徐有明 周彩霞 林 漢 陶吉云 張菊花

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院 武漢 430070)

維管形成層活動是木材形成機制和木材基因調(diào)控研究的焦點(Oliveiraetal.，2009；Huangetal.，2014)。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在植物細胞壁與生物質(zhì)能源利用方面開展了大量研究，其中樹木形成層細胞的季節(jié)性分生分裂活動和木材形成規(guī)律得到廣泛重視，如杉木(Cunninghamialanceolata)形成層季節(jié)性活動研究表明，維管形成層細胞數(shù)量與形成層區(qū)寬度正相關(guān)，形成層細胞數(shù)量和形成層細胞徑向直徑與木質(zhì)部形成密切相關(guān)(Wuetal.，2016)，形成層紡錘形細胞徑向壁和弦向壁厚度差異顯著，射線細胞壁為典型的復(fù)層結(jié)構(gòu)(Songetal.，2011)。目前，在超微水平上研究針葉材樹木管胞具緣紋孔和細胞壁結(jié)構(gòu)方面的文獻較多(Kwon，2014；Jelonek，2015；Sivakumaretal.，2016)，但有關(guān)形成層原始細胞在不同時期超微結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化、活動方式以及與物候關(guān)系方面的研究較少(Songetal.，2011；Raoetal.，2001；Antonovaetal.，2006)。

濕地松(Pinuselliottii)是我國南方引種栽培較為成功的速生用材樹種(黃齊等，2010；Zhongetal.，2001)。Harley等(2012)采用光學(xué)顯微鏡結(jié)合NIS元素圖像分析系統(tǒng)研究美國佛羅里達濕地松不同階段形成層細胞分生分裂活動和木材形成規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)濕地松生長季較長，從2月至12月連續(xù)11個月生長，但次年1月都會經(jīng)歷一段時間的短暫休眠(可以解釋其生長輪具有明確邊界的現(xiàn)象)；短暫休眠狀態(tài)下，濕地松個體間差異很小，太陽輻射是影響個體間生長的最主要氣候因子，特別是形成層活動周期季節(jié)性變化與物候之間的關(guān)系密切。我國對濕地松的研究主要集中在人工林栽培管理、苗木培育、松脂、木材質(zhì)量評價等方面(徐有明等，2002；肖興翠等，2015)，其樹脂道形成過程中的超微結(jié)構(gòu)變化已有報道(Guoetal.，2002)，但有關(guān)形成層不同生長時期細胞發(fā)育分生分化過程中的超微結(jié)構(gòu)變化及其管胞壁超微結(jié)構(gòu)未見報道。

透射電鏡技術(shù)是在納米水平上研究維管形成層原始細胞和成熟木材細胞壁超微結(jié)構(gòu)的良好工具(Hafrénetal.，2000；Singhetal.，2001；Frommetal.，2003)。本研究采用透射電鏡觀察濕地松整個年活動期內(nèi)形成層原始細胞的超微結(jié)構(gòu)變化，獲取更多關(guān)于形成層季節(jié)性活動與次生木質(zhì)部變化之間的信息，旨在豐富樹木生長發(fā)育生物學(xué)知識，為濕地松人工林培育、材性材質(zhì)改良和森林資源利用提供科學(xué)依據(jù)，也為其他樹種的分子生物學(xué)研究提供有價值的細胞學(xué)參考。

1 材料與方法

試驗材料取自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)校園濕地松人工林(113°41′—115°05′E，29°58′—31°22′N)。2016年3月—2017年3月，在濕地松人工林內(nèi)選取5株生長健康的濕地松作為樣株，其中3—8月每周采樣1次，9—11月毎半個月采樣1次，12月至次年2月每月采樣1次。采樣時，選取樣株樹冠中上部生長良好的2～3年生枝，截取其中部，切成若干0.5～1 cm小段，放入2.5%戊二醛固定液中，抽真空30 min后，置于4 ℃冰箱保存。

樣品用氫氟酸、酒精甘油、乙二胺等化學(xué)藥劑軟化，使用雙面刀片切成1 mm小塊，放入新鮮固定液中，再抽一次真空，常壓下固定2～3 h，用磷酸緩沖液沖洗4次，每次約30 min。洗滌后在由0.2 mol·L-1磷酸緩沖液配制的1%鋨酸溶液中4 ℃下固定過夜。用丙酮系列脫水，純丙酮脫水3次。按照丙酮與Spurr樹脂3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3滲透，再用純樹脂滲透，每次12 h。最后用樹脂包埋，置于70 ℃烘箱中聚合2天。修塊后用LKB-2188型超薄切片機切取連續(xù)超薄切片，100目銅網(wǎng)撈片，采用透射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 形成層細胞恢復(fù)活動期超微結(jié)構(gòu)變化

圖1為濕地松形成層原始細胞恢復(fù)活動期細胞橫切面超微結(jié)構(gòu)。濕地松形成層原始細胞一般在3月初恢復(fù)活動，形成層細胞與木質(zhì)部細胞具有明顯界限，細胞層數(shù)為2～3層，3月底細胞明顯液泡化，基本呈橢圓形，形成層紡錘形細胞弦向壁和徑向壁厚度無明顯差異，為0.46～0.66 μm(圖1A、B)。形成層細胞內(nèi)逐漸形成大液泡，油滴和淀粉顆粒含量明顯減少，淀粉顆粒出現(xiàn)電子透明區(qū)(圖1B)。含細胞器的細胞質(zhì)被大液泡擠到細胞邊緣地帶，可見明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象(圖1C、D)。在徑向壁，特別是與弦向壁相連的角隅處有部分自溶現(xiàn)象(圖1A、D)，成熟射線細胞中含有分散的小液泡，細胞質(zhì)濃度明顯減少，細胞內(nèi)含物較豐富(圖1E)。上一年形成的管胞壁角隅處也存在部分自溶現(xiàn)象(圖1F)。從生理發(fā)育角度考慮，自溶現(xiàn)象主要是形成層活動提供營養(yǎng)物質(zhì)的同時，未木質(zhì)化的細胞壁柔軟，細胞形狀易變化，細胞壁間更好接觸，增強木材內(nèi)接強度，適應(yīng)木材新細胞和木材形成的需要。

2.2 形成層細胞活動期超微結(jié)構(gòu)變化

圖2(4月18日)、圖3(5月11日)、圖4(6月22日)、圖5(9月23日)為濕地松形成層細胞活動期不同時間的細胞超微結(jié)構(gòu)。4月初形成層細胞進入活動期，整個形成層帶高度液泡化，徑向壁和弦向壁均變薄，且形狀很不規(guī)則，徑向壁和弦向壁厚度差異明顯，徑向壁厚度為040～0.71 μm，弦向壁厚度為0.20～0.42 μm(圖2A、B)。形成層細胞中出現(xiàn)許多大小不一的小泡，同時質(zhì)膜向內(nèi)折疊形成較大凹陷(圖2C)。與恢復(fù)活動期(圖1C、D、E)相比，在與木質(zhì)部細胞相鄰的木質(zhì)部射線細胞中，細胞質(zhì)濃度明顯降低，細胞內(nèi)含物減少，但油滴含量相比其他細胞仍然較高(圖2D)。5月中旬，在徑切面可觀察到發(fā)生徑向膨大的木質(zhì)部細胞，且開始出現(xiàn)次生壁加厚，2個正在分化的木質(zhì)部細胞間存在豐富的胞間連絲，細胞質(zhì)基本貼壁分布(圖3A、B)。6月中旬，形成層細胞活動達到旺盛期，此時形成層帶包括形成層原始細胞以及大量正在分裂的木質(zhì)部和韌皮部母細胞，細胞層數(shù)明顯增加，初生壁周圍有豐富的顆粒狀物質(zhì)沉積，正在進行次生壁加厚，韌皮部母細胞弦向壁明顯加厚，但整個形成層帶細胞的弦向壁和徑向壁仍很薄，且徑向壁比弦向壁厚，徑向壁厚度為1.29～2.00 μm，弦向壁厚度為0.11～0.40 μm(圖4A、B、D)。形成層細胞中深色的蛋白質(zhì)物質(zhì)、淀粉顆粒和油滴數(shù)量迅速減少。上一年形成的射線細胞中內(nèi)含物急劇減少，大量物質(zhì)被消耗(圖4C)。在徑切面可明顯觀察到形成層細胞徑向壁和弦向壁加厚，剛形成的細胞壁排列較疏松(圖4D)。形成層帶細胞層數(shù)增加的同時，未成熟木質(zhì)部細胞不斷發(fā)育，次生壁厚度也逐漸增加，細胞壁出現(xiàn)分層現(xiàn)象。到9月底，管胞壁的次生壁加厚基本完成，形成層細胞層數(shù)明顯減少，為2～3層，徑向壁和弦向壁明顯增厚，弦向壁厚度為0.29～0.44 μm，徑向壁厚度為0.71～1.89 μm(圖5A、B)。隨著木質(zhì)部細胞逐漸增加，管胞壁次生壁上S2、S3層不斷積累，層次結(jié)構(gòu)逐漸明顯(圖5A、B)。

圖1 濕地松形成層細胞恢復(fù)活動期(3月22日)細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.1 The ultrastructure of cambium cells during the reactivation period (March 22th) of P.elliottiiA—D為形成層帶細胞的橫切面，E—F為次生木質(zhì)部細胞的橫切面。A.形成層細胞的細胞質(zhì)濃度降低，形成層帶與木質(zhì)部之間界限明顯，細胞壁角隅處有自溶現(xiàn)象；B.淀粉顆粒出現(xiàn)電子透明區(qū)，直徑開始減小，內(nèi)含物減少；C.原生質(zhì)體凝縮，發(fā)生顯著的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，細胞質(zhì)呈條帶狀分布；D.徑向壁與弦向壁相連的角隅處有自溶現(xiàn)象(箭頭所示)，油滴直徑減小，內(nèi)含物分布不均勻；E.木質(zhì)部射線細胞中含豐富的內(nèi)含物和分散的小液泡；F.上一年形成的管胞分子胞間層間出現(xiàn)自溶現(xiàn)象。A—D:The cross-section of the cambium cells；E—F:The cross-section of the secondary xylem cells.A.The cytoplasmic concentration of the fusiform cells was reduced,the boundary between the cambium zone and the xylem was obvious,and there was autolysis at the corners of the cell wall.B.The starch particles appeared electron transparent zone and the diameter began to decrease,and its the content also decreased.C.The protoplasts condense and showing the significant plasmolysis,the cytoplasm was a strip distribution adherent cell wall.D.The autolysis occurred at the corner where the radial wall was connected to the tangential wall (arrow),the diameter of the oil droplets decreased and inclusions were distributed unevenly.E.Xylem ray cells contained abundant contents and scattered small vacuoles.F.The tracheid formed in the previous year occurred autolysis in the intercellular layers.

圖2 濕地松形成層細胞活動期(4月18日)細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.2 The ultrastructure of cambium cells during the active period (April 18th) of P.elliottiiA.整個形成層帶細胞均已高度液泡化，徑向壁和弦向壁明顯變薄，且形狀很不規(guī)則；B.細胞弦向壁更薄，徑向壁和弦向壁厚度差異明顯；C.靠近木質(zhì)部的形成層紡錘形細胞，細胞內(nèi)含物較豐富；D.上一年形成的射線細胞中含有大油滴，細胞核位于中部，淀粉顆粒出現(xiàn)電子透明區(qū)。A.The entire cambial cells had been highly vacuolated,the radial wall and tangential wall were significantly thinned,and the shape of cambial cells was very irregular.B.The tangential wall of the cambium cell was thinner,and the thickness of the radial wall and the tangential wall was obviously different.C.The cambium cells near the xylem was abundant in contents.D.The ray cells formed in the previous year contained large oil droplets,the nucleus was located in the middle and the starch granules showed the electron transparent zone.

圖3 濕地松形成層細胞活動期(5月11日)細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.3 The ultrastructure of cambium cells during the active period(May 11th) of P.elliottii A.緊鄰次生加厚木質(zhì)部細胞的形成層紡錘形細胞，箭頭所示為紋孔口；B.細胞壁上有豐富的胞間連絲，細胞質(zhì)貼壁分布，含有少量內(nèi)含物。A.The fusiform cells near the secondary thickened xylem cells,the arrow showed the pit aperture.B.The cell wall had abundant in plasmodesmata,with cytoplasm adhering to the wall and containing a small amount of inclusions.

圖4 濕地松形成層細胞活動期(6月22日)細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.4 The ultrastructure of cambium cells during the active period(June 22th) of P.elliottiiA.細胞高度液泡化，徑向壁與弦向壁厚度差異顯著，初生壁附近有豐富的顆粒狀物質(zhì)；B.靠近韌皮部的形成層細胞，弦向壁明顯變厚，但徑向壁仍比弦向壁厚；C.上一年形成的射線細胞中含少量內(nèi)含物，細胞核呈不規(guī)則狀；D.形成層細胞徑向壁明顯加厚。A.The fusiform cells were highly vacuolated,with significant differences between the radial wall and the tangential wall,and there were abundant granular materials near the primary wall.B.The cambium cells near the phloem cells,the tangential wall was thick,but the radial wall was still thicker than the tangential wall.C.The ray cells formed in the previous year contained a small amount of inclusions and the nucleus was irregular.D.The radial walls of cambium cells was obviously thickened.

圖5 濕地松形成層細胞活動期(9月23日)細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.5 The ultrastructure of cambium cells during the active period(September 23th) of P.elliottiiA.形成層細胞僅有2～3層，徑向壁和弦向壁差異顯著；B.靠近形成層的木質(zhì)部細胞已經(jīng)完成次生壁加厚過程發(fā)育為成熟細胞，具有明顯的層次結(jié)構(gòu)，形成層紡錘形細胞中含有很多顆粒狀物質(zhì)。A.There were only 2-3 layers of cambium cells,and the radial wall and the tangential wall was significantly different.B.The xylem cells near the cambium cells had completed the secondary wall thickening and developed into mature cells with the distinct layered structure.The fusiform cells contained many granular substances.

2.3 形成層細胞休眠期超微結(jié)構(gòu)變化

圖6(10月26日)、圖7(1月17日)為濕地松形成層細胞休眠期不同時間的細胞超微結(jié)構(gòu)。10月底至次年2月底，形成層細胞處于休眠期，形成層帶通常只包含1～2層細胞，形成層紡錘形細胞扁平且細胞質(zhì)較稠密，弦向壁和徑向壁均明顯比活動期增厚，且徑向壁比弦向壁厚，徑向壁厚度為1.18～2.01 μm，弦向壁厚度為0.18～0.36 μm(圖7A)。木射線細胞中，小液泡逐漸融合成大液泡，大液泡中含有深色的蛋白類物質(zhì)和大量油滴(圖6A、7B)。在相鄰的射線細胞水平壁上可觀察到豐富的胞間連絲，可能有利于物質(zhì)運輸(圖6B)。在進入休眠期前，靠近形成層的木質(zhì)部細胞次生壁沉積過程已經(jīng)結(jié)束，除了射線細胞外，其他類型細胞的細胞質(zhì)在休眠末期完全消失(圖6A、6B、7B)。在整個休眠期，沒有觀察到有絲分裂現(xiàn)象，也沒有新形成的細胞壁出現(xiàn)。

圖6 濕地松形成層細胞休眠期(10月26日)細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.6 The ultrastructure of cambium cells during the dormant period (October 26th) of P.elliottiiA.木質(zhì)部射線細胞中內(nèi)含物較多，小液泡融合為大液泡，大部分液泡被深色蛋白質(zhì)物質(zhì)所填充；B.射線細胞水平壁上有豐富的胞間連絲。A.The xylem ray cells contained more inclusions,small vacuoles fused into large vacuoles,most of the vacuoles were filled with dark protein material.B.There are abundant plasmodesmata on the horizontal wall of ray cells.

圖7 濕地松形成層細胞休眠期(1月17日)細胞超微結(jié)構(gòu)Fig.7 The ultrastructure of cambium cells during the dormant period (January 17th) of P.elliottiiA.形成層細胞僅有1～2層厚壁細胞，形成層細胞中含很多深色物質(zhì)，形成層細胞的弦向壁和徑向壁都較厚，徑向壁明顯比弦向壁厚；B.木質(zhì)部射線細胞中小液泡開始融合成大液泡，發(fā)生輕微的質(zhì)壁分離現(xiàn)象。A.The cambium zone consisted of only 1-2 layers of thick-walled cells and contained many dark substances.The tangential walls and radial walls of the cambial cells were thicker,and the thickness of the radial walls was significantly thicker than the tangential wall.B.In the xylem ray cells,small vacuoles began to fuse into large vacuoles,and showing slight plasmolysis.

3 討論

溫帶地區(qū)樹木形成層活動具有明顯周期性，但不同樹種之間差異較大(Oladietal.，2011)，同一樹種生長在不同環(huán)境條件下，其形成層活動周期也不完全相同。Rao等(2001)研究發(fā)現(xiàn)，印度不同林地印楝(Azadirachtaindica)樹維管形成層活動方式不同，其在灌木叢林中可全年處于活躍期。Singh等(2011)研究表明，印度亞熱帶雨林思茅松(Pinuskesiya)2月中旬新針出現(xiàn)后，就會重新激活休眠的形成層，12月底至次年1月底形成層活動停止。但Pumijumnong(2006)發(fā)現(xiàn)，泰國熱帶雨林思茅松3、4月處于休眠階段，5月雨季來臨時形成層開始活動直到10月，然后在干燥季節(jié)進入休眠。

在武漢，濕地松形成層細胞活動期從3月初一直持續(xù)到10月底，4月中旬進入活動期；而在原產(chǎn)地(美國佛羅里達)，濕地松生長季從2月底一直延續(xù)到12月(Harleyetal.，2012)，這可能與光照、溫度和降雨量有關(guān)，冬季日照縮短、低溫和少量降雨導(dǎo)致形成層細胞提早進入休眠期(Singhetal.，2011；Begumetal.，2012；2015；Carreretal.，2017)。濕地松在6月中旬左右達到活動旺盛期，形成層帶細胞層數(shù)明顯增加，形成層帶細胞包括形成層原始細胞以及大量正在分裂的木質(zhì)部和韌皮部母細胞，木質(zhì)部細胞開始進行初生壁加厚和次生壁沉積，進一步證明7月左右濕地松開始產(chǎn)生晚材的結(jié)論(Harleyetal.，2012)。濕地松形成層帶旺盛期可達到的最大細胞層數(shù)明顯少于闊葉樹種(Minetal.，2016；Liuetal.，2014；Chenetal.，2010)，進一步解釋了針葉樹年生長緩慢的原因。10月底至次年2月濕地松處于休眠期，通常只包含1～2層形成層帶細胞，細胞形狀扁平，細胞弦向壁和徑向壁均明顯比活動期增厚，且徑向壁和弦向壁厚度差異更加顯著，細胞內(nèi)含物少量增加。形成層帶細胞經(jīng)歷一段時間休眠，也正好可以解釋其明顯的年輪界限。

濕地松形成層細胞恢復(fù)活動期，徑向壁特別是與弦向壁連接的角隅處出現(xiàn)部分自溶現(xiàn)象，該現(xiàn)象可能在一定程度上破壞了細胞壁結(jié)構(gòu)，提高了細胞壁的彈性和可塑性，有利于活動期形成層細胞的徑向生長(Event，2006)。Wu等(2016)發(fā)現(xiàn)，杉木在休眠期，形成層徑向壁比弦向壁含有更多果膠和少量木質(zhì)素，果膠積累促進了細胞壁的擴張和形成層的活化。濕地松形成層活動期時，細胞形狀變得不規(guī)則，整個形成層帶細胞高度液泡化，淀粉顆粒出現(xiàn)電子透明區(qū)，油滴直徑減小。紡錘形細胞壁尤其是徑向壁變薄是形成層恢復(fù)活動的開始，且整個活動期和休眠期內(nèi)，形成層細胞徑向壁明顯比弦向壁厚。這些超微結(jié)構(gòu)特征均與溫帶地區(qū)其他闊葉樹種類似，如柚木(Tectonagrandis)(Raoetal.，2010)、山毛櫸(Fagussylvatica)(Prislanetal.，2011)、毛白楊(Populustomentosa)(Yinetal.，2002；Chenetal.，2010；Arendetal.，2003)等；唯一不同的是，濕地松形成層在恢復(fù)活動期徑向壁和弦向壁厚度差異不是很明顯。無論是紡錘形細胞還是射線細胞，均可觀察到豐富的胞間連絲，可能有利于細胞間的物質(zhì)運輸和細胞壁的建成。根據(jù)細胞超微結(jié)構(gòu)變化，比以往主要通過光學(xué)顯微鏡(Harleyetal.，2012)能更清楚、更準確地觀察到形成層休眠期向活動期轉(zhuǎn)變的分化特點以及整個活動期內(nèi)形成層細胞的分裂分化。

濕地松在整個生長季均會出現(xiàn)松針脫落現(xiàn)象，休眠期間也有新的松針產(chǎn)生，表明松針的產(chǎn)生和脫落與形成層細胞的休眠和激活無明顯關(guān)聯(lián)。研究還發(fā)現(xiàn)濕地松次生木質(zhì)部中成熟的射線細胞一直含有較多內(nèi)含物，其原生質(zhì)體沒有出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，說明次生木質(zhì)部中的射線薄壁細胞多年內(nèi)仍保持較高生理活性，以備于形成層細胞受傷后射線薄壁細胞轉(zhuǎn)化為形成層細胞進行新的分裂分生活動。

4 結(jié)論

1) 濕地松形成層細胞層數(shù)基本為1～2層，其年活動期內(nèi)具有明顯的休眠期和活動期變化。2月底至3月底為形成層細胞恢復(fù)活動期，徑向壁變薄是形成層恢復(fù)活動的主要特征。部分自溶現(xiàn)象發(fā)生在形成層細胞徑向壁，尤其在細胞壁連接處。打破休眠期的標志是形成層紡錘形細胞的出現(xiàn)，紡錘形細胞徑向壁和弦向壁厚度差異不顯著，呈橢圓形或近圓形。形成層紡錘形細胞出現(xiàn)少許質(zhì)壁分離現(xiàn)象，淀粉顆粒出現(xiàn)明顯電子透明區(qū)。3月底細胞明顯液泡化，基本呈橢圓形，形成層紡錘形細胞弦向壁和徑向壁厚度無明顯差異。

2) 4月初至10月底為濕地松形成層細胞活動期，是濕地松木材形成的主要階段?；顒悠趦?nèi)，整個形成層帶細胞高度液泡化，細胞形狀變得不規(guī)則，徑向壁和弦向壁均變薄，弦向壁更薄且變得不明顯，油滴和淀粉顆粒急劇減少。

3) 6月中旬為濕地松形成層細胞活動旺盛期。旺盛期形成層帶細胞層數(shù)明顯增加，次生壁開始加厚，原生質(zhì)體基本瓦解并消失。

4) 10月底至次年2月底為濕地松形成層細胞休眠期。休眠期開始后，形成層帶細胞層數(shù)明顯減少，只含有1～2層扁平的厚壁紡錘形細胞，其徑向壁和弦向壁明顯增厚，細胞內(nèi)含物開始積累。整個活動期內(nèi)形成層細胞徑向壁明顯比弦向壁厚，休眠期這種差異更明顯。