楊俊譽(yù)　陳小龍　高玲玲　黃瓊

摘要：從云南省感染水稻白葉枯病的病株和健康植株上共分離得到475株植株內(nèi)生細(xì)菌，從中篩選出167株對(duì)水稻白葉枯病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzae，簡稱Xoo）有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌。病株體內(nèi)拮抗內(nèi)生細(xì)菌的菌株數(shù)量多于健康植株，病株和健康植株根、莖、葉中的內(nèi)生細(xì)菌菌株數(shù)量略有不同，從病株根、莖、葉中分離出的拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的抑制作用差異不顯著；而從健康植株的莖部和葉部分離出的拮抗菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的抑制作用顯著高于根部拮抗菌（P<005）。采用對(duì)峙培養(yǎng)方法測定并比較分離菌株的抑菌能力，得到30株對(duì)白葉枯病菌抑菌能力較強(qiáng)的菌株，并對(duì)其進(jìn)行5種病菌的抑菌譜測定。結(jié)果顯示，30株菌株對(duì)5種水稻病害的病原菌均有抑制作用。通過16S rDNA序列分析發(fā)現(xiàn)，水稻內(nèi)生拮抗細(xì)菌分別與GenBank序列數(shù)據(jù)庫中17個(gè)屬的細(xì)菌相似性較高，其中，農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為發(fā)病植株特有的拮抗細(xì)菌屬，而節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和考克斯菌屬（Kocuria）僅存在于對(duì)照植株中。

關(guān)鍵詞：水稻白葉枯病病菌；內(nèi)生細(xì)菌；拮抗細(xì)菌；抑菌譜；16S rDNA；種群結(jié)構(gòu)

中圖分類號(hào)： S4351114+7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0100-06

收稿日期：2016-05-25

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號(hào)：201303015）。

作者簡介：楊俊譽(yù)（1990—），男，云南楚雄人，碩士研究生，主要從事植物細(xì)菌病害研究，E-mail：yangjunyu900708@163com；陳小龍（1982—），男，河南安陽人，博士，主要從事植物病理學(xué)研究，E-mail：cxlong119@163com。

通信作者：黃瓊，博士，教授，主要從事植物病理學(xué)研究。E-mail：huangqiong88hs@163com。

水稻是我國主要的糧食作物，由水稻白葉枯病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzae，簡稱Xoo）引起的水稻白葉枯病是水稻生產(chǎn)上一種重要的細(xì)菌性病害1-2]。自1884年水稻白葉枯病首次在日本九州島福岡地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，至今已有120多年的歷史，盡管一些化學(xué)農(nóng)藥已在生產(chǎn)上用于防治該病，但效果并不十分理想。

Bayot等對(duì)植物內(nèi)生細(xì)菌的種類、定殖部位以及與植物的生理與病理的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行了大量的研究3]。Kennedy等報(bào)道，大多數(shù)植物內(nèi)生細(xì)菌具有一定的運(yùn)動(dòng)性，這不僅有利于內(nèi)生細(xì)菌吸收營養(yǎng)物質(zhì)，還有利于其避開外界環(huán)境的壓力以保護(hù)自己4]。同時(shí)大多數(shù)內(nèi)生細(xì)菌定殖于植物薄壁組織的細(xì)胞間隙，有些定殖于細(xì)胞質(zhì)中，有些可穿過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，有些則定殖于微管束組織中，但數(shù)量較少，可能是因?yàn)榫S管束中出現(xiàn)大量的細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致維管束阻塞，使植物致病5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，不同寄主植物品種中內(nèi)生細(xì)菌的種群不同，即使是同一種植物的不同品種之間，其內(nèi)生細(xì)菌的種類、數(shù)量和分布均有一定甚至較大的差異7-9]。

利用內(nèi)生細(xì)菌防治水稻白葉枯病已有較多的研究，但是關(guān)于白葉枯病的發(fā)生對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌的分布和拮抗作用的影響鮮見報(bào)道。本研究分析白葉枯病的發(fā)生對(duì)水稻拮抗內(nèi)生細(xì)菌的種類以及分布特性的影響，旨在為水稻白葉枯病的防治及水稻拮抗內(nèi)生細(xì)菌的開發(fā)與利用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111供試內(nèi)生細(xì)菌

樣品采集于云南省紅河州植物保護(hù)站試驗(yàn)田（23°24′N，103°21′E）。水稻品種為宜香2239，對(duì)水稻白葉枯病表現(xiàn)為中抗。在水稻孕穗期自然發(fā)病的田塊進(jìn)行采樣，病株和健康植株（對(duì)照）來自于同一試驗(yàn)田的同一品種。試驗(yàn)田中共有2個(gè)發(fā)病位置，在發(fā)病區(qū)域內(nèi)呈“S”形取樣，采集病株共計(jì)30叢；并于發(fā)病植株與健康植株的交界處周圍10 m的位置采集健康植株共計(jì)30叢，采集的樣品生長狀態(tài)一致。

112供試植物病原細(xì)菌和真菌

2種病原細(xì)菌分別為水稻白葉枯病病菌、水稻細(xì)菌性條斑病病菌（Xanthomonas oryzae pv oryzicola），3種病原真菌分別為水稻稻瘟病病菌（Pyricularia oryzae Cav）、紋枯病病菌（Rhizoctonia solani Kühn）、惡苗病病菌（Fusariun moniliforme Sheld），上述5種病原菌均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

12試驗(yàn)方法

121水稻內(nèi)生細(xì)菌的分離

樣品用自來水沖洗干凈，用濾紙吸干水分后分別稱取1 g根、莖、葉進(jìn)行表面滅菌10]。其中發(fā)病植株根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌的分離選擇病健交界處，而對(duì)照植株選取3個(gè)大小、位置均與發(fā)病植株一致的部位進(jìn)行分離。將經(jīng)表面消毒的材料置于已滅菌的研缽中碾磨至糊漿狀，加入9 mL滅菌水，靜置15 min，再取200 μL上清液涂布于NA培養(yǎng)基中，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d。參考《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中的平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行細(xì)菌數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，采用《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》中的細(xì)菌常規(guī)鑒定法進(jìn)行細(xì)菌的分類鑒定11]，確定具有相同菌落形態(tài)的細(xì)菌歸為一類。同時(shí)挑選菌落形態(tài)、色澤等特征有差異的單菌落，于NA培養(yǎng)基上劃線純化，最終將純化的細(xì)菌菌落移入含NA培養(yǎng)基的試管中，并保存于4 ℃冰箱中備用。

122拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選

1221對(duì)水稻白葉枯病病菌和水稻細(xì)菌性條斑病病菌的拮抗作用

取200 μL病原細(xì)菌懸浮液于NA平板上，均勻涂布后吹干，平板中心放置直徑為5 mm的圓形滅菌濾紙片，取5 μL分離保存的內(nèi)生細(xì)菌經(jīng)活化后的菌液接種在濾紙片上，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h后觀察和測量抑菌圈的直徑。每個(gè)處理3次重復(fù)。endprint

1222對(duì)水稻稻瘟病病菌、紋枯病病菌、惡苗病病菌的抑制作用

使用PDA培養(yǎng)基活化各病原真菌12]，用直徑為 6 mm 的打孔器打出病原真菌的菌餅，用接種針將菌餅放置在新鮮的PDA培養(yǎng)平板中心，然后在距離菌餅2 cm處用滅菌牙簽采用3點(diǎn)接種法接種拮抗菌株，3個(gè)重復(fù)，并以不接種拮抗菌株作為對(duì)照，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。當(dāng)對(duì)照中的菌落長滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，測量具有抑菌現(xiàn)象菌株的抑菌圈直徑。

123拮抗內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定

1231拮抗內(nèi)生細(xì)菌的PCR鑒定

基因組DNA的制備選用十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB法）13]。利用細(xì)菌 16S rDNA 通用引物27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1 492r（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對(duì)具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA PCR擴(kuò)增14-15]。引物合成和測序工作均由深圳華大基因科技有限公司完成。

1232拮抗內(nèi)生細(xì)菌的鑒定及16S rDNA序列分析

采用細(xì)菌常規(guī)鑒定法對(duì)具有拮抗作用的細(xì)菌菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分類11]，選取具有不同菌落形態(tài)和拮抗功能的代表菌株進(jìn)行16S rDNA序列測定。利用Blast程序在GenBank序列數(shù)據(jù)庫中獲取同源性最高的菌株登錄號(hào)（http：wwwncbinlmnihgovblastBlastcgi），定義16S rDNA序列同源性大于97%的菌株為同一個(gè)種16]。并向NCBI數(shù)據(jù)庫提交上述菌株序列，獲得其基因登錄號(hào)。同時(shí)對(duì)根、莖、葉中分離的所有內(nèi)生拮抗菌株數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，確定感染白葉枯病病菌的水稻植株與健康水稻植株中內(nèi)生拮抗細(xì)菌種群菌株數(shù)量的比例分布，并用該比例定義為細(xì)菌種群的結(jié)構(gòu)分布，為拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選奠定基礎(chǔ)。

13數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和繪圖，運(yùn)用SPSS 200統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析，顯著性水平設(shè)定為P<005。

2結(jié)果與分析

21水稻內(nèi)生細(xì)菌的分離

通過對(duì)健康植株根、莖、葉進(jìn)行水稻白葉枯病病菌的分離，10-1～10-8 CFUg懸浮液在NA平板上均沒有分離到水稻白葉枯病病菌，表明對(duì)照植株為不帶白葉枯病病菌的樣品。

本研究從水稻白葉枯病株和健康植株植物組織中共獲得475株內(nèi)生細(xì)菌，所有分離得到的內(nèi)生細(xì)菌單個(gè)菌株種群數(shù)量平均值為69×105 CFUg。其中，從病株中共分離出229株內(nèi)生細(xì)菌，根部99株，莖部58株，葉部72株；JP3]從健康植株中共分離出246株內(nèi)生細(xì)菌，根部106株，莖部62株，葉部78株。

22拮抗內(nèi)生細(xì)菌的篩選

由表1可知，從475株內(nèi)生細(xì)菌中共篩選出167株對(duì)水稻白葉枯病病菌有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌菌株，其中在病株上獲得93株，在對(duì)照植株上獲得74株，在發(fā)病植株內(nèi)分離得到的拮抗內(nèi)生細(xì)菌的菌株數(shù)量多于對(duì)照植株。從水稻植株不同部位分離得到的內(nèi)生細(xì)菌菌株數(shù)量存在明顯的差異，病株中不同部位分離得到的菌株株數(shù)表現(xiàn)為葉>根>莖，而對(duì)照植株中不同部位分離得到的菌株株數(shù)表現(xiàn)為根>葉>莖。經(jīng)白葉枯病病菌對(duì)峙培養(yǎng)試驗(yàn)測定抑菌效果，組3、組4的抑菌效果較好，組1的抑菌效果最差。拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的抑菌直徑在30～80 mm之間的組2，其拮抗細(xì)菌的菌株數(shù)量在發(fā)病植株和對(duì)照植株中差異較大。

由表2可知，比較發(fā)病植株和對(duì)照植株的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病菌的抑菌圈直徑得出，在組1（F=0421，P>005）、組2（F=1179，P>005）和組3（F=0757，P>005）中差異不顯著；而組4中發(fā)病植株內(nèi)生細(xì)菌的抑菌圈直徑顯著大于對(duì)照植株（F=5922，P<005），其中發(fā)病植株和對(duì)照植株莖（F=0022，P>005）、葉（F=1774，P>005）中的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑差異不顯著，發(fā)病植株根（F=21778，P<005）中的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑顯著大于對(duì)照植株。拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的影響主要表現(xiàn)在抑菌能力較強(qiáng)的細(xì)菌上，且這種影響主要體現(xiàn)在根部。

發(fā)病植株和對(duì)照植株的拮抗內(nèi)生細(xì)菌的抑菌圈直徑差異不顯著（F=0148，P>005），其中兩者的根與根（F=2077，P>005）、莖與莖（F=0233，P>005）之間的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑差異也不顯著，但發(fā)病植株和對(duì)照植株的葉與葉（F=8054，P<005）之間的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)水稻白葉枯病病菌的抑菌圈直徑存在顯著性差異，病株葉部拮抗細(xì)菌的抑菌圈直徑顯著高于對(duì)照植株。同時(shí)，病株的根與莖（F=1040，P>005）、根與葉（F=0270，P>005）、莖與葉（F=2760，P>005）以及對(duì)照植株的莖與葉（F=1437，P>005）之間的抑菌圈直徑大小差異均不顯著，但對(duì)照植株莖部（F=4604，P<005）和葉部（F=14681，P<005）的內(nèi)生細(xì)菌抑菌圈直徑均顯著高于根部。研究表明，水稻白葉枯病害的發(fā)生提高了水稻根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌的抑菌能力，并且這種改變在水稻的根部最為明顯。

為了測定對(duì)水稻白葉枯病病菌抑菌效果較好的拮抗細(xì)菌的抑菌譜，采用對(duì)峙培養(yǎng)法測定組4中30株菌株對(duì)水稻白葉枯病病菌、水稻細(xì)菌性條斑病病菌、稻瘟病病菌、水稻紋枯病病菌、水稻惡苗病病菌的拮抗能力。由表3可知，這30株菌株對(duì)5種水稻病害的病原菌均有一定的抑制作用，其中對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病病菌的抑菌圈直徑為46～339 mm，對(duì)水稻稻瘟病病菌的抑菌圈直徑為69～239 mm，對(duì)水稻紋枯病病菌的抑菌圈直徑為46～135 mm，對(duì)水稻惡苗病病菌的抑菌圈直徑為41～145 mm。方差分析結(jié)果表明，對(duì)照植株的內(nèi)

生細(xì)菌對(duì)水稻細(xì)菌性條斑病病菌（F=9376，P<005）和水稻紋枯病病菌（F=17761，P<005）的抑菌圈直徑均顯著大于發(fā)病植株的內(nèi)生細(xì)菌，而對(duì)水稻稻瘟病病菌（F=1256，P>005）和水稻惡苗病病菌（F=0127，P>005）的抑菌圈直徑與發(fā)病植株的內(nèi)生細(xì)菌差異不顯著。endprint

23拮抗內(nèi)生細(xì)菌的鑒定及16S rDNA基因序列分析

將具有拮抗作用的167株內(nèi)生細(xì)菌依據(jù)形態(tài)學(xué)分為48類內(nèi)生細(xì)菌，選取其中48株代表菌株進(jìn)行16S rDNA 通用引物27f、1 492 r的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行測序。通過16S rDNA序列分析表明，水稻內(nèi)生細(xì)菌分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中17個(gè)屬的細(xì)菌相似性較高（表4）。因此，167株內(nèi)生細(xì)菌分別屬于17個(gè)細(xì)菌屬。確定感染白葉枯病病菌的水稻植株與健康水稻植株中內(nèi)生拮抗細(xì)菌屬群菌株數(shù)量的比例分布，統(tǒng)計(jì)水稻拮抗內(nèi)生細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)。由圖1可知，發(fā)病植株的內(nèi)生拮抗細(xì)菌共包含14個(gè)屬，健康植株包含11個(gè)屬，其中不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、微小桿菌屬（Exiguobacterium）、賴氨酸芽孢桿菌屬（Lysinibacillus）、微桿菌屬（Microbacterium）、類芽孢桿菌屬（Paenibacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、寡養(yǎng)單胞菌屬（Stenotrophomonas）共9個(gè)屬為發(fā)病植株和健康植株所共有，農(nóng)桿菌屬（Agrobacterium）、短狀桿菌屬（Brachybacterium）、克雷伯菌屬（Klebsiella）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）和葡萄球菌屬（Staphylococcus）為發(fā)病植株特有的拮抗細(xì)菌屬，而節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）和考克斯菌屬（Kocuria）僅存在于健康植株中。發(fā)病植株和健康植株內(nèi)生拮抗細(xì)菌的優(yōu)勢菌屬均為芽孢桿菌屬，且健康植株中芽孢桿菌屬的拮抗細(xì)菌所占比例較高。

3結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，水稻健康植株和發(fā)病植株的根、莖、葉中均有大量的內(nèi)生細(xì)菌， 其種群數(shù)量平均值為 69×105 CFUg，

這與黎起秦等報(bào)道的水稻、小麥內(nèi)生細(xì)菌的種群數(shù)量17-18]相似，而與Seghers等報(bào)道的玉米、甘蔗根部、高梁內(nèi)生細(xì)菌種群數(shù)量19-20]存在差異。說明植物內(nèi)生細(xì)菌的種群密度與植物的物種、基因型、植物組織、生長階段和環(huán)境條件等有關(guān)21]。水稻不同部位內(nèi)生細(xì)菌的菌株數(shù)量存在差異，水稻根部細(xì)菌的菌株數(shù)量最高，其次是莖、葉。可能是因?yàn)樗镜母鶑耐寥乐形樟舜罅康臓I養(yǎng)為內(nèi)生細(xì)菌的生長提供了豐富的養(yǎng)分22]。多數(shù)植物內(nèi)生細(xì)菌不僅存在于植株體內(nèi)，也常見于土壤，而水稻內(nèi)生細(xì)菌大多來源于根際土壤，由土壤首先進(jìn)入植株根中，并在根內(nèi)定殖，然后在植株體內(nèi)轉(zhuǎn)移。

水稻白葉枯病發(fā)生以后，盡管內(nèi)生細(xì)菌的總量沒有發(fā)生改變，但拮抗菌的數(shù)量發(fā)生了明顯的變化。病株中拮抗菌的菌株數(shù)量明顯增多，主要表現(xiàn)在葉部拮抗菌菌株數(shù)量的增多，且抑菌圈直徑與對(duì)照植株存在顯著性差異（P<005）。同時(shí)，病株和對(duì)照植株中拮抗菌的抑菌能力在組4中存在顯著性差異（P<005），并且這種差異主要體現(xiàn)在根部。周崗泉等報(bào)道，抗青枯病的番茄品種中內(nèi)生細(xì)菌的含量明顯高于感病品種，番茄青枯病的抗性可能與內(nèi)生細(xì)菌的含量和拮抗菌的數(shù)量有關(guān)23]。周金鑫等報(bào)道，植物與病原菌相互作用的過程中，植物能感受病原菌的入侵并激活多種防御反應(yīng)24-25]。白葉枯病病菌誘導(dǎo)水稻產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，植物體內(nèi)的生理生化發(fā)生了改變26]，內(nèi)生細(xì)菌與植物在長期的共同進(jìn)化中形成了一種微妙的協(xié)同關(guān)系27-29]，植物對(duì)病害產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)也體現(xiàn)在植物與內(nèi)生菌組成的微生態(tài)環(huán)境的變化上，導(dǎo)致拮抗菌數(shù)量增多，但這種推測有待于進(jìn)一步研究。

Sun等使用16S rDNA序列分析了2種水稻品種根部內(nèi)生細(xì)菌的多樣性，鑒定出水稻內(nèi)生細(xì)菌有52個(gè)操作分類單元（operational taxonomic units，簡稱OTU），包括寡養(yǎng)單胞菌屬、腸桿菌屬（Enterobacter）、泛生菌屬（Pantoea）、假單胞菌屬、伯克氏菌屬（Burkholderia）等屬，優(yōu)勢類群為寡養(yǎng)單胞菌屬30]。劉云霞等鑒定出水稻內(nèi)生細(xì)菌的類群有芽孢桿菌屬、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、腸桿菌屬和假單胞菌屬等4個(gè)屬，優(yōu)勢屬群為芽孢桿菌屬31]。本研究采用16S rDNA序列鑒定出對(duì)水稻白葉枯病病菌具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌共包含17個(gè)屬，其中優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬。因此，從水稻內(nèi)生細(xì)菌中篩選具有拮抗作用的芽孢桿菌作為防治水稻病害的生防菌具有廣闊的應(yīng)用前景，并為水稻白葉枯病的微生態(tài)治理提供了參考。

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