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      玉米漿和表面活性劑添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

      2017-12-23 05:09:05,,,,,
      發(fā)酵科技通訊 2017年4期
      關(guān)鍵詞:生物素吐溫谷氨酸

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      (1.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 博士后科研工作站,河南 項城 466200;2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院, 天津 300457;3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津 300457)

      玉米漿和表面活性劑添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

      韓洪軍1,高立棟1,張順棠1,李燕軍1,2,3,陳寧2,3

      (1.蓮花健康產(chǎn)業(yè)集團(tuán)股份有限公司 博士后科研工作站,河南 項城 466200;2.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院, 天津 300457;3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津 300457)

      首先研究了添加玉米漿和表面活性劑吐溫對谷氨酸棒狀桿菌GKGD發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸的影響.在此基礎(chǔ)上,通過采用添加過量玉米漿,同時在產(chǎn)酸期添加吐溫60的培養(yǎng)方法,顯著提高了α-酮戊二酸的產(chǎn)量.結(jié)果表明:相比于吐溫80,吐溫60更有利于α-酮戊二酸的分泌;在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加6 mL/L玉米漿,在發(fā)酵10 h加入1 mL/L吐溫60,可以使α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度達(dá)到17.9 g/L.

      谷氨酸棒桿菌;α-酮戊二酸;玉米漿;表面活性劑

      α-酮戊二酸作為三羧酸循環(huán)的重要中間代謝物,連接著細(xì)胞內(nèi)的碳氮代謝.同時其本身也是一種多功能的有機(jī)酸,在醫(yī)藥、食品和化工領(lǐng)域具有廣泛的用途[1-2].α-酮戊二酸可以通過化學(xué)法和微生物發(fā)酵法合成,目前化學(xué)法占主導(dǎo)地位[3].然而,化學(xué)合成法多以氰化物為底物,存在產(chǎn)生有毒副產(chǎn)物、反應(yīng)路線長和需要催化劑等缺點.相比之下,微生物發(fā)酵法清潔環(huán)保,發(fā)展?jié)摿薮骩4].目前研究者們多以解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)來發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸[5-6],然而其發(fā)酵周期長、副產(chǎn)物多.由于α-酮戊二酸是谷氨酸生物合成的直接前體,本研究團(tuán)隊在前期工作中從谷氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌GKG-047出發(fā),敲除谷氨酸脫氫酶1和2,通過雙階段pH和生物素控制策略實現(xiàn)了谷氨酸棒桿菌高產(chǎn)α-酮戊二酸,且生產(chǎn)強度為目前報道最高[7].后續(xù),筆者團(tuán)隊研究了強化磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶[8]和減少代謝副產(chǎn)物[9]對α-酮戊二酸積累的影響.

      α-酮戊二酸生產(chǎn)菌株谷氨酸棒狀桿菌GKGD為生物素缺陷型.生物素是脂肪酸合成所需的輔酶,是細(xì)胞正常生長所必需的,其限量供應(yīng)會影響脂肪酸的合成和細(xì)胞膜的通透性[7].因此,谷氨酸和α-酮戊二酸發(fā)酵過程采取生物素亞適量的工藝,既能滿足發(fā)酵前期菌體必要的生長,又在大量產(chǎn)酸期保證細(xì)胞高通透性和產(chǎn)物分泌.然而,這種發(fā)酵工藝菌體生物量往往不會太高,筆者嘗試采用高生物素促進(jìn)菌體生長,以及添加表面活性劑促進(jìn)產(chǎn)物分泌的發(fā)酵新工藝.課題組前期研究表明:玉米漿中含有高質(zhì)量濃度的生物素(約6 μg/mL),既可以為菌體生長提供豐富的有機(jī)氮源,又調(diào)控著細(xì)胞的轉(zhuǎn)型和產(chǎn)物的分泌.當(dāng)玉米漿添加濃度過高時,菌體大量繁殖而細(xì)胞不能轉(zhuǎn)型,產(chǎn)酸水平很低.吐溫作為一種常見的表面活性劑,在發(fā)酵過程中添加吐溫,可以改變細(xì)胞膜的通透性.通過搖瓶發(fā)酵分別研究玉米漿和吐溫添加濃度對α-酮戊二酸產(chǎn)量的影響,旨在探究新的α-酮戊二酸發(fā)酵控制工藝,即通過添加高生物素促進(jìn)菌體生物量積累,同時添加吐溫增加細(xì)胞通透性以解決細(xì)胞不能轉(zhuǎn)型的問題.

      1 材料與方法

      1.1 菌 株

      α-酮戊二酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌GKGD,保藏于天津科技大學(xué)代謝工程研究室.

      1.2 培養(yǎng)基

      1.2.1 斜面培養(yǎng)基

      牛肉膏10 g/L,酵母膏5 g/L,蛋白胨4 g/L,玉米漿5 mL/L,谷氨酸鈉2.5 g/L,NaCl 2.5 g/L,瓊脂25 g/L.pH 7.0~7.2,0.1 MPa滅菌20 min.

      1.2.2 種子培養(yǎng)基

      葡萄糖20 g/L,玉米漿20 mL/L,KH2PO43 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L,MnSO4·7H2O 0.01 g/L,MgSO4·7H2O 0.3 g/L,尿素5 g/L,pH 7.0~7.2,0.1 MPa滅菌20 min.

      1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

      葡萄糖80 g/L,(NH4)2SO45 g/L,MgSO4·7H2O 0.6 g/L,KH2PO41.2 g/L,味精10 g/L,玉米漿3 mL/L,酵母粉5 g/L,消泡劑1 滴,pH 7.0~7.2,0.1 MPa滅菌15 min.

      1.3 主要儀器

      生化培養(yǎng)箱,廣東省醫(yī)療器械廠;振蕩培養(yǎng)箱,上海智誠分析儀器制造有限公司;752型紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;SBA-40C生物傳感儀,山東省科學(xué)院;高效液相色譜儀,日本島津公司.

      1.4 培養(yǎng)方法

      1.4.1 菌種活化

      取斜面保藏菌種劃線接種于活化斜面培養(yǎng)基,32 ℃恒溫靜置培養(yǎng)10~14 h.

      1.4.2 種子培養(yǎng)

      用接種針取一環(huán)生長良好的活化斜面種子,轉(zhuǎn)接入裝有30 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,9 層紗布封口,置于旋轉(zhuǎn)式搖床上,200 r/min,32 ℃振蕩培養(yǎng)8 h.

      1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

      按照體積分?jǐn)?shù)10%接種量,將培養(yǎng)8 h的種子液接種于含有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中,9 層紗布封口,置于旋轉(zhuǎn)式搖床上,200 r/min,32 ℃振蕩培養(yǎng)32 h.

      1.5 分析方法

      1.5.1 pH測定

      采用pH 6.4~8.0精密pH試紙測定.

      1.5.2 菌體OD測定

      取發(fā)酵液用蒸餾水稀釋20 倍,采用752型分光光度計測定600 nm波長下的吸光度.

      1.5.3 殘?zhí)菧y定

      采用SBA-40C生物傳感儀測定.

      1.5.4 α-酮戊二酸產(chǎn)量測定

      發(fā)酵液13 000 r/min離心2 min,取上清液稀釋100 倍,利用高效液相色譜法測定α-酮戊二酸含量.色譜條件:色譜柱為伯樂Aminex HPX-87H,流動相為5 mmol/L的硫酸,流速0.5 mL/min,柱溫30 ℃,檢測波長215 nm,進(jìn)樣量20 μL.

      2 結(jié)果與討論

      2.1 玉米漿添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

      玉米漿是一種用亞硫酸浸泡玉米而得的浸泡水濃縮物,含有豐富的氨基酸、核酸、維生素和無機(jī)鹽等,其中生物素對谷氨酸棒桿菌GKGD產(chǎn)α-酮戊二酸尤為重要.生物素作為菌體細(xì)胞膜合成的必要元素,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞膜的通透性,同時也是羧化酶系等關(guān)鍵酶的輔酶,對細(xì)胞中心代謝具有重要的調(diào)控作用.GKGD來源于生物素亞適量型谷氨酸生產(chǎn)菌GKG-047,α-酮戊二酸作為合成谷氨酸的直接前體,生物素含量在其發(fā)酵過程中也起著重要的調(diào)控作用[7].筆者在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加1,3,5,7,9 mL/L的玉米漿,菌體生物量和α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度如圖1所示.

      柱狀—α-酮戊二酸;曲線—OD600圖1 玉米漿對菌體生長和α-酮戊二酸質(zhì)量濃度的影響 Fig.1 Effects of corn steep liquor addition on bacterial growth and α-ketoglutarate production

      從圖1可知:當(dāng)玉米漿添加量較少時,α-酮戊二酸質(zhì)量濃度隨著玉米漿添加量的增加而顯著提高,當(dāng)玉米漿添加量為3 mL/L時,α-酮戊二酸的積累量達(dá)到最大值.然而,當(dāng)玉米漿添加量繼續(xù)升高時,α-酮戊二酸質(zhì)量濃度逐漸降低.玉米漿中所含有的生物素是菌體生長以及α-酮戊二酸積累的關(guān)鍵因素.玉米漿添加量不足時,導(dǎo)致菌體量過少,從而使得產(chǎn)酸嚴(yán)重下降;若添加玉米漿過量,則導(dǎo)致菌體生長過盛,能量代謝流向細(xì)胞生長,而不利于產(chǎn)酸.所以添加適量的玉米漿,對于菌體的生長以及酮戊二酸的代謝積累至關(guān)重要.綜上所述,玉米漿的最適添加體積分?jǐn)?shù)為3 mL/L,此時α-酮戊二酸質(zhì)量濃度為12.1 g/L.

      2.2 表面活性劑添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

      吐溫(或聚山梨酯)為非離子型表面活性劑,可以改善細(xì)胞的通透性,改善細(xì)胞與氧的接觸,從而促進(jìn)酶和代謝產(chǎn)物的分泌與生產(chǎn).但吐溫添加時間過早不利于菌體的生長,所以將吐溫的添加時間確定為菌體生長的穩(wěn)定期(發(fā)酵10 h以后),既能確保發(fā)酵過程中具有一定的菌體量,同時又可以增強細(xì)胞將α-酮戊二酸分泌到胞外的能力.筆者比較研究了兩種表面活性劑(吐溫60、吐溫80)促進(jìn)菌體分泌α-酮戊二酸的作用.兩種表面活性劑在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加體積分?jǐn)?shù)分別為0.5,1,2,5 mL/L,α-酮戊二酸的產(chǎn)量如圖2所示.

      圖2 表面活性劑吐溫60/吐溫80對α-酮戊二酸質(zhì)量濃度的影響 Fig.2 Effects of surfactants (Tween 60/Tween 80) addition on α-ketoglutarate production

      由圖2可知:吐溫80和吐溫60雖然都是表面活性劑,但對于膜透性的作用卻有明顯區(qū)別,在添加量為0.5,1,2 mL/L時,吐溫60對于菌體分泌α-酮戊二酸的效果更加明顯.當(dāng)吐溫60添加量為1 mL/L時,α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度最高,達(dá)到11.7 g/L.

      2.3 玉米漿和表面活性劑的復(fù)合添加對α-酮戊二酸發(fā)酵的影響

      玉米漿會影響發(fā)酵過程中菌體量的多少和代謝流的分配,在菌體生長穩(wěn)定期加入表面活性劑可以增強細(xì)胞分泌α-酮戊二酸的能力.因此,為了達(dá)到通過增加菌體量來提高α-酮戊二酸產(chǎn)量的目的,在發(fā)酵過程中添加玉米漿,同時在穩(wěn)定期加入吐溫60來促進(jìn)α-酮戊二酸的分泌.在初始發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同體積分?jǐn)?shù)玉米漿,在發(fā)酵10 h時添加不同體積分?jǐn)?shù)的吐溫60.以添加3 mL/L玉米漿、1 mL/L吐溫60為對照,在玉米漿添加量為6 mL/L和9 mL/L時,均分別添加1 mL/L和2 mL/L的吐溫60,α-酮戊二酸的產(chǎn)量如圖3所示.

      從圖3可知:當(dāng)采取上述單獨優(yōu)化確定的最適體積分?jǐn)?shù)的玉米漿(3 mL/L)和吐溫60(1 mL/L)組合時,α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度為12.8 g/L,略微高于單獨添加實驗的最高值;當(dāng)添加6 mL/L玉米漿,且添加吐溫60時,α-酮戊二酸積累量顯著提高,吐溫60添加量為1 mL/L時,α-酮戊二酸質(zhì)量濃度達(dá)到最高值(17.9 g/L);然而,當(dāng)玉米漿添加體積分?jǐn)?shù)提高到9 mL/L時,且添加1 mL/L或2 mL/L吐溫60,α-酮戊二酸產(chǎn)量提高不明顯.因此,采用添加過量玉米漿,同時添加適量吐溫60的培養(yǎng)方式,可以有效提高產(chǎn)物的積累和分泌.

      1—玉米漿3 mL/L,吐溫 60 1 mL/L;2—玉米漿6 mL/L,吐溫60 1 mL/L;3—玉米漿6 mL/L,吐溫60 2 mL/L;4—玉米漿9 mL/L,吐溫60 1 mL/L;5—玉米漿 9 mL/L,吐溫60 2 mL/L 圖3 玉米漿和吐溫60復(fù)合添加對α-酮戊二酸質(zhì)量濃度的影響 Fig.3 Combinational addition of corn steep liquor and Tween 60 on α-ketoglutarate production

      3 結(jié) 論

      在谷氨酸棒狀桿菌發(fā)酵產(chǎn)α-酮戊二酸的過程中,玉米漿的添加量對α-酮戊二酸生產(chǎn)至關(guān)重要,在穩(wěn)定期添加一定量的吐溫60能夠促進(jìn)α-酮戊二酸的分泌.通過添加過量玉米漿以促進(jìn)菌體生長,同時在穩(wěn)定期(產(chǎn)酸期)添加適量吐溫60,可以

      有效提高α-酮戊二酸的產(chǎn)量.最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基中玉米漿的添加量為6 mL/L,在發(fā)酵開始10 h后加入1 mL/L的吐溫60,α-酮戊二酸的質(zhì)量濃度達(dá)到最高值17.9 g/L.

      [1] SAUER M, PORRO D, MATTANOVICH D, et al. Microbial production of organic acids: expanding the markets[J]. Trends in biotechnology, 2008,26(2):100-108.

      [2] OTTO C, YOVKOVA V, BARTH G. Overproduction and secretion of α-ketoglutaric acid by microorganisms[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2011,92(4):689-695.

      [3] STOTTMEISTER U, AURICH A, WILDE H, et al. White biotechnology for green chemistry: fermentative 2-oxocarboxylic acids as novel building blocks for subsequent chemical syntheses[J]. Journal of industrial microbiology and biotechnology, 2005,32(11/12):651-664.

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      [9] 趙巖,黃龍輝,李娟,等.谷氨酸棒桿菌代謝副產(chǎn)物對α-酮戊二酸積累的影響[J].發(fā)酵科技通訊,2016,45(4):215-219.

      Influenceoftheadditionofcornsteepliquorandsurfactantsonfermentativeproductionofα-ketoglutarate

      HAN Hongjun1, GAO Lidong1, ZHANG Shuntang1, LI Yanjun1,2,3, CHEN Ning2,3

      (1.Post-Doctoral Research Center, Lotus Health Group Co., Ltd., Xiangcheng 466200, China; 2.College of Biotechnology, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457, China; 3.National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology, Tianjin 300457, China)

      In this study, the influence of corn steep liquor and surfactants addition on fermentative production of α-ketoglutarate byCorynebacteriumglutamicumGKGD was investigated. The production of α-ketoglutarate was significantly improved by adding corn steep liquor in the initial fermentation medium and adding appropriate amount of Tween 60 at the beginning of acid-producing phase. The results indicated that Tween 60 was more effective in promoting the secretion of α-ketoglutarate than Tween 80. The α-ketoglutarate production achieved the highest value of 17.9 g/L with 6 mL/L of corn steep liquor and 1 mL/L of Tween 60 added.

      Corynebacteriumglutamicum; α-ketoglutarate; corn steep liquor; surfactant

      2017-09-01

      中國博士后科學(xué)基金資助項目(2016M601269)

      韓洪軍(1966—),男,河南沈丘人,高級工程師,研究方向為發(fā)酵工程和農(nóng)產(chǎn)品深加工,E-mail:lhhhj5539@163.com.

      TQ92

      A

      1674-2214(2017)04-0216-04

      朱小惠)

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