曾 珠

西安市兒童醫(yī)院急診科(西安710003)

·臨床檢驗(yàn)·

新生兒百日咳診斷及病原菌耐藥性分析

曾 珠

西安市兒童醫(yī)院急診科(西安710003)

目的：探討新生兒百日咳的診斷方法，分析病原菌的藥物敏感性，為患兒后期治療提供可靠依據(jù)。方法：采集76例疑似患兒鼻咽拭子，分別使用細(xì)菌培養(yǎng)和PCR檢測(cè)法進(jìn)行確診，隨后采用瓊脂稀釋最低抑菌濃度法(MIC)、E-test法和紙片擴(kuò)散法檢測(cè)分離菌株對(duì)紅霉素、頭孢唑啉等抗菌藥物的敏感性。結(jié)果：細(xì)菌培養(yǎng)法獲得5株百日咳桿菌菌株，陽(yáng)性率為6.58%；PCR檢測(cè)陽(yáng)性率達(dá)到27.63(21例)%，兩種檢測(cè)方法在陽(yáng)性檢出率方面的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。5株百日咳桿菌紅霉素紙片擴(kuò)散法的抑菌圈直徑皆>42 mm(47～55 mm)，E-test MIC為0.051～0.089 μg/ml，瓊脂稀釋法MIC均為0.135 μg/ml；頭孢唑啉MIC均為0.03 μg/ml，頭孢替安MIC為 0.015～0.025 μg/ml、阿奇霉素MIC為 0.030～0.060 μg/ml、環(huán)丙沙星均為2 μg/ml、克林霉素為1～2 μg/ml。結(jié)論： PCR在新生兒百日咳檢測(cè)中檢出效率高，紅霉素可作為治療新生兒百日咳的良好藥物。

百日咳是一種好發(fā)于嬰幼兒期的由G-鮑特菌屬短桿菌引發(fā)的重要傳染性呼吸道疾病。目前，針對(duì)百日咳的診斷國(guó)外實(shí)驗(yàn)室主要采用PCR技術(shù)，因而我國(guó)主要采用細(xì)菌培養(yǎng)及血清學(xué)檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法[1]。本研究就百日咳疑似患兒診斷方法及感染性病原菌耐藥性做了詳細(xì)研究，報(bào)告如下。

資料與方法

1 一般資料 選擇2015年4月至2016年4月期間就診的疑似患兒76例，其中男39例，女37例；患兒發(fā)病日齡14～28(21.66±3.73)d。納入標(biāo)準(zhǔn)：存在陣發(fā)性咳嗽，且持續(xù)2周以上者；咳嗽過(guò)程中出現(xiàn)嘔吐，甚至舌系帶發(fā)生潰瘍或結(jié)膜下出血者。排除標(biāo)準(zhǔn)：存在嚴(yán)重肝腎功能異常者；不愿參與研究者。所有患兒家屬均自愿簽署知情協(xié)議書(shū)。

2 方 法

2.1 病原菌分離檢測(cè)：采集患兒鼻咽拭子后即刻接種到選擇性木炭瓊脂培養(yǎng)基中，37℃孵育，3 d后開(kāi)始觀察菌落變化，培養(yǎng)7～14 d。待發(fā)現(xiàn)圓形的灰白色、半透明狀疑似菌落即可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定。鑒定試驗(yàn)依據(jù)《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》中的格蘭染色、觸酶試驗(yàn)及百日咳桿菌的血清凝集實(shí)驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行操作[2]。百日咳桿菌菌落判斷：顯微鏡檢測(cè)結(jié)果顯示G-的短小球桿菌，觸酶試驗(yàn)顯示(+)，且百日咳桿菌血清凝集試驗(yàn)結(jié)果(+)，而副百日咳桿菌結(jié)果為(-)。

2.2 PCR檢測(cè)：將取得的患兒鼻咽拭子樣本置入1 ml無(wú)菌生理鹽水中洗滌，所得浸液于15000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，棄上清，用Omega公司提供的DNA提取試劑盒提取樣本DNA[3]。依據(jù)參考文獻(xiàn)[4]：上游引物選擇5'-TGAGAAACTGGAAATCGCCAACCCC-3' ，下游引物選擇5'-CGCTTGCGGCGCAGCTCCACGATAG-3'；選擇百日咳實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)插入序列IS481為靶基因；擴(kuò)增DNA片段為308個(gè)堿基對(duì)。PCR反應(yīng)體系：5 ul10×Buffer緩沖液；0.2 mmol/L的dNTP；0.4 mmol/L的上下引物；2.5U的Taq DNA聚合酶；2 ulDNA模板，總體積25 ul。基因組DNA擴(kuò)增條件： 94 ℃下變性50 s； 58 ℃下退火 30 s； 72 ℃下延伸 30 s，共30 個(gè)循環(huán)。最后72 ℃延伸10 min。經(jīng)PCR擴(kuò)增所得樣本DNA 產(chǎn)物需經(jīng)過(guò)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離(Marker 作參照)，當(dāng)凝膠中的目標(biāo)條帶處出現(xiàn)特異性條則為(+)。

2.3 病原菌藥物敏感性檢測(cè):選擇瓊脂稀釋MIC法檢驗(yàn)分離到的百日咳桿菌的耐藥性。本研究所選擇抗生素有紅霉素、頭孢唑啉、頭孢替安、阿奇霉素、克林霉素、左氧氟沙星。其中紅霉素除采用上述方法外，還使用紙片擴(kuò)散法和E-test法進(jìn)行檢驗(yàn)。培養(yǎng)皿，90 mm；培養(yǎng)基，25 ml 含10%脫纖維羊血的碳瓊脂培養(yǎng)基。E-test紙條購(gòu)于法國(guó)AB BIOMERIEUX公司；質(zhì)控菌選擇金黃色葡萄球菌ATCC 25923、流感嗜血桿菌ATCC49247。在檢測(cè)菌株孵育72h讀取抑菌圈直徑及MIC指。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料采用[例(%)]表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)鑒定 結(jié)果顯示76份新生兒的鼻咽拭子中百日咳桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性者5例，總陽(yáng)性率僅6.58%；PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，76份樣本中陽(yáng)性者為21例，陽(yáng)性率達(dá)到27.63%。百日咳細(xì)菌培養(yǎng)和PCR檢測(cè)的陽(yáng)性率之間對(duì)比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.87，P<0.05)。

2 分離菌株藥物敏感性檢測(cè) 結(jié)果對(duì)細(xì)菌分離培養(yǎng)法鑒定得到的5株菌株進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)，見(jiàn)表1。細(xì)菌培養(yǎng)得到的5株百日咳桿菌的紅霉素紙片擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)結(jié)果中抑菌圈直徑皆大于42 mm(47～55 mm)；紅霉素E-test MIC結(jié)果在0.051～0.089 μg/ml，其中編號(hào)為201601的菌株紅霉素E-test MIC最?。画傊♂尫ㄖ屑t霉素MIC都為0.135 μg/ml，頭孢唑啉MIC都為0.03 μg/ml，頭孢替安MIC范圍為0.015～0.025 μg/ml、阿奇霉素MIC范圍為0.030～0.060 Mμg/ml、環(huán)丙沙星均為2 μg/ml、克林霉素范圍為1～2 μg/ml。

表1 5株百日咳桿菌抗菌藥物敏感性檢驗(yàn)結(jié)果

討 論

百日咳在我國(guó)屬于乙類(lèi)傳染性疾病，免疫接種措施使該疾病發(fā)病率保持在1/10萬(wàn)以下，然近年來(lái)該病發(fā)病率出現(xiàn)反彈，甚至局部出現(xiàn)暴增現(xiàn)象，例如西安市2014年發(fā)病率與上一年相比增加了238%，甚至未央?yún)^(qū)、灞橋區(qū)等區(qū)域發(fā)病率均超過(guò)1/10萬(wàn)[4]。新生兒對(duì)于百日咳桿菌的免疫性抗體主要來(lái)源于母體，或后天的免疫接種。75%的新生兒出生時(shí)其體內(nèi)的百日咳桿菌抗體低于保護(hù)性水平水平，超過(guò)90%的新生兒在出生后因體內(nèi)抗體流失，因而在6周后易受病原菌侵染，造成新生兒百日咳發(fā)病率增加。

百日咳桿菌的細(xì)菌培養(yǎng)法、血清學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)等是當(dāng)前臨床中常用的百日咳診斷方法。從卡他或痙咳初期患兒的鼻咽拭子中獲得百日咳桿菌是百日咳診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法雖特異性較好，但結(jié)果需等3～7d的培養(yǎng)后方能知曉，且取樣前抗生素使用、病程及疫苗接種情況均對(duì)檢測(cè)的敏感性產(chǎn)生很大影響。病原菌的核酸擴(kuò)增技術(shù)大大提高了百日咳確診率，檢測(cè)敏感性在90%以上，特異性高于95%。黃海濤研究發(fā)現(xiàn)，百日咳患兒PCR陽(yáng)性檢出率為50.76%，更適合于早期病程患兒病情診斷[5]。本研究對(duì)76例疑似百日咳患兒采用鼻咽拭子的細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR檢測(cè)法進(jìn)行確診，結(jié)果表明，PCR檢測(cè)法陽(yáng)性檢出率明顯高于對(duì)照組。

王增國(guó)[6]對(duì)抗紅霉素的百日咳桿菌菌株的耐藥機(jī)制進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，百日咳桿菌耐藥性主要是A2047G 突變引起的。以往研究發(fā)現(xiàn)，紅霉素是可用于任何年齡段兒童的抗菌藥物，安全、低毒，此外其具有很強(qiáng)的細(xì)胞穿透力，可維持炎性反應(yīng)病灶區(qū)的局部高濃度，且可直接調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能紊亂[7]。具體為：通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，促進(jìn)中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等細(xì)胞凋亡，加速Ca2+內(nèi)流，從而抑制組胺等致敏物質(zhì)的釋放；同時(shí)可顯著抑制COX-2蛋白及白細(xì)胞粘附分子Mac-1的表達(dá)。鑒于紅霉素高效的抗菌作用及免疫調(diào)節(jié)功能，本院將其作為治療百日咳的首選藥物，該結(jié)論與羅潔等研究一致。

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百日咳/診斷 新生兒 @病原菌耐藥性

R725.6

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.12.073

(收稿：2017-06-15)