方 晨，韋祥相，張 釗，李賢梅，張小雪

( 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 水產(chǎn)系，貴州 貴陽 550025 )

玻璃化凍存對斑馬魚卵母細(xì)胞的影響

方 晨，韋祥相，張 釗，李賢梅，張小雪

( 貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院 水產(chǎn)系，貴州 貴陽 550025 )

采用比色法測定了在不同玻璃化凍存液中凍存1、2、4、8 d時斑馬魚卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶的活性，以研究玻璃化凍存對卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量和線粒體三磷酸腺苷酶活性的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示，V4組斑馬魚(玻璃化液組分是：1.5 mol/L甲醇、6.0 mol/L乙二醇、0.25 mol/L蔗糖)卵母細(xì)胞凍存1、2、4、8 d后存活率最高[分別為(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%]，顯著高于其他組。經(jīng)玻璃化凍存后，斑馬魚卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量和線粒體三磷酸腺苷酶活性均隨凍存天數(shù)的增加而顯著下降(P<0.05)。V4組的谷胱甘肽含量[(13.37±0.59) mg/g]和線粒體三磷酸腺苷酶活性較高，線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶[(3.823±0.144) U/mg]、Mg2+-三磷酸腺苷酶[(4.503±0.144) U/mg]和Na+/K+-三磷酸腺苷酶[(7.520±0.198) U/mg]活性最高。各組細(xì)胞的活性隨著凍存天數(shù)的增加而逐漸下降。試驗(yàn)結(jié)果表明，玻璃化凍存不能完全避免低溫和冷凍保護(hù)劑的毒性和對卵母細(xì)胞的損傷。

斑馬魚；卵母細(xì)胞；玻璃化凍存；谷胱甘肽；線粒體三磷酸腺苷酶

斑馬魚(Daniorerio)原產(chǎn)于印度東部、巴基斯坦、緬甸以及孟加拉國的小溪、稻田及恒河中游地區(qū)，是一種常見的熱帶觀賞魚[1]。斑馬魚為重要的脊椎動物模式系統(tǒng)之一, 具有養(yǎng)殖水體小、成本低、繁殖周期短、產(chǎn)卵量大、品系資源豐富等特點(diǎn)及其他模式脊椎動物所不具備的胚胎體外受精、體外發(fā)育、胚體透明等優(yōu)勢，已成為生命科學(xué)研究的新寵[2]。目前已對斑馬魚的胚胎發(fā)育、毒理、營養(yǎng)、生長、細(xì)胞分子等進(jìn)行了廣泛研究[3-9]，但尚未見到有關(guān)玻璃化冷凍對斑馬魚卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量和三磷酸腺苷酶活性的研究。

玻璃化凍存技術(shù)是近年來發(fā)展的一項(xiàng)新興技術(shù)，是超低溫保存技術(shù)中保存效果較好的一種方法。對卵母細(xì)胞進(jìn)行玻璃化凍存可以建立雌性動物的基因庫，保存物種的遺傳多樣性、優(yōu)良品種及瀕危動物的種質(zhì)資源，為現(xiàn)代育種技術(shù)的發(fā)展提供技術(shù)支持；可以在任意時間內(nèi)將冷凍的卵母細(xì)胞復(fù)蘇，突破時間和空間的限制，解決魚類的雌雄成熟不同步和遠(yuǎn)緣雜交等問題，對遺傳育種具有重要意義，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來新曙光[10-11]。

本研究檢測了玻璃化凍存后斑馬魚卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量和線粒體三磷酸腺苷酶活性的變化， 探討玻璃化凍存對卵母細(xì)胞存活率和酶活性的影響規(guī)律，分析了玻璃化凍存對卵母細(xì)胞造成的損傷及抗氧化能力的變化，以期為魚類卵母細(xì)胞的冷凍保存及損傷機(jī)理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

谷胱甘肽試劑盒與線粒體三磷酸腺苷酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，膠原酶Ⅱ型(索萊寶公司，北京)，臺盼藍(lán)(鼎國昌盛公司，北京)，青鏈酶素(索萊寶公司，北京)，DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司，美國)，蔗糖(索萊寶公司，北京)，甲醇(國藥公司，上海)，乙二醇(國藥公司，上海)等。

1.2 主要儀器

解剖鏡(Olympus，SZ61型)，顯微鏡(Olympus，CH20型)，超凈工作臺(蘇州凈化，SW-CJ-ID型)，10 L液氮容器(成都，LSD-10)等。

1.3 主要溶液配制

膠原酶消化溶液：準(zhǔn)確稱量0.015 g膠原酶溶入1 mL DMEM培養(yǎng)液中配成15%的母液，保存在-20 ℃冰箱中備用。試驗(yàn)時將母液稀釋50倍，配成0.3%的膠原酶溶液用于分解組織。

臺盼藍(lán)溶液：準(zhǔn)確稱量0.4 g臺盼藍(lán)，溶于10 mL 0.85%生理鹽水中配成4%母液，保存在4 ℃冰箱中備用。試驗(yàn)時用生理鹽水把母液稀釋10倍，配成0.4%臺盼藍(lán)溶液，用于細(xì)胞染色檢測細(xì)胞的存活率。

玻璃化冷凍液：參考Godoy等[12]試驗(yàn)，設(shè)計(jì)9種不同的玻璃化液配方，根據(jù)乙二醇的濃度分成3個大組，9個小組(表1)。

表1 玻璃化液配方 mol/L

注：A組：V1～V3，5.0 mol/L乙二醇；B組：V4～V6，6.0 mol/L乙二醇；C組：V7～V9，7.0 mol/L乙二醇.

1.4 樣品制備

挑選發(fā)育成熟(腹腔飽滿)的斑馬魚約150尾, 體質(zhì)量(1.25±0.18) g，解剖取出兩側(cè)的卵巢，卵巢質(zhì)量(0.26±0.04) g。

卵巢稱量質(zhì)量后放入青鏈霉素(100 U/mL)中涮洗1～2次，取出后放在載玻片上，用解剖刀切割成大小相同的小段(每小段30～50個卵母細(xì)胞)，然后放入膠原酶溶液中在20 ℃下酶解約20 min(酶解的時間以卵母細(xì)胞分解程度為判斷標(biāo)準(zhǔn))，用生理鹽水涮洗卵母細(xì)胞3～4次，除去剩余的膠原酶，置0.85%生理鹽水中室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 卵母細(xì)胞的冷凍與復(fù)蘇

將酶解后的卵母細(xì)胞放入0 ℃中，采用三步平衡法進(jìn)行預(yù)平衡。具體操作為：取卵母細(xì)胞依次置于濃度為1/4倍、1/2倍和1倍的玻璃化液(原玻璃化液)中各平衡10 min，取出卵母細(xì)胞和相應(yīng)的玻璃化液一起裝到200 μL冷凍管中。將冷凍管直接放入液氮中，凍存時間分別為1、2、4 d和8 d。

將冷凍管從液氮中取出后直接放入37 ℃溫水中，迅速振蕩搖動使玻璃化液融化。融化后將卵母細(xì)胞快速轉(zhuǎn)移到離心管中，加入0.5 mol/L的蔗糖溶液，搖勻，洗脫10 min，去上清液，再加入0.25 mol/L的蔗糖溶液，搖勻，洗脫10 min，去上清液。最后將卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到生理鹽水中，搖勻，洗脫，去上清液，重復(fù)2次后加入生理鹽水搖勻備用。

1.6 卵母細(xì)胞存活率檢測

取出約30個卵母細(xì)胞，加入臺盼藍(lán)溶液常溫下染色5 min，解剖鏡和顯微鏡觀察、拍照，計(jì)算細(xì)胞的存活率。

細(xì)胞的存活率=未染色的卵母細(xì)胞/卵母細(xì)胞總數(shù)×100%

1.7 線粒體三磷酸腺苷酶活性與谷胱甘肽含量的檢測

采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒測定卵母細(xì)胞中的線粒體三磷酸腺苷酶活性和卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量，包括線粒體中Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶等3種三磷酸腺苷酶的活性，以每小時每毫克蛋白分解三磷酸腺苷產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為1個三磷酸腺苷酶活性單位(U)。每毫克蛋白質(zhì)每分鐘扣除非酶促反應(yīng)的作用，使反應(yīng)體系中谷胱甘肽濃度下降1 μmol/L為1個酶活性單位(U)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用Excel和SPSS 17.0進(jìn)行分析，采用單因素方差分析比較多組樣本的均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 玻璃化凍存后卵母細(xì)胞的存活率

玻璃化凍存后各組(V1～V9組)卵母細(xì)胞的存活率都隨冷凍天數(shù)的增加而顯著下降，V1～V8各組卵母細(xì)胞的存活率在凍存1、2、4 d和8 d后明顯下降，差異顯著(P<0.05)，而V9組卵母細(xì)胞凍存4 d后存活率下降不顯著(P>0.05)。冷凍1～8 d后，V4組卵母細(xì)胞存活率最高，顯著高于其他組(P<0.05)，凍存1、2、4 d和8 d后分別為(48.89±2.58)%、(39.35±1.34)%、(24.18±2.32)%和(14.56±1.64)%(圖1)。

2.2 玻璃化凍存后卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體三磷酸腺苷酶的活性

隨著冷凍天數(shù)的增加，各試驗(yàn)組卵母細(xì)胞的線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶的活性顯著下降(圖2)。V1～V7組在凍存1、2、4 d和8 d后線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶活性下降明顯，差異顯著(P<0.05)。V8組和V9組卵母細(xì)胞的線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶活性在1、2 d和4 d顯著減少，差異顯著(P<0.05)；4～8 d，線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。比較發(fā)現(xiàn)，V4組卵母細(xì)胞線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶在玻璃化凍存1、2 d和4 d后顯著高于其他組(P<0.05)，其酶活性在凍存1、2、4 d和8 d后分別為(3.823±0.144) U/mg、(3.492±0.084) U/mg、(2.554±0.097) U/mg和(1.930±0.076) U/mg。

圖1 不同的玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細(xì)胞的存活率注：相同字母的平均值間差異不顯著(P>0.05)，不同字母的平均值間差異顯著(P<0.05)，下同.

圖2 不同的玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細(xì)胞線粒體Ca2+-三磷酸腺苷酶的活性

隨著冷凍天數(shù)的逐漸增加，各試驗(yàn)組卵母細(xì)胞的線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶的活性下降(圖3)。V1、V3、V4、V5、V6和V8組在1、2、4 d和8 d后線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性顯著下降，差異顯著(P<0.05)。V2、V7和V9組在1 d、2 d和4 d后線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性顯著減少，差異顯著(P<0.05)；4～8 d，線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。比較表明，V4組卵母細(xì)胞的線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶活性在凍存1、2、4 d和8 d后顯著高于其他組(P<0.05)，其酶活力在凍存1、2、4 d和8 d分別為(4.503±0.144) U/mg、(4.134±0.182) U/mg、(2.972±0.096) U/mg和(2.113±0.073) U/mg。

隨著凍存天數(shù)的增加，各試驗(yàn)組卵母細(xì)胞的線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶的活性顯著下降(圖4)。V1～V7組在1、2、4 d和8 d后，線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性顯著下降，差異顯著(P<0.05)。V8和V9組在1～2 d和2～4 d，線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性顯著減少(P<0.05)；4～8 d，線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性變化不大，差異不顯著(P>0.05)。V4組的線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶活性在凍存1、2、4 d和8 d后顯著高于其他組，其酶活力在1、2、4 d和8 d分別為(7.520±0.198)、(5.828±0.184)、(3.204±0.197) U/mg和(2.031±0.176) U/mg。

2.3 玻璃化凍存后卵母細(xì)胞谷胱甘肽的含量

隨著冷凍天數(shù)的增加，各試驗(yàn)組斑馬魚卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量顯著減少(圖5)。V1、V4、V5、V6和V7組卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量在凍存1、2、4 d和8 d后顯著減少(P<0.05)。V2、V3、V8、V9組在凍存1、2 d和4 d后的谷胱甘肽含量下降幅度大，差異顯著(P<0.05)，但在4 d后谷胱甘肽含量變化不大，無顯著性差異(P>0.05)。雖然冷凍1 d后卵母細(xì)胞中V5組的谷胱甘肽含量比V4組要高一些，但差異不顯著(P>0.05)，而V4組卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量在2、4 d和8 d均都高于V5組，且差異顯著(P<0.05)。綜合來看，V4組凍存后卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量最高，顯著高于其他組(P<0.05)，在經(jīng)過1、2、4 d和8 d凍存后，谷胱甘肽含量分別為(13.37±0.59)、(10.57±0.73)、(6.25±0.89) mg/g和(4.16±0.57) mg/g。

圖3 不同玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細(xì)胞線粒體Mg2+-三磷酸腺苷酶的活性

圖4 不同的玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細(xì)胞線粒體Na+/K+-三磷酸腺苷酶的活性

圖5 不同玻璃化液凍存下斑馬魚卵母細(xì)胞谷胱甘肽的含量

3 討 論

3.1 玻璃化凍存對魚卵母細(xì)胞線粒體三磷酸腺苷酶活性的影響

Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶均屬三磷酸腺苷酶，對維持細(xì)胞的生理功能起重要作用[13]。關(guān)于低溫凍存對三磷酸腺苷酶活性影響的研究大多集中于冷凍保存的精子；凍存后三磷酸腺苷酶活性大多顯著下降[14-17]。三磷酸腺苷酶作為廣泛分布于有機(jī)體中一種極為重要的膜蛋白酶，在卵母細(xì)胞凍存后的變化研究不多。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，卵母細(xì)胞凍存后，Ca2+-三磷酸腺苷酶、Mg2+-三磷酸腺苷酶和Na+/K+-三磷酸腺苷酶的變化規(guī)律相似，活性均顯著下降；卵母細(xì)胞中谷胱甘肽含量也顯著下降，說明清除氧自由基的能力減弱，線粒體產(chǎn)生的大量氧自由基又作用于線粒體膜，引起膜脂質(zhì)氧化損傷，甚至?xí)鸺?xì)胞壞死、自溶，影響了三磷酸腺苷酶活性，導(dǎo)致其活性下降。也有可能在降溫與復(fù)溫過程中，部分損傷了線粒體，使線粒體三磷酸腺苷酶的分布發(fā)生改變，甚至引起酶的活力降低或失活；也有可能是冷凍保護(hù)劑的毒性破壞了線粒體的結(jié)構(gòu)，引起酶復(fù)合蛋白體解聚，引起酶系結(jié)構(gòu)和功能的變化，降低了線粒體三磷酸腺苷酶活性。

3.2 玻璃化凍存對魚卵母細(xì)胞谷胱甘肽含量的影響

[1] 孫智慧, 賈順姬, 孟安明. 斑馬魚:在生命科學(xué)中暢游[J]. 生命科學(xué), 2006, 18(5):431-436.

[2] 賈順姬, 孟安明. 中國斑馬魚研究發(fā)展歷程及現(xiàn)狀[J]. 遺傳, 2012, 34(9):1082-1088.

[3] 郭恩棉. 斑馬魚卵巢發(fā)育的組織學(xué)研究[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2009, 26(3):229-232.

[4] 王晶, 王冰, 李紀(jì)同,等. 斑馬魚性腺發(fā)育的組織學(xué)觀察[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2011, 30(2):168-174.

[5] 王佳佳, 徐超, 屠云杰,等. 斑馬魚及其胚胎在毒理學(xué)中的實(shí)驗(yàn)研究與應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2007, 2(2):123-135.

[6] 陳微, 章琳俐, 楊平,等. 斑馬魚端腦的微細(xì)形態(tài)與結(jié)構(gòu)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2015,39(3):371-380.

[7] 侍建濤, 桂建芳, 周莉,等. 斑馬魚-cDNA克隆與表達(dá)分析[J]. 水生生物學(xué)報, 2015, 39(3):459-467.

[8] 楊少斌, 馮婧文, 趙文鋮,等. 斑馬魚TATA結(jié)合蛋白的生物信息學(xué)分析[J]. 生命科學(xué)研究, 2015(2):119-123.

[9] 端正花, 陳曉歐, 劉靈麗,等. 苯并三唑和鎘對斑馬魚肝臟的聯(lián)合毒性效應(yīng)[J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2015, 35(6):1872-1876.

[10] 章海敏, 姜紅強(qiáng), 虞效益. 魚類卵母細(xì)胞玻璃化凍存的研究進(jìn)展及前景展望[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技, 2016(6):240-242.

[11] 陳松林. 魚類配子和胚胎冷凍保存研究進(jìn)展及前景展望[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2002, 26(2):161-168.

[12] Godoy L C,Streit D P, Zampolla T, et al. A study on the vitrification of stage Ⅲ zebrafish (Daniorerio) ovarian follicles [J].Cryobiology, 2013, 67(3):347-354.

[13] 齊靜, 侯紅平, 張廣平,等. 黃藥子水提物對小鼠肝毒性及其線粒體ATP酶和超氧化物歧化酶的抗氧化機(jī)制[J]. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志, 2016, 30(8): 802-807.

[14] 閆秀明, 張小雪. 超低溫冷凍對黃鱔精子中幾種酶活性的影響[J]. 水生生物學(xué)報, 2011, 35(5):882-886.

[15] 陳亞敏. 鞍帶石斑魚精子低溫保存研究[D]. 湛江：廣東海洋大學(xué),2013.

[16] 浦蘊(yùn)惠, 許星鴻, 高煥,等. 超低溫冷凍對脊尾白蝦精子幾種酶活性的影響[J]. 水產(chǎn)學(xué)報, 2013, 37(1):101-108.

[17] 黃曉榮, 章龍珍, 莊平,等. 超低溫冷凍對日本鰻鱺精子酶活性的影響[J]. 海洋漁業(yè), 2008, 30(4):297-302.

[18] 張繪芳. 還原型谷胱甘肽的作用機(jī)制及臨床應(yīng)用[J]. 醫(yī)學(xué)信息, 2015, 3(31):385-390.

[19] 樊躍平, 于健春, 余躍,等. 谷胱甘肽的生理意義及其各種測定方法比較、評價[J]. 中華臨床營養(yǎng)雜志, 2003, 11(2):136-139.

[20] 黃曉榮, 章龍珍, 莊平,等. 超低溫保存對羅氏沼蝦胚胎幾種酶活性的影響[J]. 海洋漁業(yè), 2010, 32(2):166-171.

EffectsofVitrifiedCryopreservationonGSHContentandMitochondrialATPaseActivityinOocytesofZebrafishDaniorerio

FANG Chen, WEI Xiangxiang, ZHANG Zhao, LI Xianmei, ZHANG Xiaoxue

( Animal Science College, Guizhou University, Guiyang 550025, China )

The effects of vitrified cryopreservation on glutathione(GSH) content and mitochondrial ATPase activity in oocytes were investigated in zebrafish(Daniorerio) cryopreservated in different vitrification solutions for 1 d, 2 d, 4 d and 8 d by a chromatometry method. The results showed that the maximal survival rate was observed in the oocytes cryopreservated in group V4 in which the vitrification solution was consisted of 1.5 mol/L methanol, 6.0 mol/L ethylene glycol and 0.25 mol/L sucrose, with survival rate of (48.89±2.58)% in 1 d, (39.35±1.34)% in 2 d, (24.18±2.32)% in 4 d, and (14.56±1.64)% in 8 d, significantly higher than in other groups (P<0.05). The GSH contents and the activities of mitochondrial ATPase in zebrafish oocytes were found to be significantly decreased with increase in elapse of vitrified cryopreservation (P<0.05), with the maximal GSH contents and activities of mitochondrial ATPase in group V4, including Ca2+-ATPase of(3.823±0.144) U/mg, Mg2+-ATPase of (4.503±0.144) U/mg and Na+/K+-ATPase of(7.520±0.198) U/mg. The oocytes exposed to the vitrification solutions showed lower cytoactive as the increase in vitrification time, indicating that vitrification did not completely avoid the damages to zebrafish oocytes caused by the low temperature and the toxicity of cryoprotectants.

Daniorerio; oocyte; vitrification cryopreservation; glutathione; mitochondrial ATPase

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.06.014

S965.8

A

1003-1111(2017)06-0773-05

2016-12-06；

2017-03-27.

貴州省優(yōu)秀科技教育人才省長專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目[黔省專合字(2009)102號].

方晨(1992—)，男，碩士研究生；研究方向：水產(chǎn)動物繁殖與發(fā)育.E-mail：1727105435@qq.com.通訊作者：張小雪(1962—)，女，教授；研究方向：水產(chǎn)動物繁殖與發(fā)育.E-mail：zhangxx508@163.com.