李 真 王留強(qiáng) 盧孟柱(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091)

毛白楊PtoWOX11/12a對(duì)楊樹扦插苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響*

李 真 王留強(qiáng) 盧孟柱
(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京 100091)

【目的】 WOX轉(zhuǎn)錄因子家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物胚胎建成、干細(xì)胞分裂和分化的維持以及器官的形成過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究分析毛白楊PtoWOX11/12a基因?qū)D(zhuǎn)基因84K楊葉形、莖等生長(zhǎng)發(fā)育的影響，分析毛白楊不定根誘導(dǎo)過程中及過表達(dá)和抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊中PtoWOX11/12a基因、生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8的表達(dá)模式，為深入研究WOX基因?qū)χ参锷L(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供參考?！痉椒ā?對(duì)在溫室生長(zhǎng)1～3個(gè)月的過表達(dá)和抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因84K楊(對(duì)照)的葉形、株高和地徑進(jìn)行比較； 通過組織切片對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K楊的第5、9和13節(jié)間的解剖學(xué)特征進(jìn)行分析，并對(duì)各節(jié)間的形成層和木質(zhì)部寬度進(jìn)行比較； 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)，分析PtoWOX11/12a、生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8在毛白楊不定根產(chǎn)生過程中及在過表達(dá)和抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊中的表達(dá)模式。【結(jié)果】 在葉形上，過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊葉片長(zhǎng)度與非轉(zhuǎn)基因84K楊(對(duì)照)沒有顯著差異，但是寬度顯著大于對(duì)照； 抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊的葉長(zhǎng)和葉寬都明顯小于對(duì)照，且葉邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀缺刻。在植株的株高和地徑方面，過表達(dá)和抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊的株高和地徑都明顯低于對(duì)照，且存在顯著差異； 莖解剖分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊木質(zhì)部寬度小于對(duì)照，形成層細(xì)胞層數(shù)多，而抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊木質(zhì)部寬度同樣小于對(duì)照，但與過表達(dá)植株相比，木質(zhì)部寬度相對(duì)變大，形成層細(xì)胞層數(shù)變少。qPCR結(jié)果顯示PtoWOX11/12a基因在毛白楊不定根產(chǎn)生過程中被誘導(dǎo)并持續(xù)表達(dá)，而生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8在誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后表達(dá)量才迅速增加，但在過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量升高，在抑制表達(dá)植株中表達(dá)量降低?！窘Y(jié)論】PtoWOX11/12a基因的過表達(dá)或者抑制表達(dá)都影響了轉(zhuǎn)基因84K楊葉的發(fā)育、莖的高生長(zhǎng)和徑向生長(zhǎng)(次生木質(zhì)部發(fā)育)；PtoWOX11/12a基因在楊樹不定根形成和生長(zhǎng)過程中發(fā)揮作用涉及到生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8的參與。在生根過程中，PtoWOX11/12a基因和生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1及YUCCA8在表達(dá)時(shí)間上存在時(shí)間間隔。高水平的PtoWOX11/12a抑制了生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊由于更容易形成分生組織，促進(jìn)了根原基的形成，產(chǎn)生比較多的不定根。在不定根生長(zhǎng)過程中，YUCCA1及YUCCA8基因上調(diào)表達(dá)，可促進(jìn)生長(zhǎng)素合成和根部分生組織細(xì)胞的分裂；在莖中，二者上調(diào)表達(dá)促使過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊形成層活動(dòng)的增強(qiáng)，繼而影響木質(zhì)部的分化，木質(zhì)部變窄。

楊樹；PtoWOX11/12a； 基因表達(dá)； 實(shí)時(shí)熒光定量PCR； 不定根； 形成層

WUSCHEL related homeobox(WOX)是真核生物同源異型盒(homeobox，HB)轉(zhuǎn)錄因子超家族中植物特有的1個(gè)亞支，含有1個(gè)由65個(gè)氨基酸殘基組成的、保守的同源異型結(jié)構(gòu)域(homedomain, HD)(Zhangetal., 2015)。這類轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期發(fā)揮重要作用，如參與胚的形成、調(diào)控干細(xì)胞分裂分化動(dòng)態(tài)平衡和器官的形成等(van der Graaffetal., 2009)。

在模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)中，WOX轉(zhuǎn)錄因子家族包含15個(gè)成員(WUS以及WOX1-WOX14)，它們主要在莖和根頂端分生區(qū)干細(xì)胞的維持、側(cè)生器官的發(fā)育、花器官的形成和胚發(fā)育等方面發(fā)揮著重要的作用(Aichingeretal., 2012; Uedaetal., 2011)。AtWUS基因是WOX家族中最早發(fā)現(xiàn)的基因，主要在維持根和莖頂端分生組織(shoot apical meristem，SAM)中干細(xì)胞特性、促進(jìn)干細(xì)胞的增殖和抑制干細(xì)胞的分化等過程中發(fā)揮重要作用(吳錦斌等， 2013)。AtWOX5作為AtWUS基因的同系物，在調(diào)控莖尖和根部干細(xì)胞穩(wěn)定以維持未分化狀態(tài)時(shí)，二者可以相互補(bǔ)償(Sarkaretal., 2007)。在水稻(Oryzasativa)中，leaf2和leaf3基因位點(diǎn)編碼OsWOX3A蛋白，雙突變體產(chǎn)生窄而卷曲葉片、增多的分蘗、減少的側(cè)根和窄小的種子，說(shuō)明OsWOX3A參與橫軸器官向外側(cè)的生長(zhǎng)發(fā)育及分蘗與側(cè)根的發(fā)育，同時(shí)調(diào)控葉片的維管模式(Choetal., 2013)。AtWOX4基因主要在維管原形成層和形成層中表達(dá)，參與次生生長(zhǎng)過程中維管形成層干細(xì)胞增殖(Hirakawaetal., 2010; Jietal., 2010)。AtWOX11和AtWOX12共同參與葉片原形成層細(xì)胞或薄壁細(xì)胞向根源基細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程(Liuetal., 2014a)。在模式植物水稻基因組中，WOX轉(zhuǎn)錄因子家族有13個(gè)成員，部分成員的生物學(xué)功能和作用機(jī)制已得到詳細(xì)的研究和闡述。例如，OsWOX7參與調(diào)控水稻居間分生組織(Wangetal., 2014)；OsWOX11受外源生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)后主要在根尖和根分生組織的形成區(qū)中表達(dá)，并參與激活冠狀根的發(fā)生，促進(jìn)其生長(zhǎng)(Zhaoetal., 2009)。

目前，關(guān)于該家族成員的研究，主要集中于擬南芥、水稻、矮牽牛(Petuniahybrida)、番茄(Lycopersiconesculentum)等草本植物中，木本植物中WOX基因的研究較少。在楊樹中，根據(jù)毛果楊(Populustrichocarpa)基因組信息，本課題組前期鑒定了18個(gè)毛白楊(Populustomentosa)WOX轉(zhuǎn)錄因子家族成員，對(duì)它們的序列結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系以及在不同組織(根、莖、葉和未成熟木質(zhì)部等)中的表達(dá)模式等進(jìn)行了分析和比較，發(fā)現(xiàn)PtoWOX11/12a主要在根部表達(dá)，過表達(dá)該基因能夠影響楊樹根的發(fā)育，增加不定根的數(shù)量(Liuetal., 2014b)，該研究也是關(guān)于楊樹WOX基因的首次報(bào)道； 此外分析不定根形成過程中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8的表達(dá)發(fā)生顯著變化。隨后，Xu等(2015)發(fā)現(xiàn)南林895楊(Populus×euramericana‘Nanlin 895’)PeWOX11a和PeWOX11b基因主要在根中表達(dá)，過表達(dá)PeWOX11a或者PeWOX11b不僅能夠增加轉(zhuǎn)基因楊樹不定根的數(shù)量，還能誘導(dǎo)地上部分莖段產(chǎn)生異位根。

為進(jìn)一步了解毛白楊PtoWOX11/12a基因是否參與調(diào)控楊樹其他組織或者器官的生長(zhǎng)和發(fā)育，并探討其參與調(diào)控的作用機(jī)制，本研究分析了PtWOX11/12a基因?qū)顦淙~片、莖生長(zhǎng)發(fā)育的影響，同時(shí)還利用所建立的該基因?qū)Σ欢ǜ恼T導(dǎo)試驗(yàn)體系(Liuetal., 2014c)，探討了該基因與生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8在楊樹組培苗莖段扦插生根過程中各個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)情況，以了解它們互作的機(jī)制。上述結(jié)果為進(jìn)一步闡明PtoWOX11/12a基因調(diào)控楊樹生長(zhǎng)發(fā)育作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料及生長(zhǎng)條件

毛白楊用于基因表達(dá)分析，銀腺楊無(wú)性系84K楊(P.alba×P.glandulosacl. 84K)用于遺傳轉(zhuǎn)化，本課題組前期已獲得的過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊(Liuetal., 2014b)用于表型和不定根中生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因的表達(dá)分析。所有植物材料均由本實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)保存并繁殖。將轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K楊帶有頂端的組培苗嫩莖(約2.5 cm)扦插到生根培養(yǎng)基(1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.05 mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1NAA，pH5.8～6.0)中，置于人工氣候室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為16 h光照/8 h黑暗，23～25 ℃，光照強(qiáng)度50 μmol·m-2s-1。生長(zhǎng)20天后，將其移栽到人工土中，隨后轉(zhuǎn)入溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，生長(zhǎng)條件同上。

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的毛白楊組培苗，截取帶有頂端的組培苗莖段(約2.5 cm)扦插到新鮮的生根培養(yǎng)基中，依據(jù)前期不定根誘導(dǎo)過程(Liuetal., 2014c)，分別在培養(yǎng)0，2，3，4，6，8天后，收集每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的植株最底端約0.5 cm長(zhǎng)莖段，每個(gè)樣品至少含10株扦插苗，液氮速凍置于-80 ℃保存用于RNA提取。

1.2 總RNA的提取和實(shí)時(shí)熒光定量PCR

采用傳統(tǒng)的CTAB法(Changetal., 1993)提取上述毛白楊莖段各時(shí)間點(diǎn)樣品以及不同轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K楊幼嫩葉片的總RNA。利用RQ1 RNase-free DNase(Promega，Madison，WI，USA)對(duì)其進(jìn)行處理以去除DNA污染。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)合成cDNA第1鏈，具體方法參見試劑盒使用說(shuō)明。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)，在Roche 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche Applied Science，Penzberg，Upper Bavaria，Germany)上進(jìn)行操作，以84K楊α-actin基因作為內(nèi)參。為了確保試驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可靠，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)有3次生物學(xué)重復(fù)和4次技術(shù)重復(fù)。用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基因特異性引物使用Primer 5軟件設(shè)計(jì)，其序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的基因特異性引物Tab.1 Primers used for qPCR

1.3 載體構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化84K楊

EAR(ERF-associated amphiphilic repression)抑制結(jié)構(gòu)域作為顯性抑制子能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子下游基因的表達(dá)(Hiratsuetal., 2003)。本試驗(yàn)以毛白楊cDNA為模板，擴(kuò)增PtoWOX11/12a基因編碼區(qū)序列，并融合EAR抑制結(jié)構(gòu)域(SRDX序列)，通過Gateway BP反應(yīng)重組進(jìn)入pDNOR222(Invitrogen)載體后送公司測(cè)序，測(cè)序正確后通過LR反應(yīng)亞克隆至終載體pMDC32，電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101，以農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化84K楊(Liuetal.， 2014b)。在含有200 mg·L-1特美汀和3 mg·L-1潮霉素的芽分化培養(yǎng)基(1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基+0.5 mg·L-16-BA+0.05 mg·L-1NAA)上篩選抗性葉芽，隨后在含有同樣濃度抗生素的生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。摘取幼苗葉片，提取總RNA，利用qPCR技術(shù)對(duì)其進(jìn)行分子鑒定。

1.4 轉(zhuǎn)基因84K楊的表型變化

將20天左右的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?4K楊組培苗移栽至裝有人工土的塑料盆中，置于溫室中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1個(gè)月對(duì)各個(gè)植株的株高和地徑進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，摘取苗木頂端至基部的所有葉片，觀察其葉形變化，并對(duì)第4片展開葉的長(zhǎng)、寬以及長(zhǎng)寬比進(jìn)行連續(xù)測(cè)量和計(jì)算。為了減少植株的個(gè)體差異，每次試驗(yàn)至少3次生物學(xué)重復(fù)，每組數(shù)據(jù)至少測(cè)量12株材料。結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)。

1.5 莖段切片分析

截取3月齡轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?4K楊頂端向下的第5、9、13節(jié)間，進(jìn)行切片分析。首先，取每個(gè)莖段中部位置約2～3 mm厚度的材料放入2.5%的戊二醛固定液中過夜固定。固定的材料經(jīng)過70%、85%、95%和100%的酒精脫水后用Spurr樹脂包埋。用Leica EMUC7超薄切片機(jī)(Leica 283 Microsystems GmbHWetzlar，Germany)按厚度為2 000 nm的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行切片，經(jīng)甲苯胺藍(lán)O(Toluidine blue O，TBO)染色后，使用蔡司Zeiss Axio Imager A1(Carl Zeiss)顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，通過Axiovision Rel 4.8對(duì)木質(zhì)部寬度進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 過表達(dá)和抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊的鑒定

為了獲得抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因材料，構(gòu)建了PtoWOX11/12a基因的顯性抑制載體，轉(zhuǎn)化84K楊獲得轉(zhuǎn)基因株系，經(jīng)qPCR檢測(cè)篩選出表達(dá)量明顯降低的2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系DR19和DR31(圖1)； 同時(shí)，對(duì)已有的過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊2個(gè)株系(OE6和OE12)進(jìn)行了分子檢測(cè)(圖1)，結(jié)果顯示過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系成熟葉片中的PtoWOX11/12a基因的表達(dá)量分別高于非轉(zhuǎn)基因84K楊(對(duì)照)約400、600倍。過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(OE6和OE12)和抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(DR19和DR31)用于后續(xù)的表型比較和功能分析試驗(yàn)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析過表達(dá)和抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊Fig.1 qPCR analysis of PtoWOX11/12a-overexpression and -suppressed expression transgenic 84K poplarsCK： 非轉(zhuǎn)基因84K楊； OE6, OE18： 過表達(dá)轉(zhuǎn)基因84K楊6號(hào)和18號(hào)株系； DR19, DR31： 顯性抑制轉(zhuǎn)基因84K楊19號(hào)和31號(hào)株系。下同。CK: Non-transgenic 84K poplar; OE6, OE18: Over-expression transgenic poplar lines 6 and 18; DR19, DR31: Suppressed expression transgenic poplar lines 19 and 31. The same below.

2.2 PtoWOX11/12a對(duì)轉(zhuǎn)基因84K楊葉形的影響

圖2 PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊的葉形分析Fig.2 Analysis of leaf shape of PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars1-11： 自植株頂端至基部的所有葉片排序The serial number of leaves from the top to the base of plant.

將20天的生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的過表達(dá)(OE6和OE18)、抑制表達(dá)(DR19和DR31)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊組培苗移栽至裝有人工土的塑料盆中，置于溫室培養(yǎng)2個(gè)月后，對(duì)其頂端至基部的所有葉片依次進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株的葉片趨近于卵圓形，而抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株葉片趨近于狹長(zhǎng)型，且葉片邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀缺刻(圖2)。同時(shí)，比較了栽植于溫室1、2和3個(gè)月后的轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株第4片展開葉的長(zhǎng)、寬以及長(zhǎng)寬比發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株的葉片長(zhǎng)度與對(duì)照類似，沒有顯著差異，但寬度明顯大于對(duì)照，且二者葉片的長(zhǎng)寬比存在顯著差異； 抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株葉片的長(zhǎng)度和寬度顯著低于對(duì)照葉片，長(zhǎng)寬比卻顯著大于對(duì)照(表2)。以上結(jié)果表明，PtoWOX11/12a基因參與了84K楊葉片的生長(zhǎng)和發(fā)育。

表2 PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊葉片長(zhǎng)、寬及長(zhǎng)寬比統(tǒng)計(jì)① Tab.2 Statistics of the leaf length, width and length/width between PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

①數(shù)值表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差； 轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照的t檢驗(yàn)P值用星號(hào)表示:*,Plt;0. 05;**,Plt;0.01。 下同。Values shown are means±SD.Pvalues of Student’sttest for transgenic lines and control poplars are denoted with asterisks(*,Plt;0.05;**,Plt; 0.01). The same below.

2.3 PtoWOX11/12a對(duì)轉(zhuǎn)基因84K楊株高、地徑的影響

為了進(jìn)一步研究PtoWOX11/12a對(duì)轉(zhuǎn)基因84K楊生長(zhǎng)發(fā)育的影響，對(duì)過表達(dá)(OE6和OE18)、抑制表達(dá)(DR19和DR31)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因以及非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊的地上部分(株高和地徑)進(jìn)行了連續(xù)統(tǒng)計(jì)。株高統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株的株高均顯著低于對(duì)照，且差異隨著植株生長(zhǎng)更加明顯； 而抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株的株高又顯著低于過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，表現(xiàn)為植株矮小、生長(zhǎng)遲緩。地徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，過表達(dá)和抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株的地徑均小于對(duì)照，且存在顯著差異，其中抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株的地徑最小(圖3，表3)。

圖3 2月齡PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊表型Fig.3 Phenotypes of two-month-old PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

對(duì)3月齡轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因84K楊莖段的第5、9和13節(jié)間進(jìn)行解剖分析并統(tǒng)計(jì)木質(zhì)部寬度。結(jié)果顯示，過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的第5、9和13節(jié)間木質(zhì)部寬度明顯低于對(duì)照，但形成層細(xì)胞層數(shù)增多； 而抑制表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的木質(zhì)部寬度低于對(duì)照但卻高于過表達(dá)植株，但形成層區(qū)域變窄。木質(zhì)部的寬度為： 對(duì)照gt;抑制表達(dá)植株gt;過表達(dá)植株； 形成層區(qū)域大小為： 過表達(dá)植株gt;對(duì)照gt;抑制表達(dá)植株(圖4，表4)。以上結(jié)果表明過表達(dá)或者抑制表達(dá)PtoWOX11/12a基因不僅引起葉形發(fā)生變化，同時(shí)也影響了植株次生生長(zhǎng)，表現(xiàn)為影響株高、地徑以及莖木質(zhì)部發(fā)育。

2.4 PtoWOX11/12a對(duì)生長(zhǎng)素合成基因的影響

利用毛白楊不定根誘導(dǎo)體系，進(jìn)一步分析了PtoWOX11/12a是否通過影響生長(zhǎng)素合成來(lái)調(diào)控分生組織的活性。通過qPCR分析了毛白楊PtoWOX11/12a基因和生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8在毛白楊不定根產(chǎn)生和伸長(zhǎng)過程中各個(gè)時(shí)期的表達(dá)，同時(shí)對(duì)PtoWOX11/12a基因在84K楊葉片中過表達(dá)或抑制表達(dá)后對(duì)生長(zhǎng)素合成基因的影響做了進(jìn)一步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)莖段插入培養(yǎng)基后，PtoWOX11/12a被誘導(dǎo)表達(dá)，隨后其表達(dá)量均上調(diào)，且在第2天時(shí)表達(dá)量最高，說(shuō)明該基因在不定根發(fā)生的起始階段發(fā)揮著重要作用(圖5A)。在不定根產(chǎn)生的過程中，生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8在不定根發(fā)育的前期表達(dá)量較低，但是在第4天(即不定根形成之后)時(shí)出現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)(圖5B，C)。過表達(dá)PtoWOX11/12a基因促進(jìn)生長(zhǎng)素合成基因的表達(dá)，而抑制表達(dá)PtoWOX11/12a基因生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8表達(dá)量下調(diào)(圖5D)。表明生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8受到PtoWOX11/12a的影響，在不定根形成后期(伸長(zhǎng)過程)中發(fā)揮作用。

表3 PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊株高、地徑比較Tab.3 Comparison of the height and basal diameter among PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

表4 PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊木質(zhì)部及形成層寬度比較Tab.4 Comparison of the xylem and cambium width among PtoWOX11/12a transgenic and non-transgenic (control) 84K poplars

圖5 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析PtoWOX11/12a和生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1、YUCCA8的表達(dá)模式Fig.5 Expression analysis of PtoWOX11/12a and auxin genes (YUCCA1 and YUCCA8) using qPCRA-C： 誘導(dǎo)不同天數(shù)的毛白楊莖段； D： PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因(對(duì)照)84K楊葉片。A-C: Induction of stem segments of Populus tomentosa with different induction days; D: Leaves from different PtoWOX11/12a- and non-transgenic (control) 84K poplars.

3 討論

WOX家族基因除了參與莖尖分生組織干細(xì)胞的維持, 還參與高等植物根尖分生組織和維管分生組織中干細(xì)胞的維持(于燕杰等， 2016)。目前，對(duì)于WOX基因家族中WOX11/12a基因的研究多集中在不定根發(fā)育方面，例如，Liu等(2014b)發(fā)現(xiàn)毛白楊WOX11/12a基因能夠促進(jìn)不定根的生長(zhǎng)，增加不定根數(shù)量； Xu等(2015)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PeWOX11a和PeWOX11b增加楊樹的不定根數(shù)目同時(shí)還誘導(dǎo)出異位不定根，此外在過表達(dá)PeWOX11b轉(zhuǎn)基因楊樹的葉腋中誘導(dǎo)產(chǎn)生不定根。但是目前對(duì)WOX11/12a基因?qū)χ仓甑厣喜糠稚L(zhǎng)量的影響還未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)或者抑制PtoWOX11/12a基因能夠影響轉(zhuǎn)基因84K楊的根系生物量，這與前人的研究結(jié)果(Xuetal., 2015)一致，但是過表達(dá)或者抑制PtoWOX11/12a基因均影響了植株的葉形、株高、地徑以及莖木質(zhì)部的發(fā)育。過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株葉片的長(zhǎng)度與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ?4K楊沒有顯著差異，但寬度稍微大于對(duì)照； 抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因植株葉片長(zhǎng)度和寬度都顯著低于對(duì)照，這表明葉芽基形成后分生組織的分裂和分化受到了PtoWOX11/12a的調(diào)控(圖2)。解剖分析發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)植株的木質(zhì)部寬度遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于對(duì)照，同時(shí)抑制表達(dá)植株的木質(zhì)部寬度也小于對(duì)照，但是較過表達(dá)植株略寬，說(shuō)明PtoWOX11/12a基因能夠影響莖的縱向及橫向生長(zhǎng)(次生木質(zhì)部發(fā)育)，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株株高、地徑均低于對(duì)照楊樹(圖3)。木質(zhì)部發(fā)育是由形成層活動(dòng)決定的，過表達(dá)PtoWOX11/12a基因可能使轉(zhuǎn)基因楊樹形成層分裂活動(dòng)增強(qiáng)，形成層細(xì)胞層數(shù)增多，但分化程度相對(duì)對(duì)照楊樹較弱，致使木質(zhì)部寬度低于對(duì)照楊樹，而當(dāng)PtoWOX11/12a表達(dá)受到抑制后，形成層分裂活動(dòng)降低，形成層細(xì)胞層數(shù)減少，但是分化程度介于過表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹和對(duì)照楊之間(圖4，表4)，說(shuō)明PtoWOX11/12a影響了形成層干細(xì)胞的活動(dòng)和木質(zhì)部的分化。在擬南芥中，WOX5和WOX11在根頂端分生組織中發(fā)揮作用，WUS和WOX4主要參與莖頂端分生組織和形成層中的活動(dòng)，但在調(diào)控莖尖和根部干細(xì)胞穩(wěn)定以維持未分化狀態(tài)時(shí)，WOX和WUS可以相互補(bǔ)償(Sarkaretal., 2007; Hirakawaetal., 2010; Liuetal., 2014a)。由此推測(cè)，在本研究中當(dāng)PtoWOX11/12a基因過表達(dá)后，葉片和莖部該基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，可能干擾或替代了原有的該家族其他成員在葉片或者莖中的功能，因而出現(xiàn)上面所述的表型變化。本文主要研究了PtoWOX11/12a基因?qū)厥?4K楊扦插苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響，今后工作還應(yīng)進(jìn)一步分析該基因?qū)Χ嗄晟仓晟L(zhǎng)發(fā)育的影響，例如發(fā)達(dá)的根系在田間是否最終會(huì)促進(jìn)地上部分的增長(zhǎng)等問題，進(jìn)而全面揭示該基因的調(diào)控作用。

根據(jù)前人研究發(fā)現(xiàn)，楊樹莖段插入基本培養(yǎng)基后第2～3天出現(xiàn)愈傷組織，4天后產(chǎn)生側(cè)根，隨后側(cè)根進(jìn)入伸長(zhǎng)階段(Liuetal., 2014c)。因此，在本研究中，為了解釋PtoWOX11/12a對(duì)分生組織的影響，利用楊樹不定根誘導(dǎo)系統(tǒng)分析了PtoWOX11/12a在莖段產(chǎn)生不定根的各個(gè)時(shí)期中的表達(dá)情況，特別是對(duì)生長(zhǎng)素合成的影響。當(dāng)莖段插入培養(yǎng)基后，PtoWOX11/12a基因被誘導(dǎo)表達(dá)，在愈傷組織形成時(shí)期(第2～3天)一直處于較高的表達(dá)水平，說(shuō)明PtoWOX11/12a基因參與不定根形成起始過程(圖5)，而這個(gè)時(shí)期生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8表達(dá)量很少，但在不定根形成后的伸長(zhǎng)期(4天后)表達(dá)量急劇增加，推測(cè)在生根過程中，PtoWOX11/12a基因及生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8在表達(dá)時(shí)間上存在時(shí)間間隔。高水平的PtoWOX11/12a抑制了生長(zhǎng)素合成相關(guān)基因的表達(dá)，導(dǎo)致過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因楊樹更容易形成分生組織，因而促進(jìn)了根原基的形成，產(chǎn)生了較多的不定根(Liuetal., 2014b)。不定根生長(zhǎng)過程中，YUCCA1及YUCCA8基因上調(diào)表達(dá)，促進(jìn)了生長(zhǎng)素合成和根部分生組織細(xì)胞的分裂。在莖中表現(xiàn)為形成層活動(dòng)增強(qiáng)，繼而影響木質(zhì)部的分化，木質(zhì)部變窄。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)PtoWOX11/12a基因影響楊樹扦插苗的生長(zhǎng)發(fā)育。過表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊的葉片寬度增加，株高、地徑降低，木質(zhì)部寬度變小，但是形成層細(xì)胞層數(shù)增加； 抑制表達(dá)PtoWOX11/12a轉(zhuǎn)基因84K楊的葉長(zhǎng)、寬都明顯變小，且葉邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀缺刻，株高和地徑也顯著降低，木質(zhì)部寬度與過表達(dá)植株相比相對(duì)變大，但形成層細(xì)胞層數(shù)變少。這種變化是由于PtoWOX11/12a影響了生長(zhǎng)素合成基因YUCCA1和YUCCA8的表達(dá)，從而導(dǎo)致形成層活動(dòng)和木質(zhì)部形成的變化。本研究為深入探索WOX基因在植物不同組織生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了參考。

吳錦斌, 宋 銀, 喬 睿, 等. 2013. CLE 多肽參與植物分生組織維持與分化平衡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究. 生命科學(xué), 25(4): 421-426.

(Wu J B, Song Y, Qiao R,etal. 2013. CLE peptide signaling in balancing the maintenance and differentiation of meristems. Chinese Bulletin Life Sciences, 25(4): 421-426.[in Chinese])

于燕杰, 張大兵, 袁 政. 2016. WOX蛋白家族調(diào)控干細(xì)胞發(fā)育分子機(jī)制的研究進(jìn)展. 植物學(xué)報(bào), 51(4): 565-574.

(Yu Y J, Zhang D B, Yuan Z. 2016. The updated functional study of WOX protein family in regulating stem cell development. Chinese Bulletin of Botany, 51 (4): 565-574.[in Chinese])

Aichinger E, Kornet N, Friedrich T,etal. 2012. Plant stem cell niches. Annual Review of Plant Biology, 63: 615-636.

Chang S, Puryear J, Cairney J. 1993. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees. Plant Molecular Biology Reporter, 11(2): 113-116.

Cho S H, Yoo S C, Zhang H,etal. 2013. The rice narrow leaf2 and narrow leaf3 loci encodeWUSCHEL-relatedhomeobox3A(OsWOX3A) and function in leaf, spikelet, tiller and lateral root development. New Phytologist, 198(4): 1071-1084.

Hirakawa Y, Kondo Y, Fukuda H. 2010. TDIF peptide signaling regulates vascular stem cell proliferation via theWOX4 homeobox gene inArabidopsis. The Plant Cell, 22(8): 2618-2629.

Hiratsu K, Matsui K, Koyama T,etal. 2003. Dominant repression of target genes by chimeric repressors that include the EAR motif, a repression domain, inArabidopsis. The Plant Journal, 34(5): 733-739.

Ji J, Strable J, Shimizu R,etal. 2010. WOX4 promotes procambial development. Plant Physiology, 152(3): 1346-1356.

Liu J, Sheng L, Xu Y,etal. 2014a.WOX11 and 12 are involved in the first-step cell fate transition during de novo root organogenesis inArabidopsis. The Plant Cell, 26(3): 1081-1093.

Liu B, Wang L, Zhang J,etal. 2014b.WUSCHEL-relatedHomeoboxgenesinPopulustomentosa: diversified expression patterns and a functional similarity in adventitious root formation. BMC Genomics, 15(1): 296.

Liu B, Zhang J, Wang L,etal. 2014c. A survey ofPopulusPIN-FORMED family genes reveals their diversified expression patterns. Journal of Experimental Botany, 65(9): 2437-2448.

Sarkar A K, Luijten M, Miyashima S,etal. 2007. Conserved factors regulate signalling inArabidopsisthalianashoot and root stem cell organizers. Nature, 446(7137): 811-814.

Ueda M, Zhang Z, Laux T. 2011. Transcriptional activation ofArabidopsisaxis patterning genesWOX8/9 links zygote polarity to embryo development. Developmental Cell, 20(2): 264-270.

van der Graaff E, Laux T, Rensing S A. 2009. The WUS homeobox-containing (WOX) protein family. Genome Biology, 10(12): 248.

Wang W, Li G, Zhao J,etal. 2014. DWARF TILLER1, a WUSCHEL-related homeobox transcription factor, is required for tiller growth in rice. PLoS Genetics, 10(3): e1004154.

Xu M, Xie W, Huang M. 2015. TwoWUSCHEL-relatedHOMEOBOXgenes,PeWOX11aandPeWOX11b, are involved in adventitious root formation of poplar. Physiologia Plantarum, 155(4): 446-456.

Zhang Y, Jiao Y, Liu Z,etal. 2015. ROW1 maintains quiescent centre identity by confiningWOX5 expression to specific cells. Nature Communications, 6: 6003.

Zhao Y, Hu Y, Dai M,etal. 2009. The WUSCHEL-related homeobox geneWOX11 is required to activate shoot-borne crown root development in rice. The Plant Cell, 21(3): 736-748.

(責(zé)任編輯 徐 紅)

EffectsofPtoWOX11/12aGenefromPopulustomentosaontheGrowthandDevelopmentofCuttingSeedlingsinPoplar

Li Zhen Wang Liuqiang Lu Mengzhu
(StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingKeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationoftheStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestry,ChineseAcademyofForestryBeijing100091)

【Objective】 WOX transcription factor family is one of the plant-specific transcription factor families, which have been demonstrated playing an important role in the embryonic patterning, stem cell maintenance and proliferation and lateral organ development. This study analyzed the roles ofPtoWOX11/12agene fromPopulustomentosain the development of leaves and stems of transgenic 84K poplar(Populusalba×P.glandulosacl. 84K). The gene expression level during the process of adventitious roots formation ofPopulustomentosa,and in overexpression and suppressed expression ofPtoWOX11/12atransgenic 84K poplars were analyzed. Our research provides a foundation for further studies of the roles ofWOXsgene in plant development.【Method】 The leaf shape, height and basal diameter of one-month-old to three-month-old transgenic lines and non-transgenic 84K poplar (control) in the greenhouse were measured and compared. The anatomy of stem sections of the 5th, 9thand 13thinternodes of transgenic lines and control plants was analyzed and the width of xylem and cambium were compared. The expression ofPtoWOX11/12a,YUCCA1 andYUCCA8 during the process of adventitious roots development inP.tomentosaand in overexpression and suppressed expression ofPtoWOX11/12atransgenic 84K poplars was examined using quantitative real-time PCR (qPCR).【Result】 There were no significant differences between overexpression ofPtoWOX11/12aand control plants in leaf length, but the leaf width of overexpression ofPtoWOX11/12awas sharply larger than the control. The leaf length and width of suppression expressionPtoWOX11/12atransgenic poplars were less than control, and the leaf margin had serrate incision. The height and diameter of overexpression and suppression expressionPtoWOX11/12atransgenic poplars were significantly less than the control poplars. The anatomy analysis indicated that the xylem, the number of cambium layers of overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars was thinner than the control and the xylem of the suppression expression ofPtoWOX11/12awas also thinner than the control, but it is wider than overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars. qPCR analysis showed thatPtoWOX11/12awas strongly induced and expressed in the stem during the process of adventitious roots development. The expression levels of auxin synthesis genes,YUCCA1 andYUCCA8, were increased at the third day. Furthermore, their expression levels were increased in overexpressed while decreased in suppressedPtoWOX11/12atransgenic poplars.【Conclusion】 Overexpression or suppression expression ofPtoWOX11/12agene has effects on plant leaf shape, height and stem radial growth (secondary xylem development).PtoWOX11/12agene participates in adventitious roots formation and elongation involved in the expression of auxin synthesis genesYUCCA1 andYUCCA8. In the process of root formation, expression time interval was existed amongPtoWOX11/12a,YUCCA1 andYUCCA8 genes. Higher expression ofPtoWOX11/12amay inhibits the expression of auxin synthesis genes, thus overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars are easier to form meristem, promote root primordium formation and produce large number of adventitious roots. During adventitious root growth, the increased expression level ofYUCCA1 andYUCCA8 promote auxin synthesis and root meristem cell division. In stem the increased activities of cambium affected the xylem differentiation in overexpressionPtoWOX11/12atransgenic poplars, thus the xylem of transgenic poplars is thinner in size than the control.

Populus；PtoWOX11/12a； gene expression； quantitative real-time PCR； adventitious root； cambium

10.11707/j.1001-7488.20171108

2017-03-02；

2017-04-28。

“十二五”863 計(jì)劃課題“林木優(yōu)質(zhì)、速生性狀調(diào)控基因的分離及育種技術(shù)研究”(2013AA102702)。

* 盧孟柱為通訊作者。

S718.46

A

1001-7488(2017)11-0069-08