宋丹++鄭勇斌+童仕倫++肖曠+楊超++孫偉+秦凱迪

[摘要] 目的 構(gòu)建荷載LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)的細胞，并探索該系統(tǒng)在體內(nèi)外檢測Cre酶活性中的應用。 方法 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株MCA38LOXP-DsRed-LOXP并體外驗證檢測Cre酶效能。將Balb/c裸鼠隨機分為兩組（n=10），分別在結(jié)直腸黏膜下移植MCA38Cre-Luciferase與MCA38Luciferase細胞株，兩周后取灌腸液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP，驗證該系統(tǒng)體內(nèi)檢測Cre酶效能。APCLOXP/LOXP小鼠隨機分為兩組（n=20），分別使用可表達Cre酶及熒光素酶（Luciferase）的慢病毒顆粒（CL組）與僅表達Luciferase的慢病毒顆粒（L組）行小鼠結(jié)直腸黏膜下注射，感染后第3天及第3周末取灌腸液檢測Cre酶活性及表達情況，同時行小鼠活體成像檢測Luciferase表達情況，驗證該系統(tǒng)在判斷Cre酶活性與預測基因修飾成功率中的應用。 結(jié)果 Cre重組酶作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP48 h后，紅色熒光明顯減弱。裸鼠灌腸液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP細胞株48 h后，MCA38Cre-Luciferase組紅色熒光明顯減弱。CL組模型鼠病毒注射后第3天檢出16只小鼠熒光素酶及灌腸液Cre酶陽性，第3周末8只小鼠熒光素酶及灌腸液Cre酶陽性。L組模型鼠病毒注射后第3天檢出17只小鼠熒光素酶陽性而灌腸液Cre酶均陰性，第3周末檢出8只小鼠熒光素酶陽性，灌腸液Cre酶均陰性。 結(jié)論 成功構(gòu)建Cre酶檢出系統(tǒng)MCA38LOXP-DsRed-LOXP，實現(xiàn)了體內(nèi)、外無創(chuàng)性檢測Cre酶活性及表達情況，并以此評價APCLOXP/LOXP小鼠結(jié)直腸黏膜基底干細胞病毒感染效率及基因修飾情況。

[關(guān)鍵詞] Cre酶；DsRed熒光蛋白；LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)；結(jié)直腸癌

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（c）-0004-05

Construction and application of LOXP-DsRed-LOXP system

SONG Dan ZHENG Yongbin TONG Shilun XIAO Kuang YANG Chao SUN Wei QIN Kaidi

Department of Gastrointestinal Surgery， Renmin Hospital of Wuhan University， Key Laboratory of Hubei Province for Digestive System Disease， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To Establish a cell line contains the LOXP-DsRed-LOXP system， in order to study its application in detecting the activity of Cre recombinase in vitro and in vivo. Methods MCA38LOXP-DsRed-LOXP cells were established to validate its ability of detecting the activity of Cre recombinase in vitro. Balb/c nude mice were randomly divided into two groups （n=10）. MCA38Cre-Luciferase and MCA38Luciferase cells were transplanted in colorectal mucosa respectively and then collected enema two week later to validate its ability of detecting the activity of Cre recombinase in vivo. APCLOXP/LOXP mice were randomly divided into two groups （n=20）. Lentivirus expressing Cre and luciferase enzyme or expressing luciferase only were injected to colorectal mucosa respectively. Enema were collected at the 3rd day and 3 weeks later the activity of Cre recombinase was detected. Meanwhile， the in vivo imaging of mice was applied to detect the expression of luciferase. The application of this system in detecting the activity of Cre recombinase and predicting the success rate of gene modification was verified. Results The results showed that the red fluorescence was significantly faded in MCA38 LOXP-DsRed-LOXP cells which was modificated by Cre recombinase for more than 48 hours in vitro. Besides， the red fluorescence of MCA38LOXP-DsRed-LOXP cells treated with nude mice enema for more than 48 hours was significantly faded in MCA38Cre-Luciferase group. In group CL， Luciferase and Cre recombinase were positive in 16 mice at the 3rd day and 8 mice at the third weekend after injecting Lentivirus. In group L， Luciferase was positive in 17 mice at the 3rd day and 8 mice at the third weekend after injecting Lentivirus， while Cre recombinase was negative in all. Conclusion LOXP-DsRed-LOXP system are successfully constructed. The in vivo and in vitro non-invasive detection of Cre recombinase activity and expression was achieved. By which it could evaluate the efficiency of virus infection and gene modification of colorectal mucosal basal stem cells in APCLOXP/LOXP mice.endprint

[Key words] Cre recombinase； DsRed fluorescent protein； LOXP-DsRed-LOXP system； Colorectal cancer

Cre/Loxp系統(tǒng)所介導的重組反應僅依賴于Cre酶及其識別位點Loxp序列，不需要消耗能量及其他輔助因子的參與，同時沒有種屬特異性，因而被廣泛應用于基因修飾及其功能鑒定的研究中[1-3]。近年來，多項研究成功應用慢病毒載體將Cre酶引入轉(zhuǎn)基因鼠的特定組織，并在特定發(fā)育時期實現(xiàn)了特定基因的修飾，使得Cre/Loxp系統(tǒng)在小鼠疾病造模應用中取得突破性進展[4-8]。如Vaish等[9]成功應用慢病毒將Cre酶引入APCCKO鼠結(jié)直腸黏膜上皮細胞構(gòu)建出了結(jié)直腸癌散發(fā)性癌灶模型。然而該系統(tǒng)在基因修飾過程中，Loxp位點所在的染色體構(gòu)型、DNA甲基化程度及Cre酶的轉(zhuǎn)錄活性等都將影響重組效率，同時Cre酶對處于不同類型細胞和不同發(fā)育時期染色質(zhì)中Loxp位點的識別能力不同，導致Cre酶在不同物種或同一物種的不同類型細胞或組織中介導Loxp位點發(fā)生重組的效率差異較大[10-11]。因此，在利用Cre酶表達載體慢病毒感染小鼠結(jié)直腸黏膜干細胞誘發(fā)其突變構(gòu)建模擬人結(jié)直腸癌散發(fā)性癌灶過程中，不僅要檢測慢病毒的在體感染效率，還需檢測Cre酶的轉(zhuǎn)錄活性。雖然前期研究可通過檢測其攜帶的報告基因（如GFP熒光蛋白或β-半乳糖苷酶）來反映病毒在體感染效率，卻忽略了Cre酶轉(zhuǎn)錄活性的檢測[9]，且傳統(tǒng)的Cre酶檢測依賴于組織取材行Western Blot或免疫組化檢測，無法實現(xiàn)活體內(nèi)局部動態(tài)無損傷性檢測。因此本研究擬通過構(gòu)建LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)來探索其在體內(nèi)外檢測Cre酶活性中的應用。

1 材料與方法

1.1 材料

①質(zhì)粒：模板質(zhì)粒pMSCV-LOXP-DsRed-LOXP-3xHA-Puro-WPRE（addgene32703），載體質(zhì)粒pCMV：GFP（LOXP）lacZ（addgene 31125），包裝質(zhì)粒pMD2.G（addgene12259）與psPAX2（addgene12260）。②試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、Optim-MEM培養(yǎng)基、PBS、胎牛血清（美國GIBCO公司）、胰酶等，dNTPS、Taq聚合酶、T4 DNA連接酶、BamH Ⅰ核酸內(nèi)切酶（美國NEB公司）；質(zhì)粒抽提試劑盒（德國GIAGEN公司）；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000；Cre酶（Cre Recombinase Ges？鄄icles，TAKARA公司）。③儀器設備：CO2恒溫孵箱（Thermo Fisher公司），倒置熒光顯微鏡（日本OLYMPUS公司），PCR儀（德國Biometra Tgradient）；④動物：SPF級4周齡Balb/c雌性裸鼠20只；SPF級4周齡雌性APCLOXP/LOXP轉(zhuǎn)基因小鼠40只（實驗動物合格證號：4200 9800001176）。

1. 2 方法

1.2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建 利用PCR方法從含有DsRed基因質(zhì)?？寺∧０錺MSCV-LOXP-DsRed-LOXP-3xHA-Puro-WPRE 中獲取目的基因，引物：F，5′-TTCTTGGATCCATAACTTCGTATAGCATA？鄄CATTATACGAAGTTATAATTCTGCAGATATCCAGCA？鄄-3′；R，5′-TTCTTGGATCCTCGAGCGGCCTTATTCAGC？鄄TAGCTCTACTGGA-3′。產(chǎn)物大小為792 bp，并經(jīng)Ba？鄄mH Ⅰ單酶切純化。擴增條件為變性：95℃ 30 s；退火：64℃ 30 s；延伸：72℃ 40 s ，40個循環(huán)。后行1%瓊脂糖凝膠電泳測定擴增產(chǎn)物。使用BamH Ⅰ核酸內(nèi)切酶對逆轉(zhuǎn)錄病毒載體質(zhì)粒pCMV：GFP（LOXP）lacZ和DsRed基因單酶切，37℃ 條件下2 h。酶切產(chǎn)物純化后使用T4 DNA連接酶行DsRed基因連接反應連接入表達載體。連接完成后轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸埃希菌DH-5α中，37℃培養(yǎng)過夜后挑取平板中單克隆菌落接種于 5 mL LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中，并加入5 μL氨芐青霉素，37℃、220 r/min搖床培養(yǎng)過夜，使用Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，隨后進行酶切鑒定，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進行測序檢測。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄病毒pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ的包裝 轉(zhuǎn)染前1 d，使用2 mL無抗生素的10%DMEM培養(yǎng)基將5×105個293T細胞接種于六孔板中，以保證在轉(zhuǎn)染時細胞的混濁度達到90%～95%。轉(zhuǎn)染前2 h使用無抗生素的OPTI-MEM換液。對于每個轉(zhuǎn)染樣品，在250 μL無血清、無抗生素OPTI-MEM培養(yǎng)基中稀釋上述質(zhì)粒及包裝質(zhì)粒共4.0 μg，并輕輕混勻。輕輕混勻Lipo 2000，然后取相應的量稀釋在Opti-MEM 培養(yǎng)基中，室溫下靜置5 min。混合Lipo-2000和DNA的稀釋液（總體積為500 μL）。輕輕混勻并在室溫下靜置20 min，細胞板的每個孔中吸出500 μL培養(yǎng)基后，再畫圈加入上述混合液500 μL，并前后輕輕搖動細胞板使混合液與孔中的培養(yǎng)液混勻。細胞于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后使用含5%FBS的DMEM（含抗生素）2 mL換液，并培養(yǎng)至轉(zhuǎn)染后24～48 h收毒，用于下游實驗。

1.2.3 LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)的構(gòu)建 感染前1 d將狀態(tài)良好的MCA38細胞接種到六孔板，使其感染時細胞匯合率介于50%～70%。感染前30 min，吸出細胞上清，更換為含有5 μg/mL polybrene完全培養(yǎng)基，同時從冰箱取出慢病毒并在冰上緩慢融化。30 min后，將適量pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ病毒顆粒畫圈加入細胞上清中，繼續(xù)37℃培養(yǎng)。感染72 h后觀察細胞熒光情況并更換培養(yǎng)基，加入終濃度為4 μg/mL（經(jīng)梯度實驗確定）嘌呤霉素（puromycin）篩選。每隔2～3 d換1次含終濃度為4 μg/mL puromycin完全培養(yǎng)基。待空白對照組細胞完全死亡后，擴增存活細胞，繼續(xù)培養(yǎng)。endprint

1.2.4 裸鼠結(jié)腸癌細胞原位移植模型構(gòu)建 將SPF級4周齡雄性Balb/c裸鼠20只隨機分為兩組（n=10），適應1周后行結(jié)直腸黏膜下腫瘤細胞注射。MCA38Cre-Luciferase細胞與MCA38Luciferase細胞消化離心后制成單細胞懸液，計數(shù)后取適量細胞用PBS懸浮，通過小鼠結(jié)腸鏡行結(jié)直腸黏膜下注射。第一組每只接種2×106個MCA38Cre-Luciferase細胞，第二組每只接種2×106個MCA38Luciferase細胞，注射體積均為15 μL。2周后行小鼠活體成像及腸鏡檢測成瘤情況，同時取灌腸液檢測Cre酶活性及表達情況。

1.2.5 LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)體外Cre酶活性檢測 檢測前1 d傳代MCA38LOXP-DsRed-LOXP與MCA38DsRed至十二孔板，使其細胞密度在60%～80%。檢測前去除細胞上清，更換為含6 μg/mL polybrene的完全培養(yǎng)基。隨后每孔加入10 μL Cre酶，并將十二孔板室溫條件下離心30 min，37℃孵育2 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后觀察細胞熒光變化情況。

1.2.6 LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)體內(nèi)Cre酶活性檢測 檢測前1 d傳代MCA38LOXP-DsRed-LOXP至十二孔板，使其細胞密度在60%～80%。檢測前去除細胞上清，更換為含6 μg/mL polybrene的完全培養(yǎng)基。隨后收集裸鼠結(jié)腸癌細胞原位移植模型灌腸液，經(jīng)0.45 μm濾器過濾后加入到培養(yǎng)孔中，并將十二孔板室溫條件下離心30 min，37℃孵育2 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后觀察細胞熒光變化情況。

1.2.7 APCLOXP/LOXP小鼠慢病毒顆粒結(jié)直腸黏膜注射 將SPF級4周齡健康APCLOXP/LOXP小鼠40只隨機分為兩組（n=20）。病毒注射前一晚，暫停飼料供應，僅提供飲水。病毒顆粒注射前，戊巴比妥腹腔注射麻醉，隨后將小鼠固定于操作臺，使用小鼠結(jié)腸鏡將提前冰融的病毒顆粒注射至小鼠結(jié)直腸黏膜下。其中CL組使用可表達Cre酶與熒光素酶（Luciferase）的慢病毒顆粒注射，L組使用僅表達Luciferase的慢病毒顆粒注射。

1.2.8 APCLOXP/LOXP小鼠灌腸液Cre酶活性檢測 病毒注射后分別于第3天及第3周末行小鼠灌腸，收集灌腸液，0.45 μm濾器過濾后備用。檢測前1 d傳代MCA38LOXP-DsRed-LOXP至十二孔板，使其細胞密度在60%～80%。檢測前去除細胞上清，更換為含6 μg/mL polybrene的完全培養(yǎng)基。隨后將前述備用灌腸液加入到培養(yǎng)孔中，并將十二孔板室溫條件下離心30 min，37℃孵育2 h后更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后觀察細胞熒光變化情況。

1.2.9 APCLOXP/LOXP小鼠活體成像檢測Luciferase表達情況 用無菌PBS將D-熒光素鈉鹽配制成15 mg/mL，0.2 μm濾器過濾除菌后混勻，冰冷避光保存。小鼠病毒注射后第3天及第3周末，按小鼠10 μL/g體重濃度腹腔注射相應體積的15 mg/mL D-熒光素鈉鹽。注射入體內(nèi)10～20 min（待光信號達到最強穩(wěn)定平臺期）后行成像分析。

2 結(jié)果

2.1 逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ的構(gòu)建與病毒包裝

成功提取目的基因DsRed PCR產(chǎn)物；回收經(jīng)BamHⅠ單酶切pCMV：GFP（LOXP）lacZ大小為8568 bp的酶切片段，純化后得到用于構(gòu)建慢病毒的表達載體。將構(gòu)建好的pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ經(jīng)BamH Ⅰ單酶切，顯示兩條帶，分別為DsRed編碼區(qū)片段（792 bp）和載體片段（8568 bp），序列大小正確。測序結(jié)果顯示新構(gòu)建的pCMV-LOXP-DsRed-LOXP-lacZ中DsRed序列與GeneBank數(shù)據(jù)庫中完全一致。成功包裝LOXP-DsRed-LOXP基因過表達慢病毒顆粒，滴度測定為1×109 TU/mL。

2.2 MCA38LOXP-DsRed-LOXP熒光表達情況

pCMV-LOXP-DsRed- LOXP-lacZ病毒顆粒轉(zhuǎn)染MCA38細胞并行puromycin篩選構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)株MCA 38LOXP-DsRed-LOXP，熒光表達情況良好（圖1，封四），此細胞系成功構(gòu)建。

2.3 裸鼠結(jié)腸癌細胞原位移植模型構(gòu)建情況

腫瘤細胞注射2周后行腸鏡檢測（圖2）及活體成像檢測（圖3），均證實結(jié)直腸癌原位移植模型成功構(gòu)建。

2.4 LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)體外Cre酶活性檢測結(jié)果

Cre酶作用48 h后，觀察到MCA38LOXP-DsRed-LOXP熒光顯著減弱，說明LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)可成功檢測體外Cre酶活性（圖4，封四）。

2.5 LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)體內(nèi)Cre酶活性檢測結(jié)果

裸鼠原位移植模型MCA38Cre-Luciferase組灌腸液作用48 h后，觀察到MCA38LOXP-DsRed-LOXP熒光情況減弱，MCA38Luciferase組灌腸液作用48 h后熒光增強，說明LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)可成功檢測體內(nèi)Cre酶活性。見圖5，封四。

2.6 APCLOXP/LOXP小鼠灌腸液Cre酶活性檢測結(jié)果

CL組APCLOXP/LOXP小鼠病毒注射后第3天出現(xiàn)16只小鼠灌腸液使MCA38LOXP-DsRed-LOXP出現(xiàn)熒光減弱，第3周末8只小鼠使MCA38LOXP-DsRed-LOXP出現(xiàn)熒光減弱（圖6，封四）。L組APCLOXP/LOXP小鼠第3天及第3周末灌腸液均未使MCA38LOXP-DsRed-LOXP出現(xiàn)熒光減弱。endprint

2.7 小鼠活體成像檢測Luciferase表達情況

CL組模型鼠病毒注射后第3天檢出16只小鼠熒光素酶陽性，第3周末8只小鼠熒光素酶陽性。L組模型鼠病毒注射后第3天檢出17只小鼠熒光素酶陽性，第3周末檢出8只小鼠熒光素酶陽性。見圖7，封四。

3 討論

在LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)構(gòu)建過程中，本研究優(yōu)先選擇DsRed熒光蛋白，相比于GFP，其紅色熒光穿透力較強、持續(xù)時間長，且熒光強度比最好的綠色熒光蛋白GFP突變體更高[12]，同時利用Cre/LOXP系統(tǒng)所具有的獨特性質(zhì)，構(gòu)建出鑲嵌有LOXP序列的DsRed基因[13]。在無Cre酶存在的情況下，DsRed基因可正常轉(zhuǎn)錄并在MCA38細胞內(nèi)表達紅色熒光蛋白，當Cre酶作用于LOXP序列后，DsRed基因即被滅活，導致紅色熒光蛋白無法正常表達，隨后通過倒置熒光顯微鏡觀察MCA38LOXP-DsRed-LOXP細胞熒光情況即可快速判斷Cre酶活性。由于MCA38LOXP-DsRed-LOXP細胞可長期培養(yǎng)，且小鼠灌腸液收集方便，因此可滿足長期動態(tài)監(jiān)測小鼠結(jié)直腸黏膜上皮細胞Cre酶的表達情況。

據(jù)此，在體外應用純化的Cre酶作用于MCA38 LOXP-DsRed-LOXP細胞48 h后，紅色熒光明顯減弱，說明該系統(tǒng)可體外有效檢測Cre酶活性。為了進一步探索該系統(tǒng)能否檢測機體內(nèi)所產(chǎn)生的Cre酶活性，同時構(gòu)建了裸鼠結(jié)腸癌細胞原位移植模型，并于腫瘤細胞種植后第2周末（此時可通過小鼠結(jié)腸鏡檢測判斷腫瘤生長情況）收集其灌腸液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP細胞，結(jié)果MCA38Cre-Luciferase組，紅色熒光減弱明顯，說明該系統(tǒng)可成功檢測體內(nèi)Cre酶活性及表達情況。隨后，在使用可表達Cre酶及l(fā)uciferase的CL組與僅表達luciferase的L組感染APCLOXP/LOXP小鼠結(jié)直腸黏膜干細胞誘發(fā)其突變構(gòu)建模擬人結(jié)直腸癌散發(fā)性癌灶模型中，分別于病毒注射后第3天及第3周末收集灌腸液作用于MCA38LOXP-DsRed-LOXP細胞，結(jié)果CL組分別有16只與8只小鼠于病毒注射后第3天及第3周末成功檢測到灌腸液中Cre酶的表達及其活性，且Cre酶與Luciferase檢測結(jié)果一致，即Cre酶陽性鼠其Luci？鄄ferase也為陽性。另外L組始終未檢測到Cre酶的表達，僅于病毒注射后第3天及第3周末分別檢測到17只與8只小鼠出現(xiàn)Luciferase陽性。

上述結(jié)果說明本研究成功構(gòu)建出了LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)，且在小鼠結(jié)直腸癌造模過程中通過收集灌腸液可有效判定結(jié)直腸黏膜上皮細胞Cre酶的活性及其表達情況。但為了保證結(jié)直腸黏膜干細胞中APC基因被成功修飾，還需明確干細胞中Cre酶的轉(zhuǎn)錄活性及其表達情況。由于小鼠結(jié)腸上皮為一單層細胞，該細胞每3～5天更新1次，這種更新由結(jié)腸隱窩基底部的多功能干細胞維持[14-16]。因此在病毒注射后第3周末收集灌腸液檢測Cre酶活性可明確Cre酶基因是否成功整合到干細胞中并穩(wěn)定表達。只有干細胞穩(wěn)定表達Cre酶并成功修飾APC基因誘發(fā)干細胞突變后，其自我更新、克隆、增殖分化，超過了正常腸上皮組織細胞滅活的速度，才將導致腺瘤形成[17-20]。本研究提示Cre酶基因成功整合到這批小鼠的結(jié)直腸黏膜干細胞中。為了進一步明確干細胞中APC基因的修飾情況，需后期對組織取材行目的蛋白檢測。但在實驗進展過程中，發(fā)現(xiàn)早期Cre酶的陽性率與后期APC蛋白檢出率呈正相關(guān)。說明早期檢測Cre酶對靶基因修飾成功情況具有預判作用，也能根據(jù)Cre酶的檢測情況，及時優(yōu)化實驗方案，減少實驗耗材的浪費。

本研究所構(gòu)建的LOXP-DsRed-LOXP系統(tǒng)除上述用途以外，在構(gòu)建表達Cre酶的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞株時，同樣可利用該系統(tǒng)及時檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)株Cre酶的表達情況，而不必通過WB或免疫組化檢測Cre酶的表達，節(jié)約了時間與精力，同時還可間接判斷含有Cre酶基因的慢病毒體外感染目的細胞的感染效率。此外，該系統(tǒng)還可用來檢測泌尿系統(tǒng)腫瘤及生殖系統(tǒng)腫瘤造模過程中的病毒感染情況。但仍局限于特殊部位慢病毒感染情況的檢測，對于其他部位的實體瘤造模有一定局限，因此有待于進一步探索更好的方法應用于其他疾病模型鼠構(gòu)建過程中慢病毒感染效率的檢測。

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（收稿日期：2017-08-25 本文編輯：李岳澤）endprint