李燕，宋佳成，嚴海浪，黃君文，陸鈺，馬占龍，施海彬

基礎(chǔ)與實驗研究

腱糖蛋白-C在載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊不同時期表達的變化

李燕，宋佳成，嚴海浪，黃君文，陸鈺，馬占龍，施海彬

目的：探討腱糖蛋白-C（TN-C） 在載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成過程中不同時期表達的動態(tài)變化。 方法：取雄性SPF級ApoE-/-小鼠50只（模型組），高脂飼料喂養(yǎng)，建立小鼠動脈粥樣硬化模型，雄性SPF級野生型C57BL/6小鼠50只為對照組，同樣高脂飲食。分別于喂養(yǎng)4、8、16、24、32周時處死小鼠，檢測血脂，顯微鏡觀察斑塊病理改變并進行定量分析，免疫組化方法檢測動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)TN-C表達。 結(jié)果：模型組小鼠總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C） 水平均高于對照組小鼠（P均＜0.05）。隨著造模時間的進展，模型組小鼠斑塊面積及斑塊面積／管腔面積比值不斷增加，各時期比較差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。模型組小鼠斑塊內(nèi)TN-C表達量隨著動脈粥樣硬化進展而增多，32周小鼠斑塊內(nèi)部TN-C表達升高最顯著，高于 8、16、24 周小鼠（分別為 0.49±0.07 vs 0.04±0.02、0.12±0.03、0.21±0.04，P＜0.05）。 結(jié)論：TN-C的表達量隨著斑塊進展不斷增加，可能與動脈粥樣硬化進展及斑塊不穩(wěn)定性有關(guān)。

動脈粥樣硬化；載脂蛋白E類；小鼠，基因敲除；腱糖蛋白

(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1217.)

動脈粥樣硬化（AS）是一種以進行性脂質(zhì)沉積、炎性細胞浸潤及纖維組織增生為特征的慢性炎癥過程，是引起急性心腦血管事件的主要原因。腱糖蛋白-C（TN-C）是一種細胞外基質(zhì)糖蛋白，主要由巨噬細胞和平滑肌細胞合成，參與了AS相關(guān)的諸多細胞生理病理過程，包括促進各種細胞的增殖、遷移和凋亡[1]。TN-C在動脈血管壁損傷時的表達增高，對于AS斑塊的形成及破潰具有重要作用[2]。對AS不同時期斑塊內(nèi)TN-C的表達進行動態(tài)病理學觀察，有利于AS進展程度的分析，并可早期發(fā)現(xiàn)易損斑塊，為AS的預防和治療提供新的參考指標。

1 材料與方法

動物模型建立：雄性SPF級載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠（8周齡，體重 20～22 g，n=50，模型組），購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司；雄性SPF級野生型C57BL/6小鼠（8周齡，體重20～22 g，n=50，C57BL/6小鼠為同源對照鼠為對照組，購自南京醫(yī)科大學動物中心）。兩組小鼠均給予高脂飲食（經(jīng)典“西方膳食”[3]，膽固醇0.15%，脂肪21%，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司）喂養(yǎng)，飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學動物中心，動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度為22℃～25℃，相對濕度60%，光-暗周期12 h，自由飲水和進食。分別于飼養(yǎng)4、8、16、24、32周后進行血脂水平測定和病理學觀察，檢測動脈粥樣硬化模型建立情況。

主要試劑及儀器：抗鼠Tenascin-C抗體（Invitrogen公司，美國），Envision試劑盒（Dako公司，美國），全自動生化分析儀（Beckman Coulter AU5800， 美國），顯微鏡（Olympus BX43，日本）。

觀察指標：（1）血脂測定：兩組小鼠分別于飼養(yǎng)4、8、16、24、32周時處死，處死前12 h禁食不禁水。采用10%水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，摘眼球取血，常規(guī)靜置血液30 min后，離心15 min，離心力1 307×g，離心后取上清，-80℃冰箱保存。采用全自動生化分析儀測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C） 含量。（2）主動脈組織病理檢查：小鼠眼球采血后，過量麻醉處死小鼠，取出主動脈，用生理鹽水沖洗干凈，剪下鄰近主動脈弓的降主動脈1.0～1.5 cm放入10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋備用。蘇木素伊紅染色（HE染色）：各時期分別取5只(共25只)小鼠石蠟塊用切片機進行連續(xù)切片，切片厚度3 μm。每間隔5張切片取1張進行HE染色，普通光鏡觀察血管及斑塊的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進行病理形態(tài)學描述；每個標本共取3張切片用Image Pro Plus 6.0軟件測量，取斑塊面積平均值代表每只小鼠的主動脈斑塊面積。免疫組織化學分析：剩余的25只小鼠石蠟塊用于免疫組化分析，免疫組化染色采用Envision法，將切片常規(guī)脫蠟至水，微波抗原修復，磷酸鹽緩沖液（PBS，主要成分：磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉，濃度：0.01 mol/L，pH：7.4）沖洗3 min×3次，切片置于濕盒中，滴入一抗（稀釋度為1:100），置于37℃孵育箱孵育1 h，PBS沖洗3 min×3次；滴入Envision，置于37℃孵育箱孵育30 min，PBS沖洗3 min×3次，經(jīng)二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，鏡下控制染色時間，自來水沖洗終止反應，蘇木素復染，脫水，烤干，中性樹膠封片備用。利用光學顯微鏡觀察斑塊內(nèi)TN-C表達及分布情況，棕黃色為TN-C表達陽性，并用Image Pro Plus 6.0軟件計算陽性面積比（陽性反應面積／總測量面積），具體方法為每張切片隨機選取2個視野測量，取平均值代表各標本的陽性面積比值。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料采用均數(shù)±標準差表示。采用獨立樣本t檢驗對各組血脂水平進行比較。模型組組內(nèi)各時期TN-C表達量比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

兩組小鼠不同時期血脂水平比較（表1）

表1 兩組小鼠不同時期血脂水平（mmol/L, n=50,

表1 兩組小鼠不同時期血脂水平（mmol/L, n=50,

注：TC：血清總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇。對照組：高脂喂養(yǎng)的C57BL/6小鼠；模型組：高脂喂養(yǎng)的ApoE基因敲除小鼠。與同周齡對照組比較aP＜0.05

模型組ApoE-/-小 鼠 TC、LDL-C水平均較同周齡對照組小鼠升高（P＜0.05）；模型組小鼠除第4周及32周TG水平較對照組升高外（P＜0.05）， 其余時期兩組TG、HDL-C水平均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。

兩組小鼠主動脈HE染色形態(tài)學改變（圖1）

光鏡下，對照組小鼠主動脈內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞排列整齊規(guī)則，無AS斑塊形成（圖 1A）。模型組小鼠AS 4周內(nèi)膜較對照組小鼠稍增厚，管腔內(nèi)徑未見明顯異常（圖1B）；模型組小鼠AS 8周可見內(nèi)膜增厚，脂質(zhì)沉積，脂紋形成及血管內(nèi)皮突起（圖 1C）；模型組小鼠AS 16周可見明顯粥樣斑塊形成，膠原沉積，覆蓋脂質(zhì)成份形成纖維帽（圖 1D）；模型組小鼠AS 24周斑塊深部有柳葉狀膽固醇結(jié)晶堆積，纖維帽明顯變薄，斑塊隆起明顯（圖 1E）； 模型組小鼠AS 32周斑塊面積進一步增大，深部可見壞死物質(zhì)，管腔明顯狹窄（圖 1F）。

模型組小鼠AS斑塊面積比較（表2）: 從喂養(yǎng)4～32周動態(tài)觀察結(jié)果來看，對照組小鼠均無斑塊形成，而模型組小鼠自喂養(yǎng)8周起均有斑塊形成，并且隨著時間延長，模型組小鼠斑塊面積大小和斑塊面積／管腔面積比值呈增長趨勢，并且各時期相比差異均有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

兩組小鼠AS斑塊內(nèi)TN-C免疫組化結(jié)果比較:光鏡下觀察各組小鼠主動脈TN-C免疫組化染色，對照組小鼠主動脈幾乎無TN-C的表達，模型組小鼠除第4周無表達外，其余各階段均有TN-C表達（圖2）。各時期陽性面積比結(jié)果（圖3）：AS 32周小鼠斑塊內(nèi)部TN-C表達升高最顯著，高于8、16、24周小鼠 (分別為 0.49±0.07 vs 0.04±0.02、0.12±0.03、0.21±0.04)，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 各時期主動脈病理改變（蘇木素伊紅染色, ×100）

表2 模型組小鼠各時期主動脈斑塊面積、管腔面積及斑塊面積/管腔面積

表2 模型組小鼠各時期主動脈斑塊面積、管腔面積及斑塊面積/管腔面積

注：模型組：高脂喂養(yǎng)的載脂蛋白E基因敲除小鼠；*：同項各周小鼠比較P均＜0.05。采用帶拍照功能的光學顯微鏡觀察HE切片斑塊形成情況，并采集圖片，使用Image Pro Plus 6.0軟件測量圖片中斑塊面積及管腔面積

4周 5 0 0.81±0.08 0

圖2 免疫組化分析模型組各時期斑塊內(nèi)TN-C表達

圖3 模型組高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠各時期TN-C表達量的半定量分析比較（各時期n=5）

3 討論

ApoE-/-小鼠是目前公認的研究AS疾病的最經(jīng)典動物模型之一，ApoE-/-小鼠可自發(fā)形成AS，與人類AS形成過程相似[4]，高脂飲食則可加速AS進程。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠，成功建立了AS模型，與既往研究常用損傷頸總動脈的方法建立AS模型不同[5]，本研究未予外界物理損傷干預，充分模擬了正常人的AS過程，對于研究AS疾病具有較高的參考價值。研究發(fā)現(xiàn)，TC及LDL-C水平隨時間延長而持續(xù)性增高。ApoE-/-小鼠8周時已有脂紋形成，16周時纖維斑塊形成，斑塊表面有較厚的纖維帽，斑塊內(nèi)含脂質(zhì)、巨噬細胞等，隨著時間延長，可見斑塊纖維帽變薄甚至斷裂，斑塊內(nèi)大量炎癥細胞和脂質(zhì)沉積，形成不穩(wěn)定斑塊。AS斑塊的整個發(fā)展過程與既往研究相一致[6,7]。

TN-C是一種細胞外血管基質(zhì)糖蛋白，是TN家族中發(fā)現(xiàn)最早也是最重要的一個成員。最新研究發(fā)現(xiàn)：TN-C參與了血管重塑的一系列生理、病理過程，其暫時性表達上調(diào)與內(nèi)膜增生、肺動脈高壓、AS、腦血管痙攣及血管再生等密切相關(guān)[8-10]。通常情況下，TN-C在成人體內(nèi)極少表達或不表達，但在組織損傷時表達增高，組織修復完成時表達下調(diào)。既往研究表明，AS患者的冠狀動脈斑塊中TN-C表達水平增高[11]，同時冠心病患者血清中TN-C水平也明顯升高[12,13]。此外動物實驗表明高脂喂養(yǎng)的ApoE-/-小鼠AS斑塊中可檢測到TN-C的高表達[14,15]。本研究結(jié)果較既往相似，TN-C在AS斑塊的各時期均有不同水平的表達。

TN-C已成為研究心血管疾病的一個熱點，但其在AS斑塊發(fā)展過程中的動態(tài)表達鮮有報道。本研究觀察ApoE-/-小鼠AS發(fā)展的各個階段，通過比較對照組與模型組小鼠脂紋期、纖維斑塊期、以及粥樣斑塊形成期等不同時期的小鼠主動脈TN-C表達量的差異，分析TN-C與AS 疾病嚴重程度的關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，AS早期脂紋形成，主要由泡沫細胞組成，TN-C表達量很少，纖維斑塊時期，斑塊主要由纖維成分組成，TN-C表達仍較少，隨著AS的進展，尤其在富含脂質(zhì)及纖維帽斷裂的不穩(wěn)定斑塊中，TN-C的表達明顯升高。由此證明TN-C主要表達于脂質(zhì)核的周圍及破裂的纖維帽中，而在以厚的纖維成分為主的穩(wěn)定斑塊中很少表達。巨噬細胞是TN-C的主要來源之一，理論上，巨噬細胞可通過兩種機制增加炎性組織中TN-C的表達：通過多種生長因子及細胞因子介導；或是TN-C基因直接合成[11]。AS是一種持續(xù)性的慢性炎癥過程，隨著進程延長，AS進展，巨噬細胞浸潤增加，斑塊的不穩(wěn)定性增加[16，17]，TN-C表達隨之升高。由此推測，在AS發(fā)展過程中，血管壁的炎癥反應產(chǎn)生一系列細胞因子及炎性介質(zhì)，刺激巨噬細胞表達TN-C，并且TN-C的表達與AS炎癥程度相關(guān)，AS程度越重，或是斑塊越不穩(wěn)定，TN-C表達量越高。

綜上所述，高脂飲食誘導了小鼠體內(nèi)氧化應激水平的升高，誘導炎癥反應，促進泡沫細胞形成，逐步導致內(nèi)皮損傷、纖維斑塊形成、粥樣斑塊形成。在此過程中，我們認為TN-C是參與其中的重要因素之一，AS病變進展時，TN-C表達水平明顯增高，可提示斑塊的不穩(wěn)定性增高，而不穩(wěn)定斑塊與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此，對于AS發(fā)展過程中TN-C動態(tài)表達變化的研究可幫助尋找預防和治療AS疾病新的切入點。

[1] Jones PL, Jones FS. Tenascin-C in development and disease: gene regulation and cell function. Matrix Biol, 2000, 19: 581-596.

[2] Imanaka-Yoshida K. Tenascin-C in cardiovascular tissue remodeling:from development to inflammation and repair. Circ J, 2012, 76: 2513-2520.

[3] Plump AS, Smith JD, Hayek T, et al. Severe hypercholesterolemia and atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice created by homologous recombination in ES cells. Cell, 1992, 71: 343-353.

[4] Bot I, de Vries H, Korporaal SJ, et a1. Adenosine A2B receptor agonism inhibits neointimal lesion development after arterial injury in apolipoprotein E-deficient mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012,32: 2197-2205.

[5] 余飛, 黃東雅, 堵翠, 等. ApoE-/-小鼠頸總動脈粥樣硬化動物模型的建立. 中華實驗外科雜志, 2013, 30: 401-402.

[6] 盛沖霄, 黎紅華, 劉康, 等. 大鼠動脈粥樣硬化病變各階段內(nèi)皮依賴性舒張功能以及親環(huán)素A表達的變化. 中國循環(huán)雜志, 2015,30: 576-579.

[7] 劉劍剛, 董國菊, 史大卓, 等. 載脂蛋白E基因敲除小鼠不同周齡動脈粥樣硬化的病理變化. 中國動脈硬化雜志, 2005, 13: 689-692.

[8] Imanaka-Yoshida K, Yoshida T, Miyagawa-Tomita S. Tenascin-C in development and disease of blood vessels. Anat Rec (Hoboken), 2014,297: 1747-1757.

[9] Fujimoto M, Shiba M, Kawakita F, et al. Epidermal growth factorlike repeats of tenascin-C-induced constriction of cerebral arteries via activation of epidermal growth factor receptors in rats. Brain Res,2016, 1642: 436-444.

[10] Midwood KS, Hussenet T, Langlois B, et al. Advances in tenascin-C biology. Cell Mol Life Sci, 2011, 68: 3175-3199.

[11] Wallner K, Li C, Shah PK, et al. Tenascin-C is expressed in macrophage-rich human coronary atherosclerotic plaque. Circulation,1999, 99: 1284-1289.

[12] Yang JH, Ren F. Clinical implications of tenascin-C and OX40 ligand in patients with acute coronary syndrome. Biomed Rep, 2014, 2: 132-136.

[13] Ozmen Yildiz P, Yildiz I, Ozmen C, et al. Relation between coronary artery calcium score and serum tenascin-C level in patients without known coronary artery disease. Acta Cardiol, 2015, 70: 633-639.

[14] Golledge J, Clancy P, Maguire J, et al. The role of tenascin C in cardiovascular disease. Cardiovasc Res, 2011, 92: 19-28.

[15] von Lukowicz T, Silacci M, Wyss MT, et al. Human antibody against C domain of tenascin-C visualizes murine atherosclerotic plaques ex vivo. J Nucl Med, 2007, 48: 582-587.

[16] 白瑞娜, 郗瑞席, 馮志博. 巨噬細胞與動脈粥樣硬化-亞型及功能.中國循環(huán)雜志, 2014, 29: 393-395.

[17] 張小娟, 任滿意, 曹曉青, 等. 趨化因子受體6基因敲除對載脂蛋白E基因敲除小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成的影響. 中國循環(huán)雜志,2014, 29: 300-303.

Dynamic Expressions of Tenascin-C at Different Phases of Atherosclerosis in ApoE-/-Mice

LI Yan, SONG Jia-cheng, YAN Hai-lang, HUANG Jun-wen, LU Yu, MA Zhan-long, SHI Hai-bin.
Department of Radiology, The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing (210029), Jiangsu, China

MA Zhan-long, Email: mazhanlong@126.com

Objective: To investigate the dynamic expressions of tenascin-C (TN-C) at different phases of atherosclerosis in ApoE-/-mice.

Methods: Our research included in 2 groups: ApoE-/-group, n=50 SPF male mice with ApoE-/-and Control group, n=50 wild male C57BL/6 mice. Atherosclerosis model was established by high fat diet in both groups. The mice were sacrificed at 4, 8, 16, 24 and 32 weeks, blood lipids were examined, pathologic changes of plaque were observed by microscope for quantitative analysis and TN-C expressions in atherosclerosis plaque were measured by immunohistochemistry.

Results: Compared with Control group, ApoE-/-group had elevated blood levels of total cholesterol (TC) and low density lipoprotein cholesterol (LDL-C), both P＜0.05. In ApoE-/-group, plaque area and the ratio of plaque area/lumen area were increasing upon prolonged modeling time, all P＜0.05; TN-C expressions were increasing by progress of atherosclerosis,the highest TN-C expression was found at 32 weeks of modeling (0.49±0.07) which was higher than it was at 8 weeks(0.04±0.02), 16 weeks (0.12±0.03) and 24 weeks (0.21±0.04), all P＜0.05.

Conclusion: TN-C expression was increasing with plaque progress which might be related to the development of atherosclerosis and plaque instability.

Atherosclerosis; Apolipoprotein E; Mice, knockout; Tenascin

國家自然科學基金面上項目（81471723）；江蘇省自然科學基金面上項目（BK20131446）

210029 江蘇省南京市，南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 放射科（李燕、宋佳成、黃君文、陸鈺、馬占龍、施海彬）；南京醫(yī)科大學附屬江蘇盛澤醫(yī)院 放射科（嚴海浪）

李燕 碩士研究生 主要從事分子影像研究 Email：liyan_stu@126.com 通訊作者：馬占龍 Email：mazhanlong@126.com

R541.4

A

1000-3614（2017）12-1217-05

10.3969/j.issn.1000-3614.2017.12.018

2016-12-27）

（編輯：梅平）