植物乳桿菌KLDS 1.0386對C57BL/6小鼠膽固醇代謝的影響

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(1.東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030;2.中墾華山牧乳業(yè)有限公司,陜西渭南 714019)

植物乳桿菌KLDS1.0386對C57BL/6小鼠膽固醇代謝的影響

靳妲1,于上富1,2,李柏良1,李娜1,閆芬芬1,霍貴成1,*

(1.東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150030;2.中墾華山牧乳業(yè)有限公司,陜西渭南 714019)

目的:本研究測定了植物乳桿菌KLDS 1.0386對模擬胃腸液的耐受力,并通過構建高脂血癥模型小鼠評價該菌株對小鼠體內膽固醇代謝的影響。方法:體外模擬胃液腸液,菌落計數(shù)法檢測胃液腸液耐受性,并以健康C57BL/6雄性小鼠為對象,設置空白組、模型組、低劑量組、高劑量組、普伐他汀對照組,分別以生理鹽水、KLDS 1.0386懸濁液和普伐他汀連續(xù)灌胃4周,檢測小鼠肝臟膽固醇和甘油三酯,糞便膽汁酸和膽固醇水平。結果:在pH為3的模擬胃液環(huán)境中,該菌株3 h存活率可達92.62%,在模擬腸液環(huán)境中,3 h存活率為83.91%,說明植物乳桿菌KLDS 1.0386能通過胃進入腸道并保持活性。植物乳桿菌KLDS 1.0386菌株可顯著降低高脂小鼠肝臟甘油三酯和膽固醇水平(p<0.05),增加糞便膽汁酸和膽固醇的排出(p<0.05)。結論:該菌可以用做降膽固醇的潛在益生菌。

植物乳桿菌,胃液,腸液,膽固醇,膽汁酸

膽固醇是細胞膜的重要組成部分,然而,血清膽固醇的升高是導致冠心病的主要風險之一[1],比其他任何全球性疾病如肥胖、糖尿病、高血壓等,都要危險(WHO,2015),動脈粥樣硬化性冠心病(ASCVD)是導致發(fā)達國家人群發(fā)病率和死亡率的主要原因[2]。目前最有效的方法是服用他汀類藥物來抑制膽固醇的合成。然而,他汀類藥物具有副作用[3-5]并且其對于致命和非致命性的心血管疾病來說總體發(fā)病率僅下降25%,表明還需要有更多的方法來減少心血管疾病給人類帶來的負擔[6]。

聯(lián)合國糧農組織和世界衛(wèi)生組織將益生菌定義為“當達到一定數(shù)量時,對宿主有益的活性微生物”[7]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有很多降膽固醇的益生菌,其可以分泌膽鹽水解酶或吸收膽固醇來促進膽固醇從腸道排出體外[8]。也有大量的體內和體外實驗表明,有很多益生菌如雙歧桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌GG等,可以通過調節(jié)膽固醇在肝臟和腸道的關鍵機制來調控膽固醇的合成吸收和代謝[9-11]。2015年L. Alonso[12]等人建立豬高膽固醇模型,通過灌胃保加利亞乳桿菌,在體內和基因水平上證明了乳酸菌的降膽固醇作用。2016年Anila K[1]等用體外實驗,檢測了五株分離自印度西北部傳統(tǒng)發(fā)酵食品的乳酸菌的降膽固醇功能,研究發(fā)現(xiàn)一株干酪乳桿菌通過產(chǎn)生膽鹽水解酶與膽汁酸發(fā)生共沉淀作用從而降膽固醇。

植物乳桿菌KLDS1.0386分離自中國內蒙古地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品,已有研究證明KLDS1.0386具有體外降膽固醇能力和黏附性[13-16]。本實驗體外模擬胃腸液研究植物乳桿菌KLDS1.0386的胃腸道耐受能力,并且通過體內實驗證明此菌株的降膽固醇能力,為開發(fā)具有降膽固醇功能的發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌KLDS 1.0386(Lactobacillusplantarum) 由東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室提供。胃蛋白酶(活性:800～2500 units/mg),sigma;胰蛋白酶(活性>250 NF/mg),biotopped;甲醇 天津市富宇精細化工有限公司;總膽固醇檢測試劑盒、甘油三酯檢測試劑盒、總膽汁酸檢測試劑盒 上?？迫A生物工程股份有限公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純;乳酸菌:植物乳桿菌KLDS 1.0386(Lactobacillusplantarum) 由東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室提供;實驗小鼠:6周齡C57BL/6雄性小鼠 北京維通利華實驗動物技術有限公司;基礎飼料配方:面粉20%,麩皮25%,玉米20%,米粉10%,豆料20%,魚粉2%,骨粉2%,食鹽0.9%,維生素0.1%;高膽固醇飼料:膽固醇3%,膽鹽0.3%,豬油10%,蛋黃粉5%,基礎飼料81.7%;MRS培養(yǎng)基:稱取蛋白胨5 g,牛肉膏5 g,胰蛋白胨10 g,乙酸鈉5 g,磷酸氫二鉀2 g,葡萄糖20 g,酵母粉5 g,硫酸錳0.25 g,硫酸鎂0.58 g,檸檬酸氫二胺2 g,吐溫-80 1 g,牛肉膏5 g,加蒸餾水定容至1000 mL,高壓滅菌(121 ℃,20 min)。

BCN1360型生物潔凈工作臺 北京東聯(lián)哈爾儀器公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司;全自動高壓滅菌鍋HVE-50 HIRAYAMA;電子天平PL2002 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;GL-21M離心機 上海市離心機械研究所;生物顯微鏡 LEICA;DH-101-3BS電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市中環(huán)實驗電爐有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 模擬胃液和腸液的耐受性 將胃蛋白酶加入無菌生理鹽水(0.5%)配制成最終濃度3 g/L的胃蛋白酶溶液,用滅菌的0.1 mol/L的HCl調節(jié)pH為2.0和3.0,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

將胰蛋白酶加入無菌生理鹽水(0.5%)配制成最終濃度1 g/L,并用滅菌的0.1 mol/L的NaOH調節(jié)pH為8.0,經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

實驗前菌株KLDS 1.0386用MRS液體培養(yǎng)基活化三代,取培養(yǎng)18 h的植物乳桿菌KLDS 1.0386培養(yǎng)液于8000 r/min,離心20 min,用滅菌的PBS沖洗2次,同樣條件下離心,收集菌體,用PBS制成懸濁液。分別取0.2 mL的上述PBS懸濁液,0.3 mL的0.5%的NaCl加入到1 mL的胃液或腸液中,振蕩10 s,于37 ℃培養(yǎng),分別于0、1、2、3 h取0.1 mL進行涂板,通過平板菌落計數(shù)法觀察活菌數(shù)量并計算存活率[17]。

1.2.2 動物實驗

1.2.2.1 樣品制備 將活化好的植物乳桿菌KLDS 1.0386按2%接菌量接入MRS液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)18 h,4000 r/min離心10 min,用生理鹽水沖洗兩遍,最后用生理鹽水重選菌體至109CFU/mL和1010CFU/mL。菌體懸濁液每日新鮮制備。普伐他汀按小鼠3 mg/kg體重劑量給藥。

1.2.2.2 小鼠分組與飼養(yǎng) 所有小鼠喂一周商業(yè)飼料后隨機分為五組,每組八只:空白組(Control)、模型組(Model)、低劑量組(LD)、高劑量組(HD)、普伐他汀對照組(PS)。除空白組外,其他組均喂食高膽固醇飼料。樣品采取灌胃方式給予小鼠,空白組和模型組灌胃生理鹽水,低劑量組灌胃109CFU/mL的菌懸液,高劑量組灌胃1010CFU/mL的菌懸液,普伐他汀組灌胃普伐他汀溶液,按照小鼠體重1 mL/kg進行灌胃,每日灌胃1次,連續(xù)灌胃4周。具體見表1。鼠房溫度控制在(24±2) ℃,濕度45%～50%,照明8～10 h。實驗期間,定期更換墊料保持干燥,每周記錄小鼠體重變化和飲食情況,每天對小鼠精神、毛發(fā)和糞便等一般狀況進行觀察。在實驗結束前三天,采集鼠籠內干燥糞便備用。

1.2.2.3 小鼠體重、攝食量、食物利用率的測定 小鼠灌胃實驗開始后。每周稱量并記錄小鼠體重與攝食量,并計算食物利用率。食物利用率(%)=日體增重/日攝食量×100[18]。

1.2.2.4 小鼠臟器指數(shù)的測定 小鼠采血完畢,解剖小鼠,并摘取小鼠心臟、肝臟、脾臟、腎臟,用無菌生理鹽水沖洗表面,并用無菌濾紙吸干,然后迅速稱重,并進行臟器指數(shù)的測定。臟器指數(shù)(%)=臟器重量/體重×100[18]。

1.2.2.5 肝臟總膽固醇和甘油三酯的檢測 小鼠肝臟經(jīng)稱重后,取部分肝臟進行總膽固醇和甘油三酯的檢測。具體如下[19]:準確稱取100 mg肝臟組織,加入2 mL氯仿∶甲醇(2∶1,v/v)溶液放入玻璃研磨器中進行勻漿,37 ℃水浴30 min,12000 r/min離心10 min,收集上清,加600 μL生理鹽水,12000 r/min離心10 min,小心收集氯仿層液體至另一個新的EP管中。重復上述步驟一次,收集氯仿層液體,置通風柜吹干,加入80 μL異丙醇:Triton X-100(9∶1,v/v)溶液復溶,漩渦振蕩2 min,加蒸餾水120 μL,再漩渦振蕩2 min,使之充分溶解,此溶液即為提取的肝臟組織總脂肪。

表1 各組別小鼠飲食情況對照表Table 1 The diet compositions for mice of the different groups

將上述提取樣品用酶法試劑盒全自動生化儀測定肝臟組織總膽固醇和甘油三酯濃度。最后,計算出每g肝臟組織中總膽固醇或甘油三酯含量,以μmol/g來表示。

表2 植物乳桿菌KLDS 1.0386對模擬胃液和腸液的耐受性(log CFU/mL)Table 2 Survival rate of L. plantarum KLDS 1.0386 in simulated gastric and intestinal fluid at different time(log CFU/mL)

注:同行小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05)。

1.2.2.6 糞便總膽汁酸的測定 將糞便在烘箱中烘干,研磨成干粉,稱取0.5 g糞便干粉,加入無水乙醇10 mL,70 ℃水浴提取20 min,連續(xù)提取三次,合并提取液,將提取液沸水浴蒸干,加入5 mL石油醚,漩渦混勻,5000 r/min離心10 min,棄上清液,留沉淀。加入2% Triton X-100的乙醇溶液,漩渦混勻,5000 r/min離心10 min,取上層液在80 ℃水浴鍋中蒸干得沉淀,最后加入蒸餾水250 μL,漩渦1 min混勻,此溶液即為提取的糞便膽汁酸樣品溶液[20]。

采用商業(yè)化酶法檢測試劑盒,利用全自動生化分析儀進行檢測。計算出每g糞便中總膽汁酸含量,以μmol/g來表示。

1.2.2.7 糞便總膽固醇的測定 稱取1.0 g糞便干粉,加入20 mL氯仿∶甲醇(1∶1,v/v)溶液,80 ℃回流提取4 h;10000 r/min離心5 min,取上清液,加入20 mL 0.1 mol/L KOH-乙醇溶液,100 ℃皂化30 min,此步驟容易爆沸,注意加熱均勻;8000 r/min離心10 min,取上層液相至試管中,沸水浴蒸干,加入2 mL去離子水,漩渦振蕩混勻,再加入5 mL正己烷,漩渦振蕩1 min,提取未皂化的脂質;吸取正己烷層,37 ℃水浴并置于通風柜中吹干,加入1 mL雙蒸水漩渦混勻,完全溶解后即為糞便總膽固醇提取液[21]。

同樣采用商業(yè)化酶法檢測試劑盒,利用全自動生化分析儀進行檢測。計算出每g糞便中總膽固醇含量,以μmol/g來表示。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結果與分析

2.1 菌株的耐受性

2.1.1 菌株的胃液耐受性 如表2所示,在pH為2的模擬胃液環(huán)境下,菌株活菌數(shù)持續(xù)下降,具有顯著性(p<0.05),3 h后,活菌數(shù)從1.77×109CFU/mL下降到3×107CFU/mL,存活率僅為1.74%;而KLDS 1.0386在pH為3的模擬胃液環(huán)境下,各監(jiān)測點的活菌數(shù)量無顯著變化(p<0.05),3 h存活率可達92.62%,且活菌數(shù)量級一直保持在109CFU/mL以上,說明KLDS 1.0386具有良好的胃液耐受能力。

2.1.2 菌株的腸液耐受性 如表2所示,菌株KLDS 1.0386經(jīng)過模擬腸液環(huán)境下維持1 h后,活菌數(shù)量出現(xiàn)了降低(p<0.05),由1.5×109CFU/mL下降到1.05×109CFU/mL,在1～2 h期間,活菌數(shù)量差異不顯著(p>0.05),3 h活菌數(shù)略有回升,達到1.24×109CFU/mL,與0、1、2 h,活菌數(shù)差異不顯著(p>0.05)。雖然受試菌株在實驗期間活菌數(shù)有所下降,但一直保持在109CFU/mL以上,在模擬腸液環(huán)境3 h存活率達到83.91%,說明KLDS 1.0386具有良好的腸液耐受能力。

2.2 動物實驗

2.2.1 小鼠體重、攝食量與食物利用率 實驗期間,對小鼠的體重和攝食量進行監(jiān)測,如表3所示,在體重增量水平上,除普伐他汀對照組外,其余四組體重均無顯著差異,說明KLDS 1.0386對小鼠體重水平影響不大;

在總攝食量水平上,空白組攝食量高于其余四組(p<0.05),由于除空白組外,其他四組均喂食高膽固醇飼料,可能是高膽固醇飼料影響小鼠食欲,導致攝食量減少,而KLDS 1.0386低劑量組和高劑量組與模型組相比,攝食量無顯著差異(p<0.05),由此說明KLDS 1.0386不會對攝食量產(chǎn)生影響;

表3 小鼠體重、攝食量與食物利用率Table 3 The body weight,food intake and food efficiency of mice

表4 小鼠的臟器指數(shù)Table 4 The viscera indices of mice

在食物利用率水平上,KLDS 1.0386低劑量組和高劑量組與模型組和空白組相比,無顯著差異(p<0.05),普伐他汀組食物利用率明顯低于模型組和KLDS 1.0386高低劑量組(p<0.05),由此說明,KLDS 1.0386不會對食物利用率產(chǎn)生影響。

2.2.2 小鼠臟器指數(shù)分析 如表4所示,在肝臟器指數(shù)水平上,模型組與空白組相比,肝臟器指數(shù)明顯上升(p<0.05),KLDS 1.0386低劑量組和高劑量組略低于模型組,但差異不顯著(p>0.05),KLDS 1.0386高低劑量組與普伐他汀組也沒有明顯差異(p>0.05),由此說明,高膽固醇飼料會對小鼠肝臟重量產(chǎn)生明顯的影響。在腎體比、心體比和脾體比水平上,各實驗組沒有明顯差異,說明不同實驗處理對小鼠腎臟、心臟和脾臟并未產(chǎn)生影響。

2.2.3 肝臟甘油三酯水平分析 由圖1可知,模型組小鼠肝臟甘油三酯水平顯著高于空白組(p<0.05)。供試菌株KLDS 1.0386低劑量組與模型組相比,濃度略低但不明顯(p>0.05),而高劑量組濃度明顯低于模型組(p<0.05),與普伐他汀組差異不顯著(p>0.05)。由此可說明,KLDS 1.0386可有效降低模型小鼠肝臟甘油三酯水平,具有劑量-效應關系。

圖1 小鼠肝臟甘油三酯含量Fig.1 The Triglyceride levels in the liver of mice

2.2.4 肝臟總膽固醇水平分析 由圖2可知,模型組小鼠肝臟總膽固醇水平明顯高于空白組(p<0.05),供試菌株KLDS 1.0386低劑量組與高劑量組與模型組相比,膽固醇水平明顯下降,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05),與普伐他汀組相比差異不顯著(p>0.05)。說明KLDS 1.0386對于降低模型小鼠肝臟總膽固醇水平效果明顯。

圖2 小鼠肝臟膽固醇含量Fig.2 The Cholesterol levels in the liver of mice

2.2.5 糞便膽汁酸水平分析 從圖3可知,在糞便膽汁酸水平上,模型組小鼠濃度明顯高于空白組(p<0.05),KLDS 1.0386低劑量組排出量略高于模型組,但差異不顯著(p>0.05),而高劑量組的排出量明顯高于模型組,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05),同時也明顯高于普伐他汀組(p<0.05),說明KLDS 1.0386可以通過增加糞便膽汁酸的排出來降低模型小鼠體內膽固醇水平,同時具有劑量-效應關系。

圖3 小鼠糞便膽汁酸含量Fig.3 The bile acid levels in the feces of mice

2.2.6 糞便膽固醇水平分析 從圖4可知,在糞便膽固醇水平上,模型組小鼠濃度明顯高于空白組(p<0.05),同時KLDS 1.0386低劑量組和高劑量組濃度明顯高于模型組和普伐他汀組,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05),由此可知,KLDS 1.0386可以通過增加糞便膽固醇排出來降低體內膽固醇水平。

圖4 小鼠糞便膽固醇含量Fig.4 The cholesterol levels in the feces of mice

3 討論

乳酸菌已成為治療人類和動物腸道疾病的一種益生菌。來源于人類腸道的乳酸菌可以適應腸道環(huán)境并且優(yōu)先選擇其作為益生菌。盡管益生菌的某些功能性還有待于探索,但其在腸道系統(tǒng)中的耐受能力和對腸粘膜的粘附力是產(chǎn)生這些功能性的先決條件[22]。本實驗對植物乳桿菌KLDS 1.0386的胃液和腸液耐受力進行測定,在pH為3的模擬胃液環(huán)境中,該菌株3 h存活率可達92.62%,在模擬腸液環(huán)境中,3 h存活率為83.91%,且活菌數(shù)量級一直保持在109CFU/mL,說明該菌株具有良好的胃液腸液耐受能力為進一步研究植物乳桿菌KLDS 1.0386體內降膽固醇提供了先決條件。D. Haller[23]等人將食源性乳酸菌與腸源性乳酸菌進行比較,食源菌尤其是植物乳桿菌在pH1.5～2.5的鹽酸溶液中和10 mmol/L的膽酸溶液中展現(xiàn)了較高的耐受能力,與本實驗的結果相符。

本實驗采取小鼠自由采食高膽固醇飼料同時灌胃植物乳桿菌KLDS 1.0386的方式進行,實驗為期28天。在肝臟甘油三酯水平中,KLDS 1.0386高劑量組明顯低于高膽固醇對照組(p<0.05);肝臟膽固醇水平,KLDS 1.0386低劑量組和高劑量組與高膽固醇對照組相比,濃度均明顯下降,具有統(tǒng)計學意義(p<0.05);在糞便膽固醇和膽汁酸水平上,與高膽固醇對照組相比,灌胃KLDS 1.0386大大增加了小鼠膽固醇和膽汁酸的排泄量,尤其是高劑量組,糞便膽固醇和膽汁酸水平分別提高了40.89%和59.74%,這與已報到的結果類似。Jungae Jeun等[18]以C57BL/6小鼠為模型,每天灌胃濃度為109CFU/mL活性的植物乳桿菌和1010CFU/mL失活的植物乳桿菌,維持4周,結果顯示,與對照組相比,小鼠血清低密度脂蛋白膽固醇和甘油三酯水平顯著下降42%和32%,糞便膽汁酸水平升高45%。丁盼盼[24]等采用一株在羊糞中篩選的植物乳桿菌灌胃小鼠,為期30 d,結果顯示,與對照組相比,小鼠血清膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白水平分別下降了31.3%、20.44%和68.7%。

4 結論

本實驗結果表明,植物乳桿菌KLDS 1.0386具有良好的胃腸道拮抗性、降低肝臟甘油三酯、膽固醇水平和促進膽固醇、膽汁酸排出體外的能力,為開發(fā)具有降膽固醇功能的發(fā)酵劑奠定了理論基礎,為生產(chǎn)降膽固醇發(fā)酵乳制品提供了理論依據(jù),在未來的研究中,我們可以從基因入手,探討植物乳桿菌KLDS 1.0386對膽固醇合成和代謝相關基因的影響,及其降膽固醇具體的作用機制。

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EffectofLactobacillusPlantarumKLDS1.0386onthecholesterolmetabolisminC57BL/6mice

JINDa1,YUShang-fu1,2,LIBai-liang1,LINa1,YANFen-fen1,HUOGui-cheng1，*

(1.Key Laboratory of Dairy Science,Ministry of Education,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China;2.Farm China Dairy(Shaanxi)Co.,LTD,Weinan714019,China)

Objective:It was evaluated that the effect ofLactobacillusplantarumKLDS strain on the cholesterol metabolism in hyperlipidemia mice and zhe ability under simulated gastric and intestinal juice. Method:Viable count was used to detect the tolerance characteristics under simulated gastric and intestinal juice environment. Health C57BL/6male mice,as objects,were divided into control group,model group,low-dose group,high-dose group and pravastatin group,which were respectively given normal saline,LactobacillusplantarumKLDS1.0386bacteria suspension and pravastatin solution by gavage for4consecutive weeks. The liver levels of total cholesterol(TC),triglyceride(TG)and the feces levels of TC,total bile acid(TBA)were determined on the28th day of the experiment. Results:It showed that the tolerance rate in gastric juice pH3.0was92.62%,and the intestinal juice was83.91%,so,LactobacillusplantarumKLDS1.0386can pass the stomach into the intestines and keep active in the gut. After4weeks administration,compared with mice fed a high-cholesterol diet without lactic acid bacteria supplementation,there was a significant(p<0.05)decrease in triglyceride and total cholesterol levels in the hepatic of mice treated with KLDS1.0386strain. Furthermore,total cholesterol and total bile acid levels in the feces were significantly(p<0.05)increased after KLDS1.0386administration. Concluton:LactobacillusplantarumKLDS1.0386could be as the probiotics with cholesterol-lowering activity.

Lactobacillusplantarum;gastric juice;intestinal juice;cholesterol;bile acid

2017-05-25

靳妲(1993-),女,碩士研究生,研究方向：食品科學,E-mail:1315453208@qq.com。

*通訊作者:霍貴成(1958-),男,博士,教授,研究方向：食品微生物與生物技術,E-mail:guichenghuo@126.com。

國家重點研發(fā)計劃(2017YFD0400300)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)23-0275-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.050