王鳴 韓文正 關(guān)韶峰 翟馨蓉 方唯一 曲新凱

基礎(chǔ)研究

不同劑量苯酚去腎交感神經(jīng)術(shù)對自發(fā)性高血壓大鼠血壓的影響

王鳴 韓文正 關(guān)韶峰 翟馨蓉 方唯一 曲新凱

目的 探討不同劑量苯酚去腎交感神經(jīng)術(shù)對自發(fā)性高血壓大鼠血壓影響。方法 選用12周齡自發(fā)性高血壓大鼠，腎動靜脈局部涂抹不同劑量的苯酚，按照給藥劑量分為4組：假手術(shù)組、0.5 ml苯酚組、1.0 ml苯酚組和1.5 ml苯酚組。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，監(jiān)測血壓，1周后行苯酚化學(xué)腐蝕神經(jīng)術(shù)，術(shù)后4周處死大鼠，采血，腎動脈及腎神經(jīng)組織送檢。采用ELISA法測定血漿去甲腎上腺素含量，腎動脈采用HE、Masson、PAS染色，腎神經(jīng)采用免疫組化酪氨酸羥化酶染色及神經(jīng)絲蛋白染色。結(jié)果 與假手術(shù)組相比，術(shù)后4 周，1.0 ml苯酚組血壓顯著降低［（163.60±5.87）mm Hg 比（193.70±6.07）mm Hg，P＜0.01］，血漿去甲腎上腺素含量顯著降低［（50.50±31.01）ng/L 比（197.50±35.27）ng/L，P＜0.01］；HE 染色，腎動脈輕度損傷，神經(jīng)中度損傷（3.46±0.30 比 0.44±0.30，P＜0.01），酪氨酸羥化酶低表達（0.51±0.30 比 2.58±0.30，P＜0.01），神經(jīng)絲蛋白高表達（2.27±0.30 比 0.09±0.10，P＜0.01）。結(jié)論 1.0 ml苯酚化學(xué)腐蝕神經(jīng)術(shù)能夠有效損傷腎神經(jīng)，顯著降低血壓，且不造成腎動脈狹窄，其機制可能與腎交感神經(jīng)酪氨酸羥化酶活性低有關(guān)。

去腎交感神經(jīng)；高血壓；苯酚；酪氨酸羥化酶

交感神經(jīng)亢進是高血壓發(fā)生的重要機制之一。20世紀50年代，有研究者采用手術(shù)完全切斷交感神經(jīng)的非藥物方式來治療高血壓，發(fā)現(xiàn)能顯著降低血壓，但卻帶來嚴重的并發(fā)癥[1]。2009年Krum等[2]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)皮腎動脈消融術(shù)射頻消融能有效控制難治性高血壓。隨后HTN-2（Simplicity Hypertension 2）的成功進一步地證實了去腎交感神經(jīng)術(shù)的安全性和有效性[3]。但 HTN-3（Simplicity Hypertension 3）的失敗對腎動脈射頻消融技術(shù)的可行性提出了質(zhì)疑[4]，其中一個主要問題是神經(jīng)的消融程度不明確[5]，尤其在大鼠去腎交感神經(jīng)模型上，既往研究采用經(jīng)典苯酚化學(xué)腐蝕腎交感神經(jīng)，但消融細節(jié)不明確，沒有一個消融標準，消融程度時間也不同[6-8]，因而結(jié)果也不盡相同。本課題利用苯酚化學(xué)腐蝕神經(jīng)法來建立自發(fā)性高血壓大鼠去腎交感神經(jīng)模型，探討合理苯酚消融時間、濃度和劑量。

1 材料與方法

1.1 主要材料 雄性自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneous hypertensive rats，SHR），12 周齡，40 只，由上海斯萊克有限公司提供，分籠飼養(yǎng)于標準環(huán)境下，1周后開始實驗。所有實驗操作流程均符合上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物保護和使用守則。去甲腎上腺素（NE）ELISA試劑盒購買于上海鈺博生物科技有限公司；神經(jīng)絲蛋白（NF200）抗體（abcam官網(wǎng)，編號 ab82259），酪氨酸羥化酶（TH）抗體（abcam 官網(wǎng)，編號 ab112）。

1.2 方法

1.2.1 分組 將SHR大鼠隨機分為4組：①假手術(shù)組，生理鹽水擦拭腎動脈（n=10）；②手術(shù)組（共3組），分別用苯酚擦拭腎動脈 1 min（0.5 ml）、2 min（1.0 ml）、3 min（1.5 ml），每組各 10 只。術(shù)前及術(shù)后每周無創(chuàng)尾動脈測血壓；4周后處死大鼠，留取血漿測去甲腎上腺素含量，腎動脈、腎神經(jīng)組織送檢。

1.2.2 去腎交感神經(jīng)方法 腹腔注射3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，備皮，消毒鋪巾，腹白線正中切開，逐層分離皮下組織及肌肉，暴露腎門，游離腎動脈，在顯微鏡下（×25）剝離腎動脈表面所有結(jié)締組織，同時用棉簽蘸溶于95%乙醇的10%苯酚溶液，涂抹雙側(cè)腎動靜脈表面，分別用0.5 ml涂抹1 min，1.0 ml涂抹 2 min，1.5 ml涂抹 3 min。假手術(shù)僅暴露腎門，不剝離動靜脈鞘，僅用生理鹽水涂抹。逐層縫合傷口，術(shù)后給予青霉素80萬U 3 d，預(yù)防感染。

1.2.3 血壓測量 應(yīng)用大鼠無創(chuàng)尾動脈測壓計（BP-2000 SERIESⅡ）測量血壓。室溫（22±2）℃，將大鼠放置固定裝置中，測量儀的尾部氣囊套入鼠尾，待大鼠安靜后，緩慢加熱至39℃使鼠尾血管擴張，同時將四通道采集儀連接電腦，待電腦采集信號穩(wěn)定后，充氣加壓，直至脈搏信號成一條直線，然后逐漸放棄減壓，待出現(xiàn)規(guī)則波形信號時，電腦顯示數(shù)值。每只大鼠重復(fù)3次，間隔30 min，測平均值。

1.2.4 血漿去甲腎上腺素測定及腎動脈、腎交感神經(jīng)病理檢驗 4周后處死大鼠，心臟采血，血液標本均以3000 r/min離心15 min，分離出血漿，采用ELISA法測定血漿去甲腎上腺素（去甲腎上腺素試劑盒購于上海鈺博生物科技有限公司），嚴格按照試劑盒說明書進行操作。取左側(cè)腎動脈，行石蠟固定包埋切片HE染色，同時腎交感神經(jīng)染色采用免疫組織化學(xué)方法檢測TH和NF200表達情況。每張切片隨機取10個視野進行拍照。

光鏡下評估神經(jīng)損傷，采取半定量評分法。0分：無損傷，正常形態(tài)。1分：極輕度損傷，神經(jīng)束外膜少量炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束少許空泡化。2分：輕度損傷，神經(jīng)束外膜部分炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束部分空泡化，伴核固縮，軸索損害，出現(xiàn)極少量髓鞘消解腔。3分：中度損傷，神經(jīng)束外膜中度炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束重度空泡化，部分核固縮，出現(xiàn)髓鞘消解腔，腫脹。4分：重度損傷，神經(jīng)束外膜嚴重炎癥反應(yīng)，纖維化，神經(jīng)束正常結(jié)構(gòu)消失、壞死、纖維化。

免疫組化NF200和TH染色同樣采用半定量積分法。0分：對TH或NF200完全無反應(yīng)，無染色。1分：對TH或NF200微弱反應(yīng)，染色弱陽性。2分：對TH或NF200有反應(yīng)，染色陽性。3分：對TH或NF200強烈反應(yīng)，染色強陽性。

腎動脈損傷半定量評分法。0分：正常形態(tài)。1分：極輕度損傷，內(nèi)膜丟失小于血管周徑25%，中膜損傷范圍小于血管周徑25%，損傷深度小于中膜25%。2分：輕度損傷，內(nèi)膜丟失介于血管周徑25%～50%，中膜損傷范圍介于血管周徑25%～50%，損傷深度介于中膜25%～50%。3分：中度損傷，內(nèi)膜丟失介于血管周徑50%～75%，中膜損傷范圍介于血管周徑50%～75%，損傷深度介于中膜50%～75%。4分：重度損傷，內(nèi)膜丟失大于血管周徑75%，中膜損傷范圍大于血管周徑75%，損傷深度大于中膜75%；或者中膜變薄小于中膜50%[9]。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行分析。實驗結(jié)果用±s表示，組間比較采用one-way ANOVA，組間多重比較采用LSD-t檢驗，多組等級資料比較采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis H法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠存活情況 1.5 ml苯酚組術(shù)后第7天、第9天各死亡1只大鼠，均死于腸梗阻，腹腔感染；假手術(shù)組及 0.5 ml、1.0 ml苯酚組無死亡。

2.2 各組大鼠收縮壓的變化 術(shù)前，SHR大鼠基線血壓各組間未見統(tǒng)計學(xué)差異。去腎交感神經(jīng)術(shù)后1周，手術(shù)組大鼠血壓較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.01）。術(shù)后 2～4 周，1.5 ml組大鼠收縮壓較假手術(shù)組逐漸增高（P＜0.01），而 1.0 ml組大鼠與假手術(shù)組相比，收縮壓顯著降低（P＜0.01），0.5 ml組大鼠與假手術(shù)組相比未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。見表1。

2.3 血漿去甲腎上腺素變化 術(shù)后4周，假手術(shù)組、0.5 ml組、1.5 ml組大鼠血漿去甲腎上腺素含量比較未見統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），而 1.0 ml組大鼠血漿去甲腎上腺素較假手術(shù)組明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 RDN術(shù)后各組大鼠血壓和血清指標變化（±s）

表1 RDN術(shù)后各組大鼠血壓和血清指標變化（±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01，bP＜0.05

收縮壓（mm Hg）組別 例數(shù)術(shù)前 術(shù)后1周 術(shù)后2周 術(shù)后3周 術(shù)后4周假手術(shù)組 10 175.90±5.89 177.50±5.28 184.30±4.74 190.50±4.28 193.70±6.07 197.50±35.27 0.5 ml苯酚組 10 178.30±5.69 169.40±7.71a 181.00±4.37 187.10±4.23 192.20±3.94 218.40±33.71 1.0 ml苯酚組 10 179.10±5.51 167.60±4.35a 172.10±5.13a 165.90±4.56a 163.60±5.87a 50.50±31.01a 1.5 ml苯酚組 10 175.30±4.83 169.00±6.88a 189.70±5.11a 195.70±3.71a 200.00±7.11b 174.90±33.32去甲腎上腺素（ng/L）術(shù)后4周

2.4 腎動脈組織學(xué)變化 對左側(cè)腎動脈進行HE、Masson、PAS 染色后發(fā)現(xiàn)，1.5 ml組大鼠血管內(nèi)皮細胞脫落，內(nèi)膜明顯增厚并向管腔突出，平滑肌細胞增生，細胞排列紊亂，中膜平滑肌增生，血壁破壞，炎癥細胞浸潤；而假手術(shù)組、0.5 ml組、1.0 ml組大鼠腎動脈內(nèi)膜未見明顯增生，血管內(nèi)皮及內(nèi)膜下彈力纖維完整。腎動脈損傷評分：1.5 ml苯酚組中重度損傷，其余各組正常至輕度損傷。見圖1，表2。

2.5 腎交感神經(jīng)形態(tài)學(xué)變化 HE染色下，假手術(shù)組為正常腎動脈外周交感神經(jīng)；0.5 ml苯酚組腎交感神經(jīng)輕度炎癥細胞浸潤，神經(jīng)束外膜破裂不完整；1.0 ml組和 1.5 ml組中度炎性細胞浸潤及纖維化，核空泡化，核萎縮，部分神經(jīng)細胞正常結(jié)構(gòu)消失。

免疫組化檢測：假手術(shù)組及0.5 ml組NF200表達低，而 1.0 ml組和 1.5 ml組表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。假手術(shù)組及 0.5 ml組TH 高表達，而 1.0 ml組和 1.5 ml組低表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2，表2。

表2 RDN術(shù)后各組大鼠腎動脈和腎交感神經(jīng)損傷評分（±s）

表2 RDN術(shù)后各組大鼠腎動脈和腎交感神經(jīng)損傷評分（±s）

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.01

?

3 討論

腎臟神經(jīng)支配豐富，主要分為傳入神經(jīng)和傳出神經(jīng)。傳入神經(jīng)大部分起源于腎盂管壁，感受機械和化學(xué)刺激，接受T6～L4脊髓的交感神經(jīng)節(jié)后纖維支配，并將感受信息傳入中樞下丘腦和延髓頭端腹外側(cè)區(qū)[10]，繼而通過傳出神經(jīng)刺激β1腎上腺素受體增加腎素的分泌；刺激α1腎上腺素受體增加腎小管的水鈉重吸收；刺激α1受體降低腎血流的灌注，從而影響血壓[11]。然而由于缺乏評價腎交感神經(jīng)消融程度的即刻指標，無論是臨床試驗還是動物模型，術(shù)后結(jié)果不盡相同[5,7,12]。本實驗采用苯酚消融方法，通過腎交感神經(jīng)病理染色結(jié)合血漿去甲腎上腺素，從形態(tài)學(xué)和功能上探討大鼠腎交感神經(jīng)消融模型苯酚的使用量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用1.0 ml苯酚溶液棉簽擦拭腎交感神經(jīng)能夠有效腐蝕神經(jīng)，降低血壓，而不損傷腎動脈，有助于提高建模成功率及有效率。

既往有研究者在動物模型中采用電刺激腎交感神經(jīng)，通過即刻觀察腎血流量變化來證明手術(shù)有效性，發(fā)現(xiàn)采用 15 V，0.2 ms和 10 Hz，30 s兩種刺激方法腎血流量未見明顯改變[12]；也有研究采用腎臟組織中去甲腎上腺素含量低于對照組10%來作為去神經(jīng)成功的標準[7]。TH是機體兒茶酚胺的限速酶，反映局部組織交感活性。Burgi等[13]的研究發(fā)現(xiàn)，TH可作為交感神經(jīng)活性的標志，反映交感神經(jīng)活性與血壓之間的關(guān)系，去神經(jīng)后TH表達下降。NF是神經(jīng)元特有的結(jié)構(gòu)蛋白，主要分布在神經(jīng)元的胞體及突起內(nèi)，NF200作為其中一種亞型，在正常情況下只存在于軸索中，胞體很少含有，正常神經(jīng)NF200染色為陰性，神經(jīng)損傷后NF200可出現(xiàn)陽性表達。因此本實驗采用腎交感神經(jīng)HE染色及TH、NF200免疫組織化學(xué)染色同時結(jié)合血漿腎素含量來作為去神經(jīng)成功的標準。

苯酚是一種強烈的化學(xué)腐蝕劑，可引起蛋白質(zhì)發(fā)生凝固性壞死。本實驗利用苯酚對神經(jīng)的化學(xué)毀損，以達到去神經(jīng)目的。實驗中發(fā)現(xiàn)：①與假手術(shù)組相比，1.0 ml和 1.5 ml苯酚組神經(jīng)毀損明顯，0.5 ml苯酚組神經(jīng)僅有輕度損傷，術(shù)后4周未見神經(jīng)再生；②術(shù)后1周與對照組相比，手術(shù)組血壓均有不同程度降低，可能是去神經(jīng)后動脈管壁牽張程度降低，壓力感受器受抑制，從而中樞交感系統(tǒng)抑制解除[14]，也可能與圍術(shù)期進食量少有關(guān)；③術(shù)后4個月與假手術(shù)組相比，只有1.0 ml苯酚組血壓下降，0.5 ml苯酚組血壓無下降趨勢，而 1.5 ml苯酚組血壓明顯升高，血漿去甲腎上腺素與血壓變化趨勢一致。通過進一步腎動脈病理檢測發(fā)現(xiàn)，1.5 ml苯酚組大鼠腎動脈狹窄明顯，其余各組無腎動脈狹窄。1.5 ml苯酚組術(shù)后有2只大鼠死于腸梗阻，考慮苯酚使用過量、接觸時間較長，導(dǎo)致神經(jīng)過度消融，進而腐蝕腎動脈造成腎動脈狹窄，引起腎性高血壓，同時過量的苯酚也破壞腎動脈周圍組織，如回腸及直腸黏膜，引起機械性腸梗阻。另外0.5 ml苯酚組大鼠神經(jīng)輕度損傷，血壓無下降趨勢，表明0.5 ml苯酚量不足以對腎神經(jīng)有效腐蝕。

綜上所述，本研究通過苯酚腐蝕神經(jīng)法建立去腎交感神經(jīng)模型，觀察不同劑量苯酚溶液對神經(jīng)腐蝕的程度，血壓的變化，發(fā)現(xiàn)采用1.0 ml苯酚溶液棉簽擦拭腎交感神經(jīng)2 min可以有效腐蝕神經(jīng)達到去腎交感神經(jīng)目的，并不造成腎動脈狹窄，術(shù)后4周內(nèi)血壓逐漸下降，且未見神經(jīng)再生，血漿去甲腎上腺素含量降低，病理證實酪氨酸羥化酶表達降低，因此血壓下降可能與去神經(jīng)后交感神經(jīng)活性降低有關(guān)。在后續(xù)研究中，我們將對RDN治療的自發(fā)性高血壓大鼠進行分子生物學(xué)檢查，深入探討RDN降低大鼠血壓的作用機制。

（本文圖片見后插二）

［1］Burke GM，Sica DA，F(xiàn)rishman WH.Renal sympathetic denervation for the treatment of systemic hypertension.Cardiol Rev，2012，20：274-278.

［2］Krum H，Schlaich M，Whitbourn R，et al.Catheter-based renal sympathetic denervation for resistant hypertension：a multicentre safety and proof-of-principle cohort study.Lancet，2009，373：1275-1281.

［3］Symplicity HTNI，Esler MD，Krum H，et al.Renal sympathetic denervation in patients with treatment-resistant hypertension（The Symplicity HTN-2 Trial）：a randomised controlled trial.Lancet,2010，376：1903-1909.

［4］Bhatt DL，Kandzari DE，O′Neill WW，et al.A controlled trial of renal denervation for resistant hypertension.N Engl J Med，2014，370：1393-1401.

［5］Papademetriou V，Tsioufis C，Doumas M.Renal denervation and Symplicity HTN-3："Dubium sapientiae initium"（doubt is the beginning of wisdom）.Circ Res，2014，115：211-214.

［6］Kim J，Padanilam BJ.Renal nerves drive interstitial fibrogenesis in obstructive nephropathy.J Am Soc Nephrol，2013，24：229-242.

［7］Katayama T，Sueta D，Kataoka K，et al.Long-term renal denervation normalizes disrupted blood pressure circadian rhythm and ameliorates cardiovascular injury in a rat model of metabolic syndrome.J Am Heart Assoc，2013，2：e000197.

［8］Luippold G，Beilharz M，Muhlbauer B.Chronic renal denervation prevents glomerular hyperfiltration in diabetic rats.Nephrol Dial Transplant，2004，19：342-347.

［9］Sakakura K，Ladich E，Edelman ER，et al.Methodological standardization for the pre-clinical evaluation of renal sympathetic denervation.JACC Cardiovasc Interv，2014，7：1184-1193.

［10］Doumas M，F(xiàn)aselis C，Papademetriou V.Renal sympathetic denervation and systemic hypertension. Am J Cardiol，2010，105：570-576.

［11］ Johns EJ，Kopp UC，DiBona GF.Neural control of renal function.Compr Physiol，2011，1：731-767.

［12］Abdulla MH，Sattar MA，Salman IM，et al.Effect of acute unilateral renal denervation on renal hemodynamics in spontaneously hypertensive rats.Auton Autacoid Pharmacol，2008，28：87-94.

［13］Burgi K，Cavalleri MT，Alves AS，et al.Tyrosine hydroxylase immunoreactivity as indicator of sympathetic activity：simultaneous evaluation in different tissues of hypertensive rats.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2011，300：R264-271.

［14］DiBona GF，Kopp UC.Neural control of renal function.Physiol Rev，1997，77：75-197.

Effect of renal sympathetic denervation with different dose phenol on blood pressure in spontaneous hypertension rats

WANG Ming，HAN Wen-zheng，GUAN Shao-feng，et al.Department of Cardiology，Shanghai Chest Hospital，Shanghai 200030，China

QU Xin-kai，E-mail：qxkchest@126.com

ObjectiveTo investigate the impact of renal sympathetic denervation（RDN）with a suitable dosage of phenol on the blood pressure，plasma noradrenaline and renal nerves injury in spontaneous hypertension rats（SHRs）.MethodsMale SHRs were randomly divided into four groups：the 0.5 ml phenol group which was subjected to RDN at the age of 13 weeks；the 1.0 ml phenol group；1.5 ml phenol group and the Sham group which underwent the sham procedure（n=10，each group）.Blood pressure was measured every week using the tailcuff plethysmography.Four weeks after the RDN or sham operation，plasma norepinephrine（NE）were assessed.Kidney artery and nerve tissue were collected and characterized by immunohistochemically analyses.ResultsCompared with Sham group，the 1.0 ml phenol group with RDN significantly attenuated the progressive increase in blood pressure ［（163.60±5.87）mm Hg vs（193.70±6.07）mm Hg，P ＜0.01］and decreased plasma NE level［（50.50±31.01）ng/L vs（197.50±35.27）ng/L，P＜0.01］.The result of HE staining showed mild injury of renal artery in 1.0 ml phenol group and moderate to severe injury in 1.5 ml phenol group，while severe injury of renal nerves were occurred in 1ml phenol group and 1.5 ml phenol group.RDN treatment also inhibited the expression of tyrosine hydroxylase（TH）and increased the expression of neurofilament protein（NF200）in renal nerves in 1ml phenol group compared with sham group［TH score：0.51±0.30 vs 2.58±0.30，P＜0.01；NF200 score：2.27±0.30 vs 0.09±0.10，P＜0.01］.ConclusionRDN with 1.0 ml phenol can effectively destroy the renal nerves without renal arterial stenosis and decrease blood pressure in SHRs，which might be associated with inhibition of expression of TH.

Renal sympathetic denervation；Hypertension；Phenol；Tyrosine hydroxylase

國家自然科學(xué)基金項目（項目編號：81370361）；上海市科委（項目編號：12140902800）；上海市申康醫(yī)院發(fā)展中心（項目編號：SHDC12012101）；上海市胸科醫(yī)院科技發(fā)展基金項目（項目編號：2014YZDH20300）

200030 上海市，上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科

曲新凱，E-mail：qxkchest@126.com

10.3969/j.issn.1672－5301.2017.11.020

Q95-33；R544.1

A

1672-5301（2017）11-1036-04

2017-07-18)