周景儒，趙婉妮，梁劍峰

（1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100044； 2. 北京醫(yī)院普通外科，北京 100730；3. 北京大學(xué)國際醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 102206）

欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的抑制作用

周景儒1，趙婉妮2，梁劍峰3

（1. 北京大學(xué)人民醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100044； 2. 北京醫(yī)院普通外科，北京 100730；3. 北京大學(xué)國際醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 102206）

目的觀察欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的抑制作用，并探討其作用機(jī)制。方法培養(yǎng)SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株。采用MTT法測定欖香烯對SK-N-SH細(xì)胞的抑制率，應(yīng)用實(shí)時(shí)qPCR和Western blotting法測定欖香烯對SK-N-SH細(xì)胞中神經(jīng)元限制性沉默因子 （REST） 的調(diào)控作用，并進(jìn)一步用實(shí)時(shí)qPCR檢測SK-N-SH細(xì)胞中細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1和CCNE1的表達(dá)。結(jié)果欖香烯對SK-N-SH細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用 （P = 0.001 16） ，并呈時(shí)間和濃度依賴性；欖香烯下調(diào)REST mRNA （P = 0.000 38） 和蛋白表達(dá) （P = 0.003 39） ，并且抑制細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1 mRNA表達(dá) （P = 0.001 91） 和CCNE1 mRNA表達(dá) （P = 0.000 15） 。結(jié)論欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖有抑制作用，并且抑制其REST和細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1和CCNE1的表達(dá)。

欖香烯； 神經(jīng)母細(xì)胞瘤； 神經(jīng)元限制性沉默因子； CCND1； CCNE1

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是最常見的一種小兒惡性腫瘤，占小兒腫瘤患者死因的15%［1-3］。目前，神經(jīng)母細(xì)胞瘤主要治療方法有手術(shù)、化療和放療。神經(jīng)母細(xì)胞瘤異質(zhì)性較強(qiáng)，一些患者對化療不敏感，愈后較差［4-6］。因此有待開發(fā)更有效的治療藥物。神經(jīng)元限制性沉默因子 （repressor element-1 silencing transcription factor，REST） 基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中為致癌基因，前期研究［2-3］表明REST高表達(dá)與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的異型性和預(yù)后有關(guān)。

欖香烯從天然姜科植物溫郁金中提取獲得，是以β-欖香烯為主要成分的欖香烯類化合物，具有高效、毒性低、能通過血腦屏障等特點(diǎn)［7-9］。大量研究［7-11］表明欖香烯對多種腫瘤具有細(xì)胞毒性作用，對多耐藥基因高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞殺傷作用尤為明顯。目前欖香烯在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中作用的研究甚少，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)檢測欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SK-N-SH來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（Gibco公司） 的 Sigma DMEM 培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱條件為37 ℃、5%CO2。在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度為80%～90% 時(shí)，用0.25%胰蛋白酶 （Gibco公司） ，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。欖香烯乳注射液由大連華立金港藥業(yè)有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT法測定細(xì)胞生長抑制率：SK-N-SH細(xì)胞3 000/孔接種在96 孔板中，含0.2 mL培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h 后加入不同濃度的欖香烯（ 30、60、90 μ g/mL） ，每種藥液濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，另設(shè)溶劑對照4 個(gè)復(fù)孔。隨后于24、48 、72 h 每孔加入20 μ L MTT（ 5 g/L） ，37 ℃孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，去除上清，每孔加入150 μ L DMSO，震蕩15 min。酶標(biāo)儀檢測490 nm 波長的吸光度值，計(jì)算抑制率［12］。

1.2.2 實(shí) 時(shí) qPCR：SK-N-SH 細(xì) 胞以 1×104/500 μ L接種在24孔板中，培養(yǎng)24 h后加入不同濃度的欖香烯（ 30、60、90 μ g/mL） ，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后去除上清，回收細(xì)胞。應(yīng)用RNeasy Mini Kit試劑盒進(jìn)行細(xì)胞總mRNA提取，實(shí)時(shí)試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以β-actin為內(nèi)參，對 REST、CCND1 和 CCNE1 mRNA表達(dá)量進(jìn)行qPCR檢測，所用的引物序列為：β-actin，上游引物5’-GCTCGTCGTCGACAACGGCTC-3’，下 游 引 物5’-CAAACATGATCTGGGTCATCTTCTC-3’；REST，上游引物5’-GCATTTGCTTCCAACTTTTGTTGA-3’，下 游 引物5’-ACTGCTGGTAAACAGCCCTC-3’；CCND1，上 游 引 物5’-CTCCTCTCCGGAGCATTTTGATA-3’，下游引物5’-TTAAAGACAGTTTTTGGGTAATCT-3’；CCNE1，上游引物5’-AGCGGTAAGAAGCAGAGCA G-3’，下游引物5’-TTTGATGCCATCCACAGAAA-3’。PCR參數(shù)：95 ℃ 3 min；95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，50個(gè)循環(huán)［13］。

1.2.3 Western blotting檢測：分別收集對照組和加入不同濃度欖香烯（ 30、60、90 μ g/mL） 48 h后的SKN-SH細(xì)胞，用M-PER 哺乳動(dòng)物蛋白提取劑（ Thermo Fisher Scientific公司） 回收蛋白。用BCA 法對蛋白進(jìn)行定量。制備SDS 凝膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，封閉一抗：兔抗人REST多克隆抗體及β-actin單抗，4 ℃冰箱過夜，洗膜3×5 min；封閉二抗，室溫1 h，洗膜3×5 min，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑 （enhanced chemiluminescence，ECL） 顯影［13］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所得數(shù)據(jù)用x-±s表示，采用One-Way AVONA 分析［12-13］，P ＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

結(jié)果顯示，欖香烯能有效抑制SK-N-SH細(xì)胞的增殖，與對照組相比，加入欖香烯（30 μ g/mL）24 h后SK-N-SH細(xì)胞數(shù)明顯減少，欖香烯（60 μ g/mL）處理24 h后SK-N-SH細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少，同時(shí)細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)改變，90 μ g/mL欖香烯作用較60 μ g/mL更強(qiáng)（ 圖1） 。MTT檢測結(jié)果顯示欖香烯對SK-N-SH細(xì)胞的生長有抑制作用，細(xì)胞株的增殖抑制率隨濃度增加和時(shí)間的增長而增高（ P = 0.001 16） ，表現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性（ 圖2） 。

2.2 欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中REST基因表達(dá)的影響

通過實(shí)時(shí)qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，加入欖香烯后SK-N-SH細(xì)胞中REST mRNA表達(dá)量明顯受到抑制 （P = 0.000 38） 。Western blotting檢測結(jié)果進(jìn)一步顯示，與對照組相比，SK-N-SH細(xì)胞中REST蛋白表達(dá)量明顯受欖香烯的抑制 （P = 0.003 39） 。實(shí)時(shí)qPCR和Western blotting的結(jié)果表明欖香烯可以抑制REST的表達(dá)，并且表現(xiàn)為濃度依賴性 （圖3）。

2.3 欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中CCND1和CCNE1基因表達(dá)的影響

研究［14］表明，敲除膠質(zhì)瘤的REST基因后細(xì)胞周期的相關(guān)基因CCND1和CCNE1的表達(dá)受到抑制，本研究進(jìn)一步研究了欖香烯對CCND1和CCNE1基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。通過實(shí)時(shí)qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，欖香烯對SK-N-SH細(xì)胞中CCND1的表達(dá)有明顯的抑制作用 （P = 0.001 91） ，對CCNE1的表達(dá)也有明顯的抑制作用 （P = 0.000 15） ，欖香烯的濃度越高對CCND1和CCNE1的抑制越明顯 （圖4）。

圖1 欖香烯對SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的抑制作用 ×40Fig.1 Effect of elemene in inhibiting SK-N-SH neuroblastoma cells proliferation ×40

圖2 欖香烯對SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活性的影響Fig.2 Effect of elemene in inhibiting cell viability of SK-N-SH neuroblastoma cells

圖3 欖香烯對SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞REST表達(dá)的抑制作用Fig.3 Effect of elemene on REST expression in SK-N-SH neuroblastoma cells

圖4 欖香烯對 SK-N-SH神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞CCNE1和CCND1 mRNA表達(dá)的抑制作用Fig.4 Effect of elemene on mRNA expression of CCNE1 and CCND1 in SK-N-SH neuroblastoma cells

3 討論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是小兒死亡率最高的實(shí)體腫瘤，惡性度高預(yù)后差［1-3］，有較強(qiáng)的異質(zhì)性，放化療效果差異較大，其中一些患者對放化療不敏感，病情惡化迅速?；熕幬锏膽?yīng)用是延長患者生存時(shí)間必不可少的手段，開發(fā)新的療效好、不良反應(yīng)少的藥物是患者生命延續(xù)的希望［4-6］。

大量研究［7-9］證實(shí)，欖香烯對多種腫瘤具有較強(qiáng)的抑制和殺傷作用，并和其他化療藥物有協(xié)同作用。在抗腫瘤的同時(shí)，欖香烯還具有保護(hù)機(jī)體免疫力，緩解疼痛，升高白細(xì)胞，降低骨髓抑制作用。研究表明欖香烯不良反應(yīng)小，無明顯肝毒性和腎毒性。本研究體外實(shí)驗(yàn)證明欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤有抑制作用，并且抑制作用與欖香烯的劑量和作用時(shí)間顯著相關(guān)。

REST基因是一種存在于各種細(xì)胞中的重要轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控因子，現(xiàn)已知其調(diào)控的基因超過2 000種［14］。研究［14］表明REST基因與肺癌、乳腺癌和大腸癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。前期研究［4-5］表明神經(jīng)母細(xì)胞瘤中REST基因?yàn)橹掳┗?，REST基因的表達(dá)和神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)有關(guān)。在膠質(zhì)瘤中降低REST的表達(dá)后可以抑制膠質(zhì)瘤增殖，并且降低CCND1和CCNE1的表達(dá)。本研究表明欖香烯可以抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤中REST的表達(dá)，并對細(xì)胞周期相關(guān)基因CCND1和CCNE1的表達(dá)也起下調(diào)作用，與以往研究結(jié)果一致［15］。

本研究通過體外實(shí)驗(yàn)闡述了欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖有明顯的抑制作用，其作用機(jī)制為欖香烯抑制神經(jīng)系統(tǒng)中致癌基因REST的表達(dá)，降低細(xì)胞周期基因CCND1和CCNE1的表達(dá)。今后將檢測REST、CCND1或CCNE1過表達(dá)是否會(huì)削弱欖香烯對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抑制作用，進(jìn)一步探討欖香烯其他可能作用機(jī)制。

綜上所述，本研究為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供了新的方向，也為尋找欖香烯抗腫瘤作用的靶點(diǎn)提供了新的線索。

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Mechanism of Inhibition of Neuroblastoma Cell Proliferation by Elemene

ZHOU Jingru1，ZHAO Wanni2，LIANG Jianfeng3
（1. Department of Neuorsurgery，Peking University People’s Hospital，Beijing 100044，China； 2. Department of General Surgery，Beijing Hospital，Beijing 100730，China； 3. Department of Neuorsurgery，Peking University International Hospital，Beijing 102206，China）

ObjectiveTo investigate the effect of elemene and the mechanism of this effect on the proliferation of neuroblastoma. Methods We treated cultured SK-N-SH cells with elemene and used the MTT assay to determine the inhibition of cell proliferation. We used RT-qPCR and Western blotting to measure the effect of elemene on mRNA and protein expression，respectively，of repressor element-1 silencing transcription factor（ REST） in SK-N-SH cells and evaluated the mRNA expression of CCND1 and CCNE1 in SK-N-SH cells by using RT-qPCR.ResultsElemene significantly inhibited the proliferation of SK-N-SH cells in a dose- and time-dependent manner（ P =0.001 16） . Moreover，the mRNA（ P = 0.000 38） and protein（ P = 0.003 39） expression of REST were markedly suppressed by elemene.Furthermore，elemene significantly reduced the mRNA expression of CCND1（ P = 0.001 91） and CCNE1（ P = 0.000 15） ，which are related to the cell cycle.ConclusionElemene significantly suppressed the proliferation of neuroblastoma cells through the reduction of REST，CCND1，and CCNE1.

elemene； neuroblastoma； repressor element-1 silencing transcription factor； CCND1； CCNE1

R739.4

A

0258-4646 （2017） 12-1062-05

http://kns.cnki.net/kcms/detail/21.1227.R.20171130.1758.004.html

10.12007/j.issn.0258-4646.2017.12.002

國家自然科學(xué)基金 （81301092） ；中國博士后科學(xué)基金（2013M540885）

周景儒 （1973-） ，男，副主任醫(yī)師，碩士.

梁劍峰，E-mail：liangjianfeng@pkuih.edu.cn

2017-04-17

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-11-30 17:58

（編輯 武玉欣）