任平　阮祥穩(wěn)　趙文娟　秦濤

摘要：將不同致病力的獼猴桃潰瘍病病菌接種于獼猴桃植株上，測定與抗病性相關(guān)的苯丙氨酸解氨酶（PAL）、過氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）這5種防御酶的活性，結(jié)果表明，獼猴桃潰瘍病不同致病力菌株會(huì)導(dǎo)致獼猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明顯提高；接種強(qiáng)致病力菌株P(guān)-H使獼猴桃植株的5種防御酶活性變化劇烈，尤其是POD活性明顯上升后又明顯下降；與接種無菌水相比，接種不同濃度P-L菌株可導(dǎo)致獼猴桃植株P(guān)OD、PPO、SOD、CAT、PAL的活性明顯提高，其中接種濃度為107 CFUmL的P-L菌株發(fā)酵液，5種酶活性明顯高于其他2個(gè)濃度處理，且與P-H菌株接種侵染的各酶活性變化趨勢相同。高濃度 P-L菌株發(fā)酵液具有更好的激發(fā)植株體內(nèi)防御酶活性的能力，弱致病力獼猴桃潰瘍病病菌P-L發(fā)酵液能誘導(dǎo)獼猴桃植株產(chǎn)生抗病性。

關(guān)鍵詞：獼猴桃；潰瘍病；防御酶；誘導(dǎo)抗性；P-L菌株；過氧化物酶；發(fā)酵液

中圖分類號： S436634文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0109-03

收稿日期：2016-06-17

基金項(xiàng)目：陜西省科學(xué)院基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（編號：2013K-16）。

作者簡介：任平（1972—），女，陜西西安人，副研究員，主要從事微生物資源應(yīng)用開發(fā)。E-mail：mysrenping@163com。

生物防治是控制植物病害、減少化學(xué)農(nóng)藥污染的有效途徑，而誘導(dǎo)抗性又是植物病害生物防治的重要機(jī)理之一1]。誘導(dǎo)抗性是通過誘發(fā)植物免疫機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的，利用物理、化學(xué)或生物因子預(yù)先處理植物，使原來的感病反應(yīng)產(chǎn)生局部的或系統(tǒng)的抗性2]。植物經(jīng)外界刺激或誘導(dǎo)會(huì)引起植物產(chǎn)生一些應(yīng)急反應(yīng)，進(jìn)而引起植株的生理生化指標(biāo)變化，使植物產(chǎn)生抗性。目前，研究植物誘導(dǎo)抗性機(jī)制時(shí)，主要是研究一些與抗病相關(guān)的酶或物質(zhì)3]。植物受病原菌侵染或生物因子誘導(dǎo)，植物體內(nèi)與抗病反應(yīng)密切相關(guān)的防御酶活性會(huì)升高，其中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）等是存在于植物體內(nèi)與抵抗病原微生物侵染有關(guān)的重要酶類4]。

獼猴桃潰瘍病是獼猴桃生產(chǎn)過程中的一個(gè)重要病害，化學(xué)藥劑難以有效地防控，即使大量使用農(nóng)藥，也收效甚微，還造成獼猴桃產(chǎn)品和生態(tài)環(huán)境污染。根據(jù)“植物獲得性抗性”學(xué)說5]，用獼猴桃潰瘍病弱致病菌株發(fā)酵液進(jìn)行誘導(dǎo)接種，可刺激獼猴桃植株體內(nèi)產(chǎn)生對潰瘍病的抗體，進(jìn)而使獼猴桃植株產(chǎn)生對潰瘍病的抗性，從而達(dá)到不用化學(xué)農(nóng)藥、用弱致病菌株防控獼猴桃潰瘍病的目的，實(shí)現(xiàn)獼猴桃的無污染生產(chǎn)。

前期研究發(fā)現(xiàn)，接種獼猴桃潰瘍病弱致病菌P-L發(fā)酵液能提高獼猴桃植株對強(qiáng)致病菌P-H的抗性。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)通過將不同濃度P-L菌株發(fā)酵液接種到獼猴桃植株上，測定其體內(nèi)PAL、POD、PPO等酶的活性變化，分析弱致病菌是否會(huì)引起植物系統(tǒng)產(chǎn)生抗病性，為揭示其生防機(jī)理提供依據(jù)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

強(qiáng)致病菌P-H、弱致病菌P-L，由陜西省科學(xué)院酶工程研究所微生物實(shí)驗(yàn)室篩選出來；15株試驗(yàn)植株為2年生盆栽獼猴桃實(shí)生苗。金氏B培養(yǎng)基（KBA培養(yǎng)基）：蛋白酶解蛋白胨200 g，KH2PO4 15 g，MgSO4·7H2O 15 g，甘油150 mL，加蒸餾水到1 L，pH值為72。培養(yǎng)基121 ℃滅菌20 min。

12試驗(yàn)方法

121菌株懸液的制備及接種將不同致病力P-H菌株、P-L菌株分別接種于KBA培養(yǎng)基中，26 ℃ 160 rmin振蕩培養(yǎng)30 h；將P-L菌株發(fā)酵液用無菌水分別稀釋成105、106、107 CFUmL等3個(gè)濃度，采用超聲波對細(xì)胞進(jìn)行破碎，超聲波輸出功率為250 W，工作6 s，間隔5 s，總工作時(shí)間66 min；將P-H菌株發(fā)酵液用無菌水稀釋成106 CFUmL作為對照1（CK1），以無菌水處理作為對照2（CK2）；每處理選取長勢一致、健壯的獼猴桃植株各3株，每株選擇3張大小均勻、長勢良好的葉片，將菌液及無菌水均勻噴在獼猴桃葉片上進(jìn)行誘導(dǎo)抗性試驗(yàn)，套上保鮮袋。

122POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性的測定接種前及接種后2、6、10、15、20 d分別采集獼猴桃葉片，測定其POD、PPO、PAL、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）的活性。POD提取及活性測定參照張龍翔等的方法6]進(jìn)行，以 1 g 鮮質(zhì)量1 min內(nèi)D470 nm值變化001作為1個(gè)酶活性單位（U）。PPO提取及活性測定參照朱廣廉等的方法7]進(jìn)行，以1 g鮮質(zhì)量1 min內(nèi)D525 nm值變化001為1個(gè)酶活性單位（U）。SOD提取及活性測定參照朱廣廉等的方法7]進(jìn)行，以抑制氮藍(lán)四唑（NBT）還原的50%酶量為1個(gè)酶活性單位，以不加酶液而用緩沖液代替酶液的處理為空白對照，酶活性計(jì)算公式為：

JZ]N=2×（D560 nm空白-D560 nm處理）D560 nm空白。

CAT提取及活性測定參照李合生的方法8]進(jìn)行，采用紫外吸收法，以1 g鮮質(zhì)量1 min內(nèi)D240 nm減少01的酶量為1個(gè)酶活性單位（U）。PAL提取及活性測定參照薛應(yīng)龍等的方法9]進(jìn)行，以1 g鮮質(zhì)量D290 nm值變化001所需酶量為1個(gè)酶活性單位（U）。

2結(jié)果與分析

21P-L菌株不同濃度發(fā)酵液對過氧化物酶（POD）活性的影響

由圖1可知，處理組和對照組在接種前的POD活性差異不明顯；處理組和CK1的POD活性在接種后2～6 d多為緩慢升高，在接種后6～10 d的POD活性明顯上升且達(dá)到峰值，后下降較快，接種15 d后趨于平穩(wěn)；接種后20 d時(shí)，處理組和CK1的POD活性仍高于CK2；CK2的POD活性在20 d內(nèi)變化不大；處理C（P-L菌株發(fā)酵液濃度為107 CFUmL）的POD活性明顯高于其他2個(gè)處理；處理組的POD活性變化趨勢與CK1一致，且POD活性始終高于CK2，這是由于當(dāng)病原菌在植株體內(nèi)活動(dòng)時(shí)，過氧化物酶對病原菌極為敏感，很可能與其他代謝系統(tǒng)協(xié)同作用，使體內(nèi)活性氧物質(zhì)保持在一個(gè)正常的動(dòng)態(tài)水平，同時(shí)，其還可以氧化枝條組織中的酚類化合物，相應(yīng)產(chǎn)物阻止病原物的擴(kuò)展，提高了其抗性水平。107 CFUmL 高濃度P-L菌株發(fā)酵液具有更強(qiáng)激發(fā)POD活性的能力。endprint

22P-L菌株不同濃度發(fā)酵液對多酚氧化酶（PPO）活性的影響

由圖2可知，處理組和對照組在接種前的PPO活性差異不明顯；處理B、處理C、CK1的PPO活性在接種后2～10 d明顯上升且達(dá)到峰值，后下降較快，接種后20 d仍高于CK2；處理A的PPO活性在接種后2～6 d緩慢升高，在接種后6～10 d的PPO活性明顯上升且達(dá)到峰值，后有所下降，接種后20 d時(shí)，處理A的PPO活性高于處理B、CK2；CK2的PPO活性在20 d內(nèi)變化不大；處理C的PPO活性明顯高于其他2個(gè)處理；處理組的PPO活性變化趨勢與CK1基本一致，且其PPO活性始終高于CK2，這可能是由于植物在對病原菌侵染的防衛(wèi)反應(yīng)中，需要更多的多酚氧化酶參與，而多酚氧化酶不僅參與酚類物質(zhì)的氧化，同時(shí)也參與木質(zhì)素的形成，木質(zhì)素一方CM（25]面增加了細(xì)胞壁抗病原物的穿透壓力，另一方面限制了真菌酶和毒素的擴(kuò)散，阻礙了病原菌從寄主獲得水和營養(yǎng)物質(zhì)10]。107 CFUmL高濃度P-L菌株發(fā)酵液具有更強(qiáng)激發(fā)PPO活性的能力。

23P-L菌株不同濃度發(fā)酵液對超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖3可知，處理組和對照組在接種前的SOD活性差異不明顯；處理組和CK1的SOD活性在接種后2 d呈下降趨勢，處理B、處理C、CK1在接種后2～10 d的SOD活性明顯上升并達(dá)到峰值，后下降較快，接種后20 d時(shí)，處理組和CK1的SOD活性仍高于CK2；處理A的SOD酶活性在接種后2～15 d緩慢上升且達(dá)到峰值，接種后20 d時(shí)的SOD活性高于處理B、CK2；CK2的SOD活性在20 d內(nèi)變化不大；處理C的SOD酶活性高于其他2個(gè)處理；處理組的SOD活性變化趨勢與CK1一致，且其SOD活性始終高于CK2，這可能是當(dāng)病原菌侵染時(shí)SOD活性上升，以清除病原菌刺激產(chǎn)生的自由基，防止氧自由基傷害細(xì)胞膜系統(tǒng)，使細(xì)胞內(nèi)保持一個(gè)穩(wěn)定、有利于生長的環(huán)境11]。107 CFUmL高濃度P-L菌株發(fā)酵液具有更強(qiáng)激發(fā)SOD活性的能力。

24P-L菌株不同濃度發(fā)酵液對過氧化氫酶（CAT）活性的影響

由圖4可知，處理組和對照組在接種前的CAT活性差異不明顯；處理組和CK1的CAT活性在接種后6 d達(dá)到第1個(gè)峰值，這可能是在病菌侵染初期，細(xì)胞經(jīng)SOD過程產(chǎn)生H2O2，使胞內(nèi)活性氧的數(shù)量迅速增加，CAT活性也隨之上升；后CAT活性值下降，并在接種10 d后又上升，在接種后15 d CAT活性達(dá)到第2個(gè)峰值，這可能是獼猴桃接種病菌，其枝條細(xì)胞有新的代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，從而進(jìn)一步刺激CAT活性上升；處理組的CAT活性變化趨勢與CK1一致，且CAT活始值高于CK2。107 CFUmL高濃度P-L菌株發(fā)酵液具有更強(qiáng)激發(fā)CAT活性的能力。

25P-L菌株不同濃度發(fā)酵液對苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影響

由圖5可知，處理組和對照組在接種前的PAL活性差異不明顯；處理組和CK1的PAL活性在接種后2～6 d明顯升高，接種后6 d PAL活性達(dá)到峰值，后又緩慢下降，接種10 d后趨于平穩(wěn)；接種后20 d時(shí)，處理組和CK1的PAL活性仍高于CK2，CK2的PAL活性在20 d內(nèi)活性變化不大；處理組的PAL活性變化趨勢與CK1一致，且PAL活性始終高于CK2，這可能是由于病原菌攻擊引起植物體合成大量新的PAL，以抵抗病原菌侵入對植物的傷害。107 CFUmL高濃度P-L菌株發(fā)酵液具有更強(qiáng)激發(fā)PAL活性的能力。

3結(jié)論與討論

植物病害生物防治機(jī)制包括抗生作用、溶菌作用、重寄生作用、競爭作用、交互保護(hù)作用及促生作用12-13]，誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性也被認(rèn)為是生防菌的一種重要防病機(jī)制。植物的誘導(dǎo)抗病包括木質(zhì)化、防御酶活性、病程相關(guān)蛋白、植保素等多種生理生化因子的合成。有大量研究表明，參與植物體內(nèi)多種防衛(wèi)反應(yīng)的PAL、PPO、POD等酶系與植物抗病性密切相關(guān)14]，這些酶的活性與植株抗病性呈正相關(guān)，在植物的抗病反應(yīng)中起到非常重要的作用。

接種獼猴桃潰瘍病不同致病力菌株會(huì)導(dǎo)致獼猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明顯提高，而接種強(qiáng)致病力菌株會(huì)使獼猴桃的5種防御酶活性變化劇烈，尤其是POD活性急劇上升后又迅速下降，這種變化可能與強(qiáng)致病力菌株對植物具有致病性，能導(dǎo)致植物發(fā)病及生理功能紊亂等有關(guān)15]；與接種無菌水相比，接種P-L菌株不同濃度發(fā)酵液可導(dǎo)致獼猴桃植株的POD、PPO、SOD、CAT、PAL活性明顯提高，其中接種濃度為107 CFUmL P-L菌株發(fā)酵液的獼猴桃植株的5種酶活性明顯高于接種106、105 CFUmL的，且與P-H菌株侵染后的酶活性變化趨勢相同，107 CFUmL高濃度P-L菌株發(fā)酵液具有更強(qiáng)激發(fā)植株體內(nèi)防御酶活性的能力。

不論是弱致病菌還是強(qiáng)致病菌，在一定程度上都可導(dǎo)致與抗病反應(yīng)相關(guān)的一些生理生化指標(biāo)的變化，而且有時(shí)植株對強(qiáng)致病力潰瘍病菌的反應(yīng)更加敏感。因此，在誘導(dǎo)植物提高抗病能力時(shí)，須選擇合適的誘導(dǎo)菌株和接種強(qiáng)度，以達(dá)到預(yù)期的生防目的。

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