張巖巖 周永妍 王文鵬

【摘 要】 目的：建立丹綠補(bǔ)腎膠囊質(zhì)量控制方法。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)丹綠補(bǔ)腎膠囊中白花丹、綠包藤、射干及胡椒藥材進(jìn)行定性鑒別;采用高效液相色譜法（HPLC），以次野鳶尾黃素作為指標(biāo)成分進(jìn)行定量測定。結(jié)果：薄層色譜法能清晰地鑒別丹綠補(bǔ)腎膠囊中的白花丹、綠包藤、射干及胡椒，陰性無干擾，專屬性強(qiáng);次野鳶尾黃素在1.097～32.91μg/mL（r2=0.9999）質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系;平均回收率（n=9）為100.6%，RSD為1.28%。結(jié)論：所建立的方法準(zhǔn)確、可靠、專屬性強(qiáng)， 可作為丹綠補(bǔ)腎膠囊的質(zhì)量控制方法。

【關(guān)鍵詞】 丹綠補(bǔ)腎膠囊;質(zhì)量控制;薄層色譜;高效液相色譜;次野鳶尾黃素

【中圖分類號(hào)】R284 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2019）1-0023-04

Abstract：Objective? To establish the method of quality control of Danlv Bushen Capsules. Methods Plumbago zeylanica L.，Tinospora crispa （Linn.） Hook. f.& Thoms.， Belamcanda chinensis （L.） DC， Piper nigrum L.in Danlv Bushen Capsules. were identified by TLC，and Irisflorentin as index components was determined by HPLC.Results Danlv Bushen Capsules could be detected by TLC， The linearity ranges obtained from the calibration curves of Irisflorentin was 1.097～32.91μg/mL （r2=0.9999）. The average recoveries of Irisflorentin was 100.6% （n=9） and RSD was 1.28%. Conclusion? This method is simple， accurate， selective and highly reproducible. It can be used for the quality control of Danlv Bushen Capsules.

Keywords： Danlv Bushen Capsules;Quality Control; TLC;HPLC; Irisflorentin

丹綠補(bǔ)腎膠囊是由白花丹、綠包藤、射干、胡椒和干姜五味藥組成的（傣藥）復(fù)方制劑，主要功效為補(bǔ)腎滋陰壯陽。用于陰陽兩虛所致陽痿遺精、腰膝酸軟和身體乏力[1]?，F(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)為國家食品藥品監(jiān)督管理局局頒藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10436（ZD-0436[BF]）-[BFQ]2002-2012Z，其中鑒別項(xiàng)下包括白花丹、綠包藤、胡椒的薄層鑒別;含量項(xiàng)下包括胡椒堿含量測定。本次研究重新建立了丹綠補(bǔ)腎膠囊的薄層鑒別方法，增加射干薄層鑒別[2-6]，修訂了白花丹、綠包藤及胡椒薄層鑒別方法。且以上4個(gè)藥材的薄層鑒別采用同一供試品溶液即可完成;同時(shí)采用高效液相色譜法，增加次野鳶尾黃素的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所用方法操作簡便、專屬性好、靈敏度高、快捷準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制，并且可完善和提高丹綠補(bǔ)腎膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 KH3200E型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）;CPA225D型電子分析天平（德國賽多利斯）;HH-2型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）;TDL-60B型臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;國產(chǎn)薄層預(yù)制G板（青島海洋化工廠分廠）;國產(chǎn)薄層預(yù)制GF254板（青島海洋化工廠分廠）;瑞士CAMAG REPROSTAR 3薄層色譜數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng);安捷倫1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）。

1.2 試藥 次野鳶尾黃素對(duì)照品（批號(hào)：111557-200602）、胡椒堿對(duì)照品（批號(hào)：110775-201405，純度98.9 %）、白花丹對(duì)照藥材（批號(hào)：121370-200401）、綠包藤對(duì)照藥材（批號(hào)：121371-200401）、射干對(duì)照藥材（批號(hào)：120994-201206）均購自中國食品藥品檢定研究院;丹綠補(bǔ)腎膠囊（批號(hào)：17041761、17041861、1704196，1云南神威施普瑞藥業(yè)有限公司）;各陰性對(duì)照樣品根據(jù)處方及制法自制，所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 白花丹的薄層色譜鑒別 取本品內(nèi)容物1g，加甲醇5mL，超聲提取30min，過濾，濾液作為供試品溶液。另取白花丹對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部? 通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（30～60℃）-三氯甲烷-甲醇（8∶4∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，105℃加熱2min，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。白花丹陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性。如圖1所示?！?/p>

2.1.2 綠包藤的薄層色譜鑒別 取綠包藤對(duì)照藥材1g，加甲醇5mL，超聲處理30min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部? 通則0502）試驗(yàn)，吸取鑒別（1）項(xiàng)下的供試品溶液5μL、上述對(duì)照藥材溶液10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶5∶1.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%磷鉬酸乙醇溶液，在100℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。綠包藤陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性。如圖2所示。

2.1.3 射干的薄層色譜鑒別 取射干對(duì)照藥材1g，加甲醇5mL，超聲處理30min，濾過，濾液作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部? 通則0502）試驗(yàn)，吸取鑒別（1）項(xiàng)下的供試品溶液及上述對(duì)照藥材溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以三氯甲烷-丁酮-甲醇（3∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。射干陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性。如圖3所示。

2.1.4 胡椒的薄層色譜鑒別 取胡椒堿對(duì)照品，加甲醇制成每1mL含4mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2015年版四部? 通則0502）試驗(yàn)，吸取鑒別（1）項(xiàng)下的供試品溶液及上述對(duì)照藥材溶液各2μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（10∶3∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。胡椒陰性對(duì)照無干擾，方法具專屬性。如圖4所示。

2.1.5 方法驗(yàn)證 上述薄層鑒別均分別采用3 種來源不同的色譜板，分別在低溫（約7 ℃）、常溫（20～25℃）、高溫（30～35℃）、低濕度（相對(duì)濕度30 %）、高濕度（相對(duì)濕度75 %）進(jìn)行考察，結(jié)果均獲得良好色譜分離效果。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX Eclipse plus C18 （5μm，250mm×4.6mm）;流動(dòng)相：乙腈-0.2%磷酸（41∶59）;檢測波長：266nm;流速1mL/min;柱溫為40℃;進(jìn)樣量10μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取次野鳶尾黃素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL含次野鳶尾黃素10μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取丹綠補(bǔ)腎膠囊內(nèi)容物0.35g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇25mL，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率50kHz）20min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.4 陰性對(duì)照溶液制備 按處方比例分別制備不含射干藥材的樣品，依照“2.2.3”項(xiàng)下方法制成陰性樣品溶液。

2.2.5 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10μL，按上述色譜條件進(jìn)樣測定，結(jié)果表明陰性樣品在與供試品中次野鳶尾黃素相同的保留時(shí)間處無干擾峰。如圖5所示。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液1、2、5、10、20、30μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測定。以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得次野鳶尾黃素的回歸方程及相關(guān)系數(shù)為y=4257.1x+5.9621，r2=0.9999（n=6）。結(jié)果表明次野鳶尾黃素在1.097～32.91μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。如圖6所示。

2.2.7 精密度試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)17041761）的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次進(jìn)樣10μL，按峰面積計(jì)算：次野鳶尾黃素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.2%。結(jié)果表明精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（批號(hào)17041761）的供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24h進(jìn)樣10μL進(jìn)行測定，按峰面積計(jì)算：次野鳶尾黃素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.6%。結(jié)果表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)17041761），取0.175g、0.35g、0.525g各3份，精密稱定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定。按含量計(jì)算：次野鳶尾黃素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為0.8%。結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱定已知含量的丹綠補(bǔ)腎膠囊（批號(hào)：17041761）內(nèi)容物9份，每份0.175g，分成3組，每組分別精密加入相當(dāng)于樣品中所含次野鳶尾黃素量的50%、100%、150%的對(duì)照品貯備液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.2.11 樣品含量測定 取3批樣品，每批平行取樣2份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中次野鳶尾黃素的含量。結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 薄層鑒別方法的優(yōu)化 射干藥材的薄層鑒別方法研究過程中參考《中國藥典》2015年版“射干”藥材[6]項(xiàng)下薄層鑒別方法，并對(duì)此方法進(jìn)行了優(yōu)化，將聚酰胺薄膜更換為硅膠GF254薄層板，刪除“噴以三氯化鋁試液”步驟，將365nm下檢視改為254nm下檢視，使此方法更加簡便，易于操作。

原標(biāo)準(zhǔn)中[1]白花丹、綠包藤、胡椒的薄層鑒別分別為3個(gè)供試品溶液，且處理步驟復(fù)雜，處理時(shí)間較長，使用有機(jī)溶劑種類及數(shù)量較多。通過實(shí)驗(yàn)摸索發(fā)現(xiàn)，以上3味藥材薄層色譜供試品溶液可與射干鑒別采用同一溶液，經(jīng)驗(yàn)證，4個(gè)鑒別方法陰性均無干擾，方法耐用性好。本方法易于普及掌握，有效提高了檢測效率，降低了檢測成本，減少了環(huán)境污染。

3.2 含量測定方法選擇

3.2.1 提取溶劑的選擇 取同一批樣品（批號(hào)：17041761）適量，分別采用75%甲醇、甲醇、75%乙醇及乙醇為提取溶劑，同時(shí)超聲提取20min進(jìn)行考察，結(jié)果表明甲醇提取含量最高，故選擇甲醇為提取溶劑。

3.2.2 提取方式的選擇 取同一批樣品（批號(hào)：17041761）適量，以甲醇為提取溶劑，分別采用超聲、回流兩種方式進(jìn)行提取，結(jié)果表明兩種方式含量基本一致，考慮到操作方便，因此選擇超聲提取。

3.2.3 提取時(shí)間的選擇 取同一供試品（批號(hào)：17041761）4份，以甲醇為提取溶劑，分別超聲10、20、30、40min，按擬定色譜條件測定，結(jié)果表明超聲20min之后含量基本相同，故選擇超聲20min為提取時(shí)間。

3.2.4 波長的選擇 取一定濃度的對(duì)照品溶液，于190～400nm下掃描，結(jié)果顯示次野鳶尾黃素在266nm處有最大吸收，因此選擇266nm作為檢測波長。

3.2.5 色譜條件的選擇 研究參考文獻(xiàn)方法[7-10]，分別考察了甲醇-水系統(tǒng)及乙腈-水系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)效果較好;又分別考察乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水和乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)，通過比較發(fā)現(xiàn)，乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)效果較好，故本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈-0.2%磷酸水系統(tǒng)。同時(shí)對(duì)色譜柱（Accrom? XAqua C18、Welch Ultimate XB- C18、Agilent ZORBAX Eclipse plus C18、Kromasil 100-5 C18、Phenomenex Luna C18（2）、Accrom Unitary C18）、柱溫（25、30、35℃）、流速（0.8、1.0、1.2 mL·min-1）、酸度（0.1%、0.2%、0.3%磷酸水溶液）及流動(dòng)相比例進(jìn)行了耐用性考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)色譜峰分離度受上述色譜條件影響不大，耐用性較好。為獲得最好的分離效果，最終確定了實(shí)驗(yàn)所需色譜條件。

綜上，本研究在現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上增加了射干薄層鑒別，優(yōu)化了白花丹、綠包藤及胡椒的薄層鑒別方法，使得鑒別工作變得高效、環(huán)保;增加了射干中黃酮類有效成分次野鳶尾黃素的含量測定。試驗(yàn)方法簡便快速，靈敏度高，專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，結(jié)果可靠，提高完善了其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以作為本品的質(zhì)量控制方法，為丹綠補(bǔ)腎膠囊的全面質(zhì)量控制提供了新手段，以有效控制藥品質(zhì)量。

參考文獻(xiàn)

[1]國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10436（ZD-0436）-2002-2012Z.

[2]劉倩，陳金月，文雋，等.麻杏二陳湯煮散質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2015， 21（9） ：71-73.

[3]劉韶，雷鵬，李新中，等.芪黃顆粒的薄層鑒別[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2004， 24（1） ：26-27.

[4]田成旺，郭建華，張科，等.射黃含片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中成藥， 2013， 35（2） ：302-305.

[5]柯發(fā)敏，張開蓮，鐘明鏡.咽炎含片中藥材的薄層色譜研究[J].中藥與臨床， 2010， 1（3） ：27-28.

[6]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：285.

[7]李欣妍，鄒桂欣，尤獻(xiàn)民，等.氣管炎丸中野鳶尾黃素含量測定[J]. 遼寧中醫(yī)雜志， 2016， 43（7） ：1450-1452.

[8]王曉月，邸子真，王光函，等.黃芩射干湯中千層紙素A 和次野鳶尾黃素的含量測定[J]. 實(shí)用藥物與臨床， 2017， 20（5） ：563-565.

[9]鄒桂欣，尤獻(xiàn)民，王光函，等.野鳶尾中異黃酮與其抗炎作用的相關(guān)性分析[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2016， 34（10） ：2406-2408.

[10]李鎖，張曉瑞， 尤獻(xiàn)民，等.小兒咽扁顆粒中野鳶尾黃素和白射干素含量測定方法研究 [J].遼寧中醫(yī)雜志， 2015， 42（9） ：1733-1735.

[11]曹岳華，彭國慶.高效液相色譜法測定射干利咽口服液中射干苷、次野鳶尾黃素的含量[J].中南藥學(xué)， 2010， 8（6） ： 431-434.

（收稿日期：2018-11-13 編輯：陶希睿）