許光輝，陳淑娟，俞柳敏，涂海健

（莆田學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 莆田 351100）

碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌篩選及臨床分析

許光輝，陳淑娟，俞柳敏，涂海健

（莆田學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 莆田 351100）

目的 篩選碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（CRKP）及現(xiàn)狀分析。方法 采用K-B法及配套GN卡上機(jī)鑒定、改良Hodge法試驗(yàn)、EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)篩選碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。結(jié)果 2015年7月～2016年12月，本院臨床科室送檢標(biāo)本分離碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株36株。結(jié)果表明，碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌院內(nèi)尤其是重癥醫(yī)學(xué)科病房感染嚴(yán)重，其多重耐藥現(xiàn)象突出。結(jié)論 建議開展其同源性分析及監(jiān)測肺炎克雷伯菌流行情況，應(yīng)引起醫(yī)院高度重視。

碳青霉烯酶；耐藥性；肺炎克雷伯菌；醫(yī)院感染；篩選；分析

碳青霉烯類抗生素是治療產(chǎn)ESBLs菌株、頭孢菌素酶（AmpC酶）肺炎克雷伯菌所致感染的常用藥物[1]。1年來，本院從臨床送檢各種標(biāo)本篩選碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株，并通過WHONET 5.6軟件對其耐藥情況分析，收集標(biāo)本便于課題組后續(xù)肺炎克雷伯菌耐碳青霉烯類膜孔蛋白基因、同源性分析、耐藥基因、質(zhì)粒介導(dǎo)的耐藥傳播性等研究，最終為臨床提供合理用藥信息。

1 材料與方法

1.1 臨床菌株 自2015年7月～2016年12月，收集由本院臨床標(biāo)本送檢微生物實(shí)驗(yàn)室分離的碳青霉烯類肺炎克雷伯菌菌株36株。肺泡灌洗液15株、痰液11株、血液3株、尿液5株、腦脊液1株、各類導(dǎo)管液1株。標(biāo)本來源分別為重癥醫(yī)學(xué)科15例、呼吸內(nèi)科6例、神經(jīng)內(nèi)科2例、神經(jīng)外科5例、心胸外科3例、腎內(nèi)科2例、內(nèi)分泌科1例、泌尿外科2例。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸埃希菌（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、產(chǎn)碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（ATCCBAA-1705）、非產(chǎn)碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（ATCCBAA-1706）購于衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心。

1.3 儀器 法國梅里埃Vitek2-Compact微生物鑒定系統(tǒng)、LEICA顯微鏡、瓶口分配器（德國BRAND）。

1.4 試劑 配套GN鑒定卡和藥敏卡（法國梅里埃生物公司）、M-H瓊脂、血瓊脂與巧克力培養(yǎng)基（山東百博生物公司）、藥敏紙片（英國OXOID公司）、革染氏染液（法國BASO公司）、氧化酶試劑（英國OXOID公司）。

1.5 菌株分離鑒定與藥敏試驗(yàn) 采用分區(qū)劃線法接種于血瓊脂與巧克力培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)18～24 h后，分離疑似菌落，經(jīng)革蘭氏染色后鏡檢呈G-桿菌，氧化酶試驗(yàn)呈陰性，再經(jīng)Vitek2-Compact微生物鑒定系統(tǒng)。米諾環(huán)素、多粘菌素B、舒普深采用紙片擴(kuò)散K-B法試驗(yàn)。結(jié)果判讀依CLSI文件執(zhí)行[2]。

1.6 改良Hodge法試驗(yàn) 配制0.5麥?zhǔn)蠁挝淮竽c埃希菌（ATCC25922）懸液，用滅菌生理鹽水按1∶10將懸液再稀釋。用無菌棉簽將稀釋好的菌懸液在M-H瓊脂平板上均勻涂布后待干燥3～5 min，將美羅培南紙片（30μg/片）置于平板中央處，用無菌接種環(huán)挑取待測菌落從垂直于美羅培南紙片邊緣劃線約20～25 mm，35℃培養(yǎng)16～20 h。

1.7 EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn) 配制0.5麥?zhǔn)蠁挝淮郎y菌株懸液并均勻涂布于M-H瓊脂平板上，按K-B法貼美羅培南紙片（30μg/片），并在其邊緣約10～15 mm處貼無菌空白紙片，再滴加0.5 mol/L的EDTA溶液10μL，置35℃培養(yǎng)16～20 h。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用WHONET 5.6軟件統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌（K-B法）耐藥情況 碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株所有的ESBL全部報(bào)陰性。無論是否加酶抑制劑，都是耐藥，看不到酶抑制劑的抑制效果。但是表型ESBL陽性的確證需要有加酶抑制劑的抑制，見表1。

表1 耐碳青霉烯類抗生素KPN耐藥情況Table 1 KPN resistance of carbapene-resistant antibiotics

2.2 改良Hodge試驗(yàn) 使用改良Hodge試驗(yàn)（MHT）全部陽性，篩選碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株，見圖1。

圖1 改良Hodge試驗(yàn)陽性為產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌Figure 1 Modified Hodge test positive for producing carbon penicillium enzyme klebsiella bacteria pneumonia

2.3 EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn) 依據(jù)碳青霉烯酶可被EDTA抑制的特性，通過EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)，兩張紙片間有協(xié)同作用可視為該菌產(chǎn)生碳青霉烯酶陽性[3]。碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌36株僅篩選產(chǎn)金屬酶1菌株，見圖2。

圖2 EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)陽性為產(chǎn)金屬酶肺炎克雷伯菌Figure 2 EDTApaper was tested positive for metalloenzyme pneumonia klebsiella pneumoniae

2.4 通過WHONET數(shù)量，已剔除重復(fù)菌株，本院2014年～2017年碳青霉烯酶肺炎克雷伯（CRKP）發(fā)生率，見表2。

表2 本院2014年～2017年碳青霉烯酶肺炎克雷伯（CRKP）發(fā)生率Table 2 The incidence of carbapenylase pneumonia(CRKP)in the hospital from 2014 to 2017

3 討論

碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株的出現(xiàn)，造成了患者病程遷延和臨床抗生素治療的失敗，從而增加了患者的醫(yī)療費(fèi)用和病死率[4]。

本院微生物實(shí)驗(yàn)室近段時(shí)間共篩檢耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）36株，重癥醫(yī)學(xué)科篩檢15例，呼吸科6例次之，來源于多學(xué)科，尤其是重癥醫(yī)學(xué)科病房患者多有嚴(yán)重基礎(chǔ)性疾病，接受廣譜抗菌藥物治療，已成為多重耐藥菌的主要人群，應(yīng)重視病房隔離、控制，加強(qiáng)手衛(wèi)生，建立一套完整感染防控機(jī)制，防止CRKP感染。標(biāo)本類別肺泡灌洗液15株最多，也有血液、腦脊液、各類導(dǎo)管液等，基本上各類標(biāo)本都檢出。這些CRKP菌株體外活性試驗(yàn)顯示，其不但對青霉素類、頭孢菌素類、β-內(nèi)酰胺類/β-內(nèi)酰胺酶抑制劑、氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺類、呋喃類耐藥（舒普深耐藥95.2%），僅只對四環(huán)素類、多黏菌素類全敏感，是多重耐藥菌，而且對亞胺培南耐藥，ESBL全部陰性，確定是否產(chǎn)ESBL還必須通過基因檢測確認(rèn)[5]。本課題組已報(bào)道29株耐碳青霉烯類抗生素KPN菌還檢測出攜帶編碼產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的blaTEM、blaSHV基因，其中18株同時(shí)檢出ampC酶基因，29株均檢出喹諾酮類耐藥相關(guān)gyrA、parC基因[6]。

使用改良Hodge試驗(yàn)（MHT）全部陽性，初篩產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌株。這與孫紅等[7]改良Hodge試驗(yàn)報(bào)道一致。目前CLSI推薦檢測碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌表型方法是改良Hodge試驗(yàn),但實(shí)驗(yàn)比較繁瑣。后續(xù)采用脈沖場凝膠電泳（PFGE）分析耐藥菌株同源性、實(shí)時(shí)熒光PCR檢測膜孔蛋白基因表達(dá)高低、質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶，以及是否與頭孢西丁耐藥等科研團(tuán)隊(duì)相繼立項(xiàng)開展研究。

碳青霉烯酶分為兩類，金屬酶和非金屬碳青霉烯酶，非金屬碳青霉烯酶命名為KPC-1，可被克拉維酸抑制，不被EDTA所抑制[8]。金屬酶可被EDTA所抑制，應(yīng)用EDTA紙片協(xié)同試驗(yàn)區(qū)分。其中金屬酶因不被臨床常用酶抑制劑所抑制，造成更大的威脅。準(zhǔn)確篩選碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌感染及確定耐藥菌的主要耐藥基因型，結(jié)合同源性分析，對合理使用抗生素，增強(qiáng)療效有重要意義。

通過WHONET 5.6軟件對本院臨床科室送檢標(biāo)本產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌統(tǒng)計(jì)，并剔除重復(fù)菌株，2014年～2017年產(chǎn)碳青霉烯酶肺炎克雷伯（KPC）發(fā)生率從2.4%陡增到18.2%，甚至2017第1季度已達(dá)到14.5%，這與衛(wèi)生部全國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)（CARSS）數(shù)據(jù)顯示2015年我國CRKP發(fā)生率為7.6%[8]有較大差異性，應(yīng)引起醫(yī)院管理者足夠重視。

[1] Nordmann P,Cuzon G,naas T.The real threat of Klebsiella pneumoiae carbapenemase-producing bacteria[J].Lancet Infect Dis,2009,9:228-236.

[2] Shen P,Wei Z,Jjiang Y,et al.Novel genetic environment of the xarbapenem-hydrolyzing beta-lactamase KPC-2 among Enterobacteriaceae in China[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53:4333-4338.

[3] Giakkoupi P,Vourli S,Polenlis M,et al.Supplementation ofgrowm media with Zn2+facilitates detection of VIM-2 producillg Pseudomonas aeruginosa[J].Clin Microbiol,2008,46(4):1568-1569.

[4] 劉軍,趙祖國,曾濤,等.主動(dòng)外排系統(tǒng)AcrAB-TolC與肺炎克雷伯菌耐性關(guān)系研究[J].中國病原生物學(xué)雜志,2013,8(1):35-38,70.

[5] 趙曉杰,康海全,姜飛,等.KPC-2基因和外膜蛋白介導(dǎo)的肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類藥物耐藥機(jī)制分析[J].中國病原生物學(xué)雜志,2015,10(3):211-214.

[6] 涂海健,陳淑娟,林群英,等.耐碳青霉烯類抗生素肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測及分析[J].分子診斷與治療雜志,2016,8(4):246-251.

[7] 孫紅,郭普,鐘政榮,等.對亞胺培南耐藥的肺炎克雷伯菌KPC基因型分析[J].蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2012,37(10):1232-1234.

[8] 代強(qiáng),鄭波.2012美國疾病預(yù)防控制中心耐碳青霉烯類腸桿菌控制指南簡介[J/CD].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志(電子版),2013,5(8):30-31.

Screening and clinical analysis of Carbapenem producing Klebsiella pneumoniae

Xu Guang-hui,Chen Shu-juan,Yu Liu-min,Tu Hai-jian
(Laboratory Department,TheAffiliated Hospital of Putian,Putian,Fujian,351100,China)

Objective The analysis of CRKP and the status quo of carbapenylase pneumonia were screened.Methods The k-b method and the matching GN card were used for identification,Improved Hodge test,EDTA paper was used to screen for pneumocyrene pneumoniae.Results From July 2015 to December 2016,there were 36 strains of klebsiella pneumoniae in the clinical department of the hospital.The results indicate that the severe infection in the patients with the carbapenase pneumonia klebsiella pneumoniae,especially in the icu.It`s multiple drug resistance is outstanding.Conclusion The homologous analysis and the monitoring of klebsiella pneumoniae were recommended.The hospital should be highly regarded.

Carbapenase;Drug resistance;Klebsiella pneumoniae;Hospital infection;Screening;Analysis

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.35.003

莆田學(xué)院校內(nèi)科研項(xiàng)目（2014032）通訊作者：許光輝，E-mail:xgh3089@126.com