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(1.寧波方太廚具有限公司,浙江寧波 315336; 2.天津頂育咨詢有限公司食品安全中心,上海 201103; 3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122; 4.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

真菌毒素DON和ZEN的體外聯(lián)合毒性評價

徐慧1,石慧2,張銀志3,*,孫秀蘭3,4,紀劍4,張入元4

(1.寧波方太廚具有限公司,浙江寧波 315336; 2.天津頂育咨詢有限公司食品安全中心,上海 201103; 3.江南大學食品科學與技術國家重點實驗室,江蘇無錫 214122; 4.江南大學食品學院,江蘇無錫 214122)

選取BEL7402細胞對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)的聯(lián)合毒性進行評價。首先將不同濃度的DON、ZEN以及其混合物染毒對數(shù)期的BEL7402細胞,刺激24 h后,對細胞增殖率、ROS活性氧水平、鈣離子水平、細胞凋亡率以及凋亡相關靶點基因的表達等指標進行監(jiān)測分析,并對兩種毒素的聯(lián)合毒性作用進行評價。結果表明,真菌毒素DON、ZEN均可抑制細胞活性,IC50分別為9.3、27.2 μg/mL,可導致細胞氧化應激損傷,提高細胞內(nèi)活性氧水平以及鈣離子濃度,顯著上調(diào)凋亡關鍵基因p53、Bax,下調(diào)Bal-2基因,誘導細胞產(chǎn)生早期凋亡甚至壞死,多種毒性指標驗證了這兩種毒素對細胞的聯(lián)合毒性作用表現(xiàn)為加和作用。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇,玉米赤霉烯酮,聯(lián)合毒性,體外毒性,加和作用

隨著真菌毒素的危害在全球范圍內(nèi)受到廣泛關注,并成為各國科學家研究的熱點后,單種真菌毒素對人體和動物的毒性評價研究已經(jīng)有大量的科技論文報道,而多種真菌毒素的共同作用則是最近才引起注意[1-2]?，F(xiàn)實生活和環(huán)境相對復雜,從一些報道中可以發(fā)現(xiàn),食品往往受到不止一種真菌毒素的污染[3-5],脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)和玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)都是由鐮刀菌所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物,尤其是在南方多雨潮濕日照短的亞熱帶濕潤氣候地區(qū),霉菌污染非常嚴重,DON和ZEN在飼料中的檢出率達100%[6]。此外,現(xiàn)實環(huán)境中能夠引起家畜出現(xiàn)不適或?qū)е轮卸景Y狀所需要的單種真菌毒素的劑量,往往相較于動物實驗研究所需要的劑量要低得多。這是由于攝入混合真菌毒素后,毒素之間會產(chǎn)生復雜的相互作用,且與染毒宿主、作用時間以及劑量等因素相關。關于相互作用效應并沒有統(tǒng)一明確的定義,政府部門也沒有發(fā)布關于毒素聯(lián)合作用的相關法規(guī)[7]。相互作用的情況一般可以分類為:協(xié)同作用、加和作用、亞加和性效應以及拮抗作用[8]。由此可見,在真菌毒素混合污染普遍嚴重的情況下,除了對真菌毒素單獨的毒性危害進行評價外,也要考慮多種真菌毒素聯(lián)合毒性作用的危害評估[9]。本文通過對DON和ZEN單獨以及聯(lián)合染毒細胞后活性氧ROS的水平,鈣離子通道,細胞凋亡率,凋亡靶點基因等指標的測定來研究其毒性以及聯(lián)合作用,從細胞水平,離子水平,基因水平對兩種真菌毒素的聯(lián)合毒性作用進行了評價,為進行更多指標的深入研究提供了有用的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BEL7402人肝癌細胞 中國科學院細胞庫;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、含0.25% EDTA的胰蛋白酶(250 U/mg) Gibco公司;脫氧雪腐鐮刀菌烯醇標準品(DON,純度≥99%)、玉米赤霉烯酮標準品(ZEN,純度≥99%)、二甲基亞砜(DMSO) Sigma公司;活性氧(ROS)檢測試劑盒、鈣離子熒光探針試劑盒、細胞凋亡試劑盒 碧云天生物技術公司;Trizol試劑盒、DNA抽提試劑盒及RNA酶(酶活2 kU) 上海生物工程有限公司;PCR反應試劑 TaKaRa(大連)生物公司;實驗中所用試劑 均由超純水配制。

SW-CJ超凈工作臺 蘇州零三凈化設備有限公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國Thermo Scientific公司;Universal32R冷凍離心機 德國Hettich公司;DT5-2低速離心機 北京時代北利離心機有限公司;Petroff-Hausser細胞計數(shù)器 上海上碧實驗儀器有限公司;倒置式生物顯微鏡 日本Olympus公司;Infinite M1000酶標儀 瑞士Tecan;激光共聚焦顯微鏡 德國蔡司公司;流式細胞儀 美國BD公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 細胞常規(guī)培養(yǎng):將BEL7402細胞利用含有10%胎牛血清和1%的100 μg/mL青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液,于飽和濕度5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。BEL7402細胞為貼壁生長,每隔3 d更換培養(yǎng)液一次,當細胞覆蓋瓶底面積90%時,可傳代培養(yǎng)。傳代時在超凈臺內(nèi)酒精燈火焰前,小心打開待傳代的細胞培養(yǎng)瓶蓋,輕微灼燒瓶口和后蓋,棄廢液,PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)清洗2次,加入0.25%胰蛋白酶進行消化,于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 min,待細胞變圓細胞間出現(xiàn)間隙,立刻加入2 mL完全培養(yǎng)液終止消化,用滅菌吹打管輕輕吹打成細胞懸液,1000 r/min離心5 min,棄上清,用完全培養(yǎng)液重懸細胞,將其分裝2瓶。

細胞凍存:選取對數(shù)生長期,生理狀態(tài)良好的細胞,凍存前一天更換培養(yǎng)液。待細胞消化離心(條件與細胞培養(yǎng)相同)后,向離心管中加入2 mL細胞凍存液(10%的DMSO,20%的胎牛血清,70%的完全培養(yǎng)液)吹打重懸細胞后轉(zhuǎn)移至凍存管,密封標注細胞名稱和日期,將凍存管先后按4 ℃ 30 min,-20 ℃ 4 h,-80 ℃ 12 h保存后轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。

復蘇:將含有待復蘇細胞的凍存管從液氮罐中取出,置于37 ℃溫水中解凍直至凍存管中溶液全部融化,1000 r/min離心5 min棄上清,加入1 mL 新鮮培養(yǎng)液重懸,再次1000 r/min離心5 min棄上清,加入完全培養(yǎng)液重懸吹打均勻,轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中,于飽和濕度5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng),24 h后換液棄除未正常貼壁生長的細胞繼續(xù)培養(yǎng)。操作過程中應注意快速解凍,避免冰晶導致細胞組織損傷。

1.2.2 MTT實驗 MTT法是常見的測定細胞增殖活性的實驗,其原理是活細胞線粒體中的脫氫酶能夠?qū)ⅫS色的四甲基偶氮唑鹽(MTT)還原成藍紫色的結晶化合物甲臜沉積于細胞中,而死細胞沒有這種能力,甲臜可溶于二甲基亞颯(DMSO)中,通過酶標儀測定吸光值(OD值),OD值與活細胞數(shù)成正比,可間接反映活細胞的變化,進而推算出毒素對細胞的抑制率。取對數(shù)生長期的BEL7402細胞消化收集制成單細胞懸液,計數(shù)并調(diào)整細胞濃度,將細胞以5×103個/孔接種于96孔板中培養(yǎng),待其貼壁小心吸除培養(yǎng)液,加入含有不同濃度的真菌毒素DON,ZEN及其聯(lián)合組的培養(yǎng)液,控制終濃度分別為DON:0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL;ZEN:0.1、0.2、0.5、1、5、10、20、50μg/mL;聯(lián)合染毒組DON+ZEN:0.1+0.1、0.2+0.2、0.5+0.5、1+1、2+5、5+10 μg/mL,每孔加入藥液200 μL。對照組每孔加入等體積的含有0.1% DMSO的培養(yǎng)基,空白組不接種細胞只加入等體積培養(yǎng)液。實驗組與對照組均設4個平行。將96孔板置于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h后,棄上清，每孔加入100 μL濃度1 mg/mL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,用針管小心吸除上清,每孔加入150 μL的DMSO,振蕩10 min,待孔中的紫色結晶完全溶解,用酶標儀在492 nm處測定各孔的吸光度(OD)值。計算增殖抑制率(%)=[1-(A染毒組-A空白組)/(A對照組-A空白組)](100[10],根據(jù)上述實驗結果確定DON、ZEN單獨染毒的半數(shù)抑制濃度(IC50),再根據(jù)IC50篩選出合適的DON、ZEN單獨染毒及其聯(lián)合染毒的濃度。

1.2.3 細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平的測定 實驗通過活性氧試劑盒對細胞內(nèi)活性氧進行檢測,活性氧試劑盒的主要試劑成分為DCFH-DA探針,探針本身沒有熒光,它可以透過細胞膜進入細胞后被水解為DCFH,DCFH無法穿透細胞膜,因而被滯留于細胞內(nèi),當細胞內(nèi)活性氧水平升高時,DCFH被氧化為可以發(fā)熒光的DCF,通過流式細胞儀檢測DCF的熒光強度,從而得出細胞內(nèi)活性氧的含量。采用DCFH-DA熒光探針來檢測細胞受真菌毒素刺激后體內(nèi)活性氧的水平,實驗按照活性氧檢測劑盒說明書進行操作。將BEL7402細胞接種到六孔板中,使每孔的細胞濃度達到1×106個/mL,待細胞貼壁進入對數(shù)生長期后,加入含不同組合真菌毒素的完全培養(yǎng)液其中DON染毒濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL;ZEN染毒濃度為0.1、0.2、0.5、1、5、10 μg/mL;聯(lián)合染毒組DON+ZEN:0.1+0.1、0.2+0.2、0.5+0.5、1+1、2+5、5+10 μg/mL,陰性對照組為含有0.1% DMSO的RPMI 1640培養(yǎng)基,陽性對照組是終濃度為50 μmol/L H2O2的RPMI 1640培養(yǎng)基,每個實驗組3個平行,于二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育24 h,棄除培養(yǎng)液用PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)離心洗滌并吹懸,加入終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA混勻,37 ℃避光孵育30 min,每10 min搖勻一次,以促使探針和細胞充分結合。最后用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細胞兩次,流式細胞儀測定其平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長530 nm)。

表1 基因的引物序列及退火溫度Table 1 Sequence of the peimers and annealing temperature

1.2.4 細胞內(nèi)Ca2+濃度的測定 選用Fluo-3 AM作為監(jiān)測細胞內(nèi)鈣離子濃度的熒光探針,將BEL-7402細胞鋪于六孔板,每孔細胞濃度達到1×106個/mL,待細胞貼壁生長進入對數(shù)生長期后開始加入與上述1.2.2相同含有不同組合真菌毒素的完全培養(yǎng)基染毒培養(yǎng)24 h,1000 r/min離心5 min,后用PBS洗滌3次,加入含有濃度為1 μmol/L Fluo-3 AM染液的培養(yǎng)基,混勻,于二氧化碳培養(yǎng)箱中避光孵育30 min,利用激光共聚焦顯微鏡測定其平均熒光強度(激發(fā)波長488 nm,發(fā)射波長525 nm)。

1.2.5 細胞凋亡率的測定 采用Annexin V-FITC和碘化丙啶PI雙染法對細胞進行染色,并于流式細胞儀上檢測細胞凋亡率,將呈對數(shù)生長的BEL7402細胞鋪于六孔板中,待細胞貼壁后,加入與上述1.2.2相同的含有不同組合真菌毒素的培養(yǎng)液孵育24 h,棄除培養(yǎng)基,用預冷的PBS(0.01 mol/L,pH=7.2)洗滌2次,加入胰酶消化細胞,2 min后加入細胞培養(yǎng)液終止消化,收集細胞,1000 r/min離心5 min,棄上清液,先加入500 μL Binding Buffer輕輕重懸細胞后,加入5 μL Annexin V-FITC染色液,輕輕混勻,再加入5 μL碘化丙啶染色液,輕輕混勻,于冰浴避光孵育10 min,隨即利用流式細胞儀檢測,Annexin V-FITC經(jīng)FL1通道檢測,最大激發(fā)波長488 nm;最大發(fā)射波長530 nm,PI經(jīng)FL3通道檢測,最大激發(fā)波長為535 nm,最大發(fā)射波長為615 nm,采用Cell Quest軟件對檢測結果進行分析。此外,為了使得凋亡檢測變得更加直觀,將轉(zhuǎn)染后的細胞用胰蛋白酶消化后以調(diào)整細胞數(shù)以1×105個/mL接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中,待貼壁后,吸除培養(yǎng)液,加入500 μL的含有5 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide的Binding Buffer輕輕混勻,避光孵育10 min,真菌毒素刺激組作為實驗組,未刺激組作為陰性對照組,采用激光共聚焦顯微鏡對BEL7402細胞進行觀察和分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測基因mRNA水平 將不同濃度真菌毒素染毒后的細胞,用Trizol法抽提細胞中的總mRNA,于260 nm及280 nm處測定吸光度值,計算mRNA的純度。計算公式為:mRNA純度=A260 nm/(A280 nm-本底),確保mRNA純度在1.8～2.0之間。按反轉(zhuǎn)錄試劑說明書,配制10 μL反應體系,反轉(zhuǎn)錄條件為37 ℃,15 min;85 ℃,5 s;4 ℃冷卻。按實時定量PCR試劑盒說明書配制成20 μL反應體系。用熒光定量PCR儀檢測基因表達強度Ct值,按-ΔΔCt方法計算[11]。上下游引物和內(nèi)參引物序列如表1所示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結果與分析

2.1 DON、ZEN分別對BEL7402細胞增殖活性的影響

本實驗采用不同濃度水平的DON、ZEN單獨染毒BEL-7402細胞,隨著真菌毒素刺激濃度的不斷升高,毒素對細胞的抑制率越來越明顯,在DON染毒濃度范圍低于0.5 μg/mL內(nèi),抑制率在5%左右,當染毒濃度超過10 μg/mL,細胞抑制率達到50%以上。ZEN在低濃度染毒范圍內(nèi),細胞抑制率相對DON更小,當染毒濃度到達25 μg/mL時,抑制率接近50%,通過改良寇氏法計算出DON和ZEN的IC50分別為9.3、27.2 μg/mL。而在聯(lián)合毒性細胞抑制率研究實驗中,細胞抑制率達到50%的時候,DON濃度為2.5 μg/mL,ZEN濃度為7.5 μg/mL,相比于單一毒素組IC50的毒素劑量,真菌毒素DON和ZEN在本實驗濃度設置疊加范圍內(nèi),表現(xiàn)出一定程度的加和作用,為后續(xù)聯(lián)合毒性實驗選擇合適DON和ZEN的組合濃度奠定基礎。

圖2 DON、ZEN單獨及其聯(lián)合作用對BEL-7402細胞活性氧的影響流式細胞儀檢測圖(A)和細胞內(nèi)活性氧相對熒光強度值(B)Fig.2 Effects of DON ZEN and their combination on the interacellular ROS production of BEL-7402 cells detceted by flow cytometry(A),and relative fluorescenceintensity of interacellular ROS production(B)

圖1 DON、ZEN以及DON+ZEN對BEL7402細胞活性影響Fig.1 Effects of DON,ZEN,and DON+ZEN on the BEL-7402 cell viability注:A:DON對BEL7402細胞的抑制率,B:ZEN對BEL7402細胞的抑制率,C:DON+ZEN對BEL7402細胞的抑制率。

2.2 DON、ZEN單獨及其聯(lián)合作用對BEL7402細胞活性氧的影響

由圖2可見,隨著DON、ZEN單獨和聯(lián)合刺激組的濃度不斷增大,細胞內(nèi)ROS不斷增加,除低濃度組0.1 μg/mL外,各毒素刺激作用組的ROS顯著高于對照組(p<0.05),DON、ZEN單獨以及聯(lián)合染毒刺激組的組間差異顯著(p<0.05)。相比于DON在誘導細胞產(chǎn)生ROS方面,ZEN的作用幅度更大,可能與其各自的毒性作用機制相關。DON、ZEN聯(lián)合刺激組的ROS值分別大于相應的單獨刺激組,預測值和測得值之間無顯著性差異(p>0.05),DON和ZEN聯(lián)合作用對細胞內(nèi)ROS的影響為加和效應。

2.3 DON、ZEN單獨及聯(lián)合染毒對細胞內(nèi)[Ca2+]i的影響

圖3 DON、ZEN單獨及其聯(lián)合作用對BEL-7402細胞內(nèi)鈣離子的影響的共聚焦成像圖(A)和細胞內(nèi)鈣離子相對熒光強度值(B)Fig.3 Effects of DON ZEN and their combination on the interacellular[Ca2+]i of BEL-7402 cells detceted by CLSM(A)and Relative fluorescence intensity of interacellular[Ca2+]i(B)

圖4 DON、ZEN單獨及其聯(lián)合作用對BEL7402細胞凋亡率影響的流式細胞圖以及共聚焦成像圖(A)和細胞凋亡百分比(B)Fig.4 Effects of DON ZEN and their combination on the apoptosis rate of BEL7402 cells detceted by flow cytometry and CLSM(A),and the percentage of apoptosis rate(B)

Ca2+作為一個主要的細胞內(nèi)信使參與調(diào)控多種細胞生理活動,細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)主要靠胞內(nèi)鈣池鈣釋放與重儲來維持,有賴于Ca2+-ATP酶(鈣泵)的Ca2+外流以及Ca2+跨膜內(nèi)流,一旦這種穩(wěn)態(tài)機制的被破壞失調(diào)就會產(chǎn)生一系列反應,隨之就會導致細胞損傷或死亡[14]。在正常生理狀態(tài)下,細胞內(nèi)鈣離子濃度總保持在極低水平,如圖3A所示,對照組顯示出微弱的熒光,而當細胞遇到相應刺激時,會通過多種途徑提高細胞內(nèi)鈣離子濃度。利用DON、ZEN單獨及聯(lián)合刺激細胞后,細胞的熒光強度明顯增強,表明真菌毒素能夠使細胞鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)導致細胞內(nèi)鈣離子升高。由圖3B可見,DON、ZEN單獨或聯(lián)合染毒24 h,BEL-7402細胞[Ca2+]i含量隨毒素濃度的升高而增加,除0.1 μg/mL外各染毒組均顯著高于空白對照組(p<0.05)。聯(lián)合組的[Ca2+]i平均值分別均明顯大于相對應的單獨染的[Ca2+]i平均值,預測值和測得值之間無顯著性差異(p>0.05),DON和ZEN聯(lián)合染毒對細胞內(nèi)[Ca2+]i蓄積為加和效應。此外,Ca2+水平的升高和ROS水平的提高相關,有研究表明ROS可以從多方面調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣信號,ROS可以導致鈣離子從細胞外環(huán)境向細胞質(zhì)的內(nèi)流,細胞質(zhì)內(nèi)鈣離子的升高可以激活其他一些酶,從而進一步增加氧化自由基的產(chǎn)生。這也驗證了之前實驗組真菌毒素刺激BEL7402細胞后,細胞內(nèi)ROS水平提高的現(xiàn)象。

2.4 DON、ZEN單獨及聯(lián)合染毒對細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測之后,如圖4A(a)所示,圖中左下角為正常活細胞,不被熒光染料染色;圖中右下角為凋亡早期的細胞,為Annexin V-FITC染色;圖中右上角為壞死細胞和凋亡晚期的細胞,同時被Annexin V-FITC和PI染色;圖中左上角出現(xiàn)的細胞是許可范圍內(nèi)的檢測誤差,其中凋亡率的計算為:(早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù))/總細胞數(shù)。

DON、ZEN及其聯(lián)合組染毒BEL-7402細胞24 h后,流式細胞儀檢測其凋亡情況如圖4B可見,對照組在沒有真菌毒素刺激的條件下,細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率都很小,但使用DON、ZEN單獨及其聯(lián)合組分別刺激細胞后,細胞凋亡率均隨毒素濃度的升高而增加。相比于對照組,DON單獨染毒時,細胞凋亡率除0.1 μg/mL組差異不顯著外,其余各組的細胞凋亡率均差異顯著,組間差異顯著(p<0.05)。ZEN單獨染毒時,低濃度組(0.1、0.2 μg/mL)細胞凋亡率差異不顯著,其余各高濃度組間細胞凋亡率差異顯著(p<0.05)。其中,DON處理組的凋亡率比ZEN處理組的凋亡率高,DON和ZEN聯(lián)合染毒24 h,細胞凋亡率組間差異顯著(p<0.05)且分別都大于相對應的單獨染毒組,預測值和測得值之間無顯著性差異(p>0.05),DON和ZEN聯(lián)合染毒對細胞凋亡率的影響為加和效應。此外,通過激光共聚焦顯微鏡對DON、ZEN以及其聯(lián)合染毒細胞后的熒光水平進行直觀觀察,由圖4A(b)可見,染毒組的綠色熒光和紅色熒光強度均強于對照組,聯(lián)合染毒組的紅綠熒光強度要強于所對應的單獨染毒組。

2.5 DON、ZEN單獨及聯(lián)合染毒對細胞內(nèi)凋亡調(diào)控基因Bax、Bal-2及p53的mRNA表達的影響

2.5.1Bax、Bal-2基因mRNA表達影響 細胞發(fā)生凋亡的過程受到基因的嚴格調(diào)控,其中Bcl-2家族基因是與細胞凋亡相關基因中最受關注的之一。Bcl-2家族蛋白在調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑中起著至關重要的作用,Bcl-2蛋白主要分布于線粒體膜、核膜及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上,維護線粒體膜完整,防止細胞色素C的釋放,阻止細胞凋亡,是細胞的抗凋亡成員[15]。Bcl-2家族除Bcl-2外,還有Bax,當Bax形成Bax-Bax同源二聚體時會誘導細胞凋亡,隨著Bcl-2表達量的上升,Bax二聚體會漸漸分開與Bcl-2形成比Bax-Bax二聚體更穩(wěn)定的Bax-Bcl-2異二聚體,從而緩解Bax-Bax二聚體誘導細胞凋亡的作用,簡言之,Bcl-2過量表達細胞存活,Bax過量表達則細胞凋亡[16]。由圖5可見,DON、ZEN單獨及其聯(lián)合均可以上調(diào)Bax基因相對mRNA的表達。DON單獨染毒BEL-7402細胞時,低濃度組0.1 μg/mL與對照組,0.2 μg/mL與0.5 μg/mL組間差異不顯著,隨著染毒濃度增大,Bax相對mRNA表達水平升高,后三組顯著高于前三組(p<0.05)。ZEN單獨染毒時低濃度組0.1 μg/mL與對照組不顯著性,0.5 μg/mL與1 μg/mL組間差異不明顯。聯(lián)合染毒時各組差異顯著,5+10 μg/mL顯著性低于2+5 μg/mL,說明聯(lián)合濃度達到DON 5 μg/mL+ZEN 10 μg/mL反而降低了Bax的mRNA的表達,DON、ZEN單獨染毒或聯(lián)合染毒的其余各組差異顯著(p<0.05)。實驗結果表明,DON和ZEN均可誘導BEL-7402細胞的Bax基因的表達,兩者聯(lián)合染毒時細胞內(nèi)Bax的mRNA的表達量大于DON、ZEN單獨染毒組,表現(xiàn)出加和效應。

圖5 DON ZEN單獨及其聯(lián)合對BEL7402細胞Bax的mRNA表達水平Fig.5 Effects of DON ZEN and their combination on the relative mRNA level of Bax in BEL7402 cells注:對所有毒素劑量組分別與空白組進行 t-test檢驗,*表示p<0.05;圖6、圖7同。

由圖6可見,DON、ZEN單獨及其聯(lián)合均可以下調(diào)Bcl-2基因相對mRNA的表達。DON單獨染毒時,低濃度組0.1 μg/mL與對照組差異不顯著,隨著染毒濃度的增大,對Bcl-2基因下調(diào)越加明顯;ZEN單獨染毒時0.1 μg/mL組與對照組差異不顯著;聯(lián)合染毒時0.2+0.2 μg/mL、0.5+0.5 μg/mL組兩個組間差異不顯著。DON、ZEN單獨染毒或聯(lián)合染毒的其余各組差異顯著(p<0.05)。實驗結果表明DON和ZEN在較高濃度范圍可以誘導Bal-2基因的下調(diào),兩者聯(lián)合染毒時對Bal-2下調(diào)表現(xiàn)為加和作用。

圖6 DON ZEN單獨及其聯(lián)合對BEL7402細胞Bcl-2的mRNA表達水平Fig.6 Effects of DON ZEN and their combination on the relative mRNA level of Bcl-2 in BEL7402 cells

圖7 DON和ZEN單獨及聯(lián)合作用對BEL7402細胞p53相對mRNA表達水平的影響Fig.7 Effects of individual and combinational treatment of DON and ZEN on the relative mRNA ration of p53 in BEL7402 cells

2.5.2p53基因mRNA表達的影響 在細胞凋亡過程中,p53發(fā)揮著極其重要的作用。p53蛋白主要集中在細胞核漿中,能夠和DNA發(fā)生特異結合,具有明顯的細胞轉(zhuǎn)化抑制作用,檢查DNA損傷,監(jiān)視基因組DNA的完整性。若遭受外界刺激導致DNA發(fā)生損傷,p53可作為轉(zhuǎn)錄因子誘導一系列下游基因的表達,介導細胞停止在G期,使損傷DNA得以充分修復。如果DNA遭受不可逆的嚴重損傷無法修復,則p53啟動凋亡程序誘導細胞凋亡[17]。由圖7可見,DON、ZEN單獨及其聯(lián)合均可以上調(diào)p53基因相對mRNA的表達。DON染毒BEL-7402細胞時,低濃度范圍(<0.5 μg/mL)與對照組相比p53基因上調(diào)并不明顯,隨著染毒濃度的增大p53上調(diào)幅度有所增大。相對于ZEN來說,高劑量的DON上調(diào)p53幅度更大。ZEN染毒BEL-7402細胞時,低濃度范圍(<1 μg/mL),p53相對mRNA表達水平較空白組隨具有統(tǒng)計學顯著性,但是上調(diào)趨勢不夠明顯,刺激濃度增大,p53相對mRNA表達水平大幅度增加,當ZEN濃度達到5 μg/mL后,p53相對mRNA表達水平不再增加。DON、ZEN聯(lián)合染毒的所有組較對照組都存在統(tǒng)計學顯著性差異(p<0.05)。實驗結果表明,DON、ZEN均能夠誘導BEL-7402細胞的p53基因mRNA的表達,干擾p53凋亡通路的調(diào)控,從而誘使細胞發(fā)生凋亡。在兩者聯(lián)合誘導p53活化的程度均大于相應DON和ZEN單獨染毒組,且測量值與預測值之間無顯著性差異,對調(diào)控p53基因誘導凋亡表現(xiàn)為加和作用。

3 結論

通過對DON和ZEN單獨以及聯(lián)合染毒細胞后活性氧ROS的水平,鈣離子通道,細胞凋亡率,凋亡靶點基因等指標的測定來研究其毒性以及聯(lián)合作用。實驗結果表明,DON和ZEN均可導致細胞氧化應激損傷,提高細胞內(nèi)活性氧水平以及鈣離子濃度,顯著上調(diào)凋亡關鍵基因p53,Bax下調(diào)Bal-2基因,誘導細胞產(chǎn)生早期凋亡甚至壞死,多種毒性指標驗證了這兩種毒素作用細胞具有相似的作用位點和信號通路使其產(chǎn)生具有加和作用的聯(lián)合毒性作用。

現(xiàn)階段文獻報道,大多通過細胞的存活率單一指標來計算真菌毒素DON和ZEN的聯(lián)合效應,如,Kouadio J H 等人發(fā)現(xiàn),DON(10～20 μg/mL)和ZEN(10-20 μg/mL)作用Caco-2細胞72 h之后,通過細胞存活率計算發(fā)表DON和ZEN存在加和作用[18]。Ficheux A S 等人發(fā)現(xiàn),DON(0.04-0.1 μg/mL)和ZEN(0.2-10 μg/mL)作用CGU-GM 細胞14 d之后,通過細胞存活率計算發(fā)表DON和ZEN存在加和作用[19]。Wan L Y M 等人發(fā)現(xiàn),DON(0.5-2 μg/mL)和ZEN(10-40 μg/mL)作用IPEC-J2 細胞48 h之后,通過細胞存活率計算發(fā)表DON和ZEN在低劑量下存在拮抗作用,在高劑量下存在協(xié)同作用[20]。而此次研究從細胞水平,離子水平,基因水平對兩種真菌毒素的聯(lián)合毒性作用進行了評價,為進行更多指標的深入研究提供了有用的參考價值。

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CombinativetoxicityassessmentofmycotoxinsDONandZENinvitro

XUHui1,SHIHui2,ZHANGYin-zhi3,*,SUNXiu-lan3,4,JIJian4,ZHANGRu-yuan4

(1.Ningbo Fotile Kitchen Ware Co.,Ltd.,Ningbo 315336,China;2.Tingyi Holding Corp,Central Research Institute-Food Safety,Shanghai 201103,China;3.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Wuxi 214122,China;4.School of Food Science,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

BEL-7402 cells were chosen as the cell model in this study to evaluate the indiviual and combined toxicity of Deoxynivalenol(DON)and Zearalenone(ZEN). With the logarithmic phase of BEL7402 cells exposed to different concentrations of DON,ZEN and their mixture for 24 h,the rate of cell proliferation,reactive oxygen species(ROS)and calcium levels,cell apoptosis rate and apoptosis related genes expression were analyzed and the combined effect of the two toxins was evaluated. The results showed that the mycotoxin DON,ZEN could inhibit cell activity with an IC50of 9.3 μg/mL and 27.2 μg/mL,lead to cell damage induced by oxidative stress and increase the intracellular levels of reactive oxygen species and calcium ion concentration. Proapoptotic genep53 was signifigantly up-regulation andBal-2 gene was down-regulated,induce cell apoptosis or necrosis,a variety of toxic index verified that the combined toxicity of these two toxins on cells have an additive effect.

deoxynivalenol;zearalenone;combined toxicity;invitrotoxicity;additive effect

2017-06-16

徐慧(1973-)，女，本科，工程師，主要從事家用電器機械制造方面的研究，E-mail:xuh@fotile.com。

*通訊作者:張銀志(1975-)，男，碩士，高級工程師，主要從事食品安全檢測方面研究，E-mail:yinzhizhang@jiangnan.edu.cn。

TS201.4

A

1002-0306(2017)23-0268-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.23.049