定反應(yīng)液在405 nm波長(zhǎng)下的吸光值。酶活定義為：在40℃下，單位體積的酶液在單位時(shí)間內(nèi)水解底物生成1 μg對(duì)硝基苯胺所消耗的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.6 重組酶酶學(xué)性質(zhì)與特征分析

1.6.1 最適溫度的測(cè)定

在不同溫度（20、30、40、45、50、55、60、65、70 ℃）pH 8.0的條件下測(cè)定酶活，考察溫度對(duì)重組酶酶活的影響。

1.6.2 最適pH值的測(cè)定

在不同 pH 值（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5）和50℃測(cè)定酶活，考察pH值對(duì)酶活的影響。所用緩沖液為：0.1 mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）和 0.05 mol/L 甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH 9.0、9.5、10.0、10.5）。

1.6.3 溫度穩(wěn)定性的測(cè)定

分別將經(jīng)過適當(dāng)稀釋的重組酶酶液在40℃～90℃下保溫0.5、1、2、3 h，按酶活測(cè)定方法在最適pH值條件下測(cè)定殘留酶活。以未進(jìn)行熱處理的酶液酶活力為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，考察重組酶在不同溫度條件下的穩(wěn)定性。

1.6.4 pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

分別將酶液在 pH 7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的緩沖液中保溫1 h，在最適溫度下測(cè)定剩余酶活，考察重組酶在不同pH值條件下的穩(wěn)定性。

1.6.5 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

分別在重組酶與底物進(jìn)行反應(yīng)的體系中加入終濃度為0.1 mmol/L和1 mmol/L的金屬離子（Ca2+、Zn2+、Mn2+、Co2+、Sn2+和 Fe3+） 或終濃度為 1 mmol/L 的化學(xué)試劑（EDTA和SDS）。以未加金屬離子的反應(yīng)體系的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活力。

1.6.6 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

分別以不同濃度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）的 L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺為底物，在重組酶的最適作用溫度和pH值條件下進(jìn)行反應(yīng)，然后按照1.5的方法進(jìn)行酶活測(cè)定。并采用雙倒數(shù)法（Lineweaver-BurK法）作圖，計(jì)算出米氏常數(shù)Km及最大反應(yīng)速度Vmax。

1.6.7 底物特異性分析

分別以 1 mmol/L 的 Leu-pNA、Glu-pNA、ArgpNA·2HCl、Lys-pNA·2HCl、Met-pNA·HCl、Ile-pNA·2HCl、Pro-pNA·HCl和 Ala-pNA·HCl） 為底物進(jìn)行反應(yīng)，按1.5所述方法測(cè)定酶活。以Leu-pNA為底物時(shí)測(cè)定的酶活為100%，計(jì)算其它底物的相對(duì)酶活。

1.7 序列測(cè)定與分析

基因的核苷酸序列測(cè)定采用Sanger法[16]進(jìn)行，所測(cè)得序列，經(jīng)DNASTAR拼接，利用DNAMAN初步分析。利用軟件Clustal X2和Bioedit 7.0.9將vaap的氨基酸序列與其它來源天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并通過軟件MEGA 4.0以鄰近法（Neighbourjoining）構(gòu)建進(jìn)化樹，分析它們親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[17]。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉天冬氨酰氨肽酶基因vaap的克隆與序列分析

采用BLAST等分析方法對(duì)A.niger CBS 513.88的基因組序列（EMBL AM270980-AM270998）進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的氨肽酶基因（vacuolar aspartyl aminopeptidase，vaap）。以此為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)出相應(yīng)的核苷酸引物。然后以A.niger CICIM F0510的cDNA為模板對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，用Xba I進(jìn)行完全酶切，并與經(jīng)過SnaB I和Avr II酶切的pPIC9K進(jìn)行連接。再通過Pst I酶切，驗(yàn)證了重組質(zhì)粒的正確性，獲得了重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC-vaap。進(jìn)一步通過核苷酸序列測(cè)定，確認(rèn)了所克隆的vaap基因具有完整的開放閱讀框（ORF），且其核苷酸序列和氨基酸序列與A.niger CBS 513.88基因組公布的序列完全一致。該基因的大小為1551 bp，編碼516個(gè)氨基酸。

將不同來源的天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如圖1所示。

AnVaap 與 AkDap、AfDap、AlDap、OcDap、TmVaap和ScLap的氨基酸序列相似度分別為99.42%、84.77%、84.80%、70.59%、69.17%和40.67%。在它們的氨基酸序列中，保守的組氨酸、天冬氨酸和谷氨酸殘基分別有3個(gè)、5個(gè)和2個(gè)（圖1中方框標(biāo)出的氨基酸殘基）。組氨酸、半胱氨酸、谷氨酸和天冬氨酸通常是鋅離子的配體[18]，所以上述這些保守的氨基酸殘基可能與Vaap的活性中心和鋅離子結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)[13，19]。通過與Homo sapiens天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，可知底物結(jié)合口袋的關(guān)鍵氨基酸殘基為His390、Tyr400、Ser415和Met422[20]。箭頭標(biāo)出的氨基酸殘基只在天冬氨酰氨肽酶中是保守的（是Lys），而在M18家族的其它酶中不是保守的，而且這個(gè)位點(diǎn)的氨基酸殘基可能對(duì)酶的底物特異性起決定作用[13]。進(jìn)化樹構(gòu)建的結(jié)果表明，天冬氨酰氨肽酶Vaap與酵母氨肽酶I（ScLap）的親緣關(guān)系比較近，同屬于金屬蛋白酶的M18家族，見圖 2[13]。

2.2 黑曲霉氨肽酶Vaap在畢赤酵母中的高效表達(dá)

將重組質(zhì)粒pPIC-vaap經(jīng)限制性酶Sal I線性化后，電轉(zhuǎn)化入畢赤酵母GS115中，并通過G418平板篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子，獲得重組菌GS115（pPIC-vaap）。在250 mL搖瓶培養(yǎng)120 h后，重組菌的胞外氨肽酶酶活達(dá)到最高，為39.7 U/mL。通過鹽析和透析，將發(fā)酵制備的粗酶液進(jìn)行了初步純化，SDS-PAGE分析的結(jié)果表明（圖3），Vaap的純度已經(jīng)達(dá)到酶學(xué)特征分析的要求；其分子量約為55.0 kDa，與理論分子量大小相符。

2.3 重組氨肽酶的酶學(xué)特征

2.3.1 最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性的測(cè)定

溫度對(duì)Vaap的酶活和穩(wěn)定性的影響見圖4。

圖1 不同來源天冬氨酰氨肽酶的氨基酸序列比對(duì)Fig.1 Multiple sequence alignment of aspartyl aminopeptidases from different microorganisms

圖2 進(jìn)化樹描述不同來源的天冬氨酰氨肽酶的遺傳距離Fig.2 Phylogenetic tree describing the genetic distances among various aspartyl aminopeptidases from different microorganisms

圖3 蛋白電泳分析重組酶Vaap的純化效果Fig.3 SDS-PAGE analysis of the purification of recombinant enzyme Vaap

圖4 溫度對(duì)Vaap的酶活和穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effect of temperature on the activity and stability of Vaap

在不同溫度（20℃～70℃）下測(cè)定氨肽酶的酶活，結(jié)果如圖4a所示。Vaap的最適作用溫度是55℃，在30℃～55℃其相對(duì)活力達(dá)到80%以上，從20℃～70℃相對(duì)酶活力均達(dá)到60%以上，顯示該酶具有較寬泛的作用溫度范圍。

熱穩(wěn)定性的研究結(jié)果如圖4b所示，Vaap在40℃～80℃保溫30min后，剩余酶活力在60%以上；在40℃～60℃保溫3 h剩余酶活力仍在50%以上；而在90℃孵育30 min后，其酶活仍能保留40%左右，表明其熱穩(wěn)定性較好。該酶的最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性高于A.oryzae天冬氨酰氨肽酶的最適反應(yīng)溫度（50℃）和熱穩(wěn)定性（80℃孵育1 h，酶幾乎完全失活）[14]。Vaap是目前已報(bào)道的少數(shù)耐熱氨肽酶之一，良好的耐熱性使得該酶可以提高化學(xué)反應(yīng)速率、降低成本、簡(jiǎn)化工藝、提高產(chǎn)品質(zhì)量、活性穩(wěn)定和耐貯藏等優(yōu)點(diǎn)[21]。因此，Vaap具有更廣闊的應(yīng)用前景。

2.3.2 最適作用pH值和pH值穩(wěn)定性的測(cè)定

pH值對(duì)Vaap的酶活和穩(wěn)定性的影響見圖5。

圖5 pH值對(duì)Vaap的酶活和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of pH on the activity and stability of Vaap

在不同pH值（pH 5.5～10.5）的反應(yīng)體系中測(cè)定酶活，結(jié)果匯總于圖5。Vaap在pH 9.5下表現(xiàn)出最高活力，而在pH 8.5～10.0相對(duì)酶活達(dá)到80%以上，在酸性條件下水解活性很低，表明該酶是一種堿性氨肽酶。如圖5所示，Vaap在pH 8.0～10.0條件下相對(duì)穩(wěn)定，孵育1 h后殘留酶活仍保持在60%以上；在pH 9.5時(shí)最穩(wěn)定，保留有96.77%的活性，說明該酶的pH值穩(wěn)定范圍在8.0～10.0，與其發(fā)揮活性的pH值范圍相同。與該酶相比，米曲霉、酵母和哺乳動(dòng)物（如兔子腦細(xì)胞）來源的天冬氨酰氨肽酶的最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定范圍均偏中性[12-14]。

2.3.3 金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)酶活的影響

不同金屬離子或化合物對(duì)酶活的影響如表1所示。

0.1 mmol/L 和 1 mmol/L 的 Zn2+、Co2+以及 1 mmol/L Sn2+對(duì)Vaap的酶活有促進(jìn)作用，而這兩種濃度的Fe3+和Ca2+對(duì)酶活有不同程度的抑制作用。SDS對(duì)該酶有強(qiáng)烈的抑制作用。與酵母和米曲霉的天冬氨酰氨肽酶[13-14]相同，該酶的活性受到金屬螯合劑EDTA的明顯抑制，而哺乳動(dòng)物來源的天冬氨酰氨肽酶的酶活不受EDTA的影響[12]，表明該酶是一種金屬離子螯合酶。

表1 金屬離子或化學(xué)試劑對(duì)Vaap酶活的影響Table 1 Effect of metal ions or chemicals on the enzymatic activity of Vaap

2.3.4 動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測(cè)定

以不同濃度（2、4、6、8、10、12 mmol/L）的 L-亮氨酰對(duì)硝基苯胺為底物，在最適溫度和pH值條件下進(jìn)行反應(yīng)，然后按照1.5所述方法測(cè)定酶活，以1/V對(duì)1/S作雙倒數(shù)圖。根據(jù)雙倒數(shù)圖，計(jì)算獲得該酶的米氏常數(shù)Km值為12.96 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax為2.14 μg/（mL·min）。其中，Km值遠(yuǎn)高于兔子腦細(xì)胞天冬氨酰氨肽酶對(duì)不同底物的 Km值（0.05 mmol/L～8.4 mmol/L）[12]，表明其底物親和力較低。這可能是由于所用的底物不同造成的，如Asp-Ala-Ala-Leu和Asp-Ala-Asp-Leu等三肽。

2.3.5 底物特異性研究

分別以8種不同的aminoacyl-pNAs為底物，研究重組氨肽酶的底物特異性，結(jié)果匯總于圖6。

由圖6可知，在8種底物中，Leu-pNA為Vaap的最適作用底物，Vaap對(duì) Ala-pNA·HCl和 Lys-pNA·2HCl也有一定的水解能力，對(duì)其余底物無(wú)水解作用。該酶對(duì) Asp-pNA·HCl、血管緊張素 I（Angiotensin I）和血管緊張素II（Angiotensin II）等底物的水解作用還有待進(jìn)一步研究。

圖6 重組氨肽酶的底物特異性Fig.6 Substrate specificity of recombinant aminopeptidase

3 結(jié)論

本研究首次將黑曲霉CICIM F0510來源的天冬氨酰氨肽酶基因vaap在畢赤酵母中進(jìn)行了克隆表達(dá)，并對(duì)其基本酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)解析，包括最適反應(yīng)溫度和熱穩(wěn)定性、最適反應(yīng)pH值和pH值穩(wěn)定性、金屬離子對(duì)酶活的影響、動(dòng)力學(xué)參數(shù)和底物特異性等。搖瓶水平上，重組酶的最高酶活為39.7 U/mL。酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，該酶的最適反應(yīng)溫度和pH值分別為55℃和9.5；在90℃孵育30 min后，其酶活仍能保留40%左右，而且在pH 8.0～10.0孵育1 h后殘留酶活在60%以上。良好的耐熱性和耐堿性使得該酶在工業(yè)應(yīng)用中具有降低成本和簡(jiǎn)化工藝等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景十分廣闊。這為后續(xù)挖掘其應(yīng)用價(jià)值以及解析其耐熱和耐堿機(jī)制提供了基礎(chǔ)材料。

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Molecular Cloning and Biochemical Characterization of An Aspartyl Aminopeptidase from Aspergillus niger

QIAO Ya-li1，DONG Zi-xing1，2，*，SONG Peng1，LIU Xiao-guang1，2，LU Fu-ping1
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.College of Chemical Engineering and Materials Science，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

In the present study，using complementary DNA （cDNA）of Aspergillus niger CICIM F0510 as the template，a novel gene （vaap）encoding aspartyl aminopeptidase was amplified by PCR and then successfully expressed in Pichia pastoris GS115.At the shake-flask level，the aminopeptidase activity of recombinant strain GS115 （pPIC9K-vaap）was 39.7 U/mL.The optimum temperature and pH of recombinant enzyme Vaap were shown to be 55℃ and 9.5，respectively.After incubation at 90℃or pH 8.0-10.0 for 1 h，this enzyme retained 20%or 80%of its initial activity.The activity of Vaap was significantly enhanced by Sn2+and Co2+，but inhibited by Fe3+，Ca2+，EDTA and SDS.Its Kmand Vmaxvalues towards L-leucine-pnitroanilide （Leu-pNA）were determined to be 12.96 mmol/L and 2.14 μg/（mL·min），respectively.Among the eight substrates tested，LeupNA was the preferred substrate for Vaap，and it also hydrolyzed alanine-pnitroanilide（Ala-pNA·HCl）and Lysine-pnitroanilide（Lys-pNA·2HCl）.

aspartyl aminopeptidase；Aspergillus niger；molecular cloning；enzymatic properties

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.036

喬雅麗（1991—），女（漢），碩士，研究方向：酶工程與技術(shù)。

*通信作者：董自星，助理研究員，研究方向：酶工程與技術(shù)。

2017-05-12