華蟾酥毒基對(duì)U2OS細(xì)胞增殖和凋亡的影響△

余鈴，郭衛(wèi)春，代國(guó)

(武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430060)

·基礎(chǔ)研究·

華蟾酥毒基對(duì)U2OS細(xì)胞增殖和凋亡的影響△

余鈴，郭衛(wèi)春，代國(guó)*

(武漢大學(xué) 人民醫(yī)院 骨科，湖北 武漢 430060)

目的觀察華蟾酥毒基對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS增殖和凋亡的影響，從而探討華蟾酥毒基誘導(dǎo)骨肉瘤凋亡的可能機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS，CCK-8法檢測(cè)不同濃度華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系U2OS增殖的抑制作用，Annexin V-FITC/PI 染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，Hoechst 33258 染色，顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR法檢測(cè)華蟾酥毒基對(duì)凋亡通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果CCK-8檢測(cè)顯示華蟾酥毒基可抑制人骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖，并具有時(shí)間和劑量依賴性，在華蟾酥毒基濃度為20 nmol·L-1時(shí)，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強(qiáng)；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示華蟾酥毒基可明顯誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡；Hoechst 33258 染色可見凋亡小體；逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR分析顯示經(jīng)華蟾酥毒基處理后的骨肉瘤細(xì)胞系U2OS表達(dá)Caspase-3，8，9較用藥前明顯增高。結(jié)論華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤細(xì)胞系U2OS的增殖有顯著抑制作用，并可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，其作用機(jī)制可能與激活Caspase依賴的凋亡途徑有關(guān)。

華蟾酥毒基；骨肉瘤；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

骨肉瘤是最常見的骨的原發(fā)性惡性腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，主要發(fā)生于長(zhǎng)骨遠(yuǎn)端，目前主要的治療方法是行新輔助化療后，再手術(shù)切除。得益于此治療方案，使得骨肉瘤患者的5年生存率提高到了60%[1-2]。誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是治療的一個(gè)重要目標(biāo)，近年來，許多學(xué)者把目光放在尋找新的藥物上，以尋求更好的治療效果。

華蟾素是中華大蟾蜍全皮經(jīng)過水化萃取而制成的中藥制劑，具有清熱解毒、利水消腫、化瘀潰堅(jiān)等作用，其化學(xué)成分復(fù)雜，包括吲哚生物堿、還原糖、氨基酸以及蟾蜍毒素、蟾蜍色胺等。華蟾素具有低毒、抗癌譜廣等諸多優(yōu)點(diǎn)，目前已成為我國(guó)臨床上應(yīng)用較廣的抗腫瘤中藥制劑之一[3-4]。華蟾酥毒基(cinobufagin，CB)作為華蟾素中提取的主要毒性配基之一，亦具有良好的抗腫瘤作用。先前有許多研究證實(shí)華蟾素可以通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖誘導(dǎo)其凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)肝癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有良好的抗癌功效[5-8]。但將華蟾酥毒基應(yīng)用于骨肉瘤的研究并不多見。本實(shí)驗(yàn)探討了華蟾酥毒基對(duì)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞的增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用，并檢測(cè)了其對(duì)凋亡相關(guān)mRNA表達(dá)的調(diào)控，為進(jìn)一步明確華蟾酥毒基的抗腫瘤機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料

DMEM培養(yǎng)基、新鮮小牛血清(Hyclone公司)；華蟾酥毒基(美國(guó)Sigma公司)，用二甲基亞砜(DMSO)溶解配制成0.01 mol·L-1的儲(chǔ)備液分裝備用，使用時(shí)用無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋到所需濃度，DMSO的含量小于1‰；Cell Counting Kit-8(CCK-8，日本同仁化學(xué)研究所)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)；DMSO、Hoechst 33258及胰蛋白酶(美國(guó)Sigma公司)；TRIzol試劑(美國(guó)Invitrogen Life Technologies公司)；RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；2X SYBR綠色熒光染料反應(yīng)混合液(美國(guó)Ambino公司)。Caspase-3，8，9引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含10%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素、100 μg·mL-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，每24 h換液，用0.25%含EDTA胰酶消化液隔天消化、傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 CCK-8法檢測(cè)華蟾酥毒基對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，制成1×105·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h待其貼壁后加入終濃度分別為20、50、100、150、200 nmol·L-1的華蟾酥毒基，陰性對(duì)照組加等體積的DMEM培養(yǎng)液處理(每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔)，每個(gè)濃度處理24、48、72 h后，加入CCK-8 10 μL 培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度(A)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按公式(1)計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率=(A給藥組-A空白組)/(A陰性對(duì)照組-A空白組)×100%

(1)

2.3 Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)華蟾酥毒基對(duì)U2OS細(xì)胞凋亡的影響

收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤U2OS細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞密度為2×105·mL-1，按2 mL/孔接種于6孔板，37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞完全貼壁后吸棄原培養(yǎng)液，加入終濃度分別為20、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基的新鮮DMEM培養(yǎng)液，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。藥物作用48 h后，各組重復(fù)3次，經(jīng)胰酶消化，收集細(xì)胞于流式管內(nèi)，1500 r·min-1、4 ℃離心5 min，棄上清液，4 ℃預(yù)冷的磷酸緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞1次，用稀釋好的結(jié)合緩沖液[結(jié)合緩沖液-去離子水(1∶10)]500 μL重懸細(xì)胞。每管依次加Annexin V-FITC 5 μL，再加入5 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫下避光孵育5 min，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。以Annexin V為橫坐標(biāo)，PI為縱坐標(biāo)，左上象限代表壞死細(xì)胞碎片，左下象限代表活細(xì)胞(Annexin V和PI雙陰性)、右下象限代表凋亡早期(Annexin V陽(yáng)性，PI陰性)、右上象限代表凋亡晚期(Annexin V和PI雙陽(yáng)性)。

2.4 Hoechst 33258 檢測(cè)細(xì)胞凋亡

選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS細(xì)胞接種于6孔板，采用經(jīng)CCK-8和流式檢測(cè)作用較明顯的20、50 nmol·L-1的華蟾酥毒基分別作用，含等體積DMSO的DMEM培養(yǎng)基作為對(duì)照。收集作用后48 h的細(xì)胞，PBS洗2次，用75%的乙醇水4 ℃固定5 min，PBS沖洗，Hoechst 33258 染色10 min 后置于熒光顯微鏡下觀察。

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析細(xì)胞Caspase mRNA表達(dá)的變化

收集不同濃度華蟾酥毒基作用48 h后的U2OS細(xì)胞約1×107個(gè)，應(yīng)用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA含量。使用RevertAid第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。cDNA(5 μL；1∶100)被添加到12.5 μL的2X SYBR綠色熒光染料反應(yīng)混合液，使得總體積為25 μL，以GAPDH為內(nèi)參，通過觀察擴(kuò)增曲線來測(cè)量Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9的CT值(擴(kuò)增曲線達(dá)到閾值時(shí)的循環(huán)圈數(shù))。數(shù)據(jù)處理采用相對(duì)定量中的2-ΔΔCt計(jì)算結(jié)果來表示各個(gè)基因表達(dá)的水平，最后取3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值作為最終結(jié)果，具體引物見表1。

表1 引物信息表

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，用不同濃度華蟾酥毒基處理后，在24～72 h內(nèi)U2OS細(xì)胞生長(zhǎng)增殖均受到明顯抑制(與對(duì)照組相比，P<0.05或P<0.01)，并且抑制作用呈劑量依賴性，在濃度為20 nmol·L-1時(shí)即出現(xiàn)抑制細(xì)胞增殖的作用，在一定范圍內(nèi)隨著華蟾酥毒基劑量的增加和作用時(shí)間的延長(zhǎng)抑制效果增加，各個(gè)劑量及作用時(shí)間對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的抑制作用均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見圖1。

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05，**P<0.01；下同。圖1 CCK-8法檢測(cè)華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞的抑制作用

3.2 華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡的影響

通過Annexin V-FITC和PI雙染標(biāo)記法檢測(cè)，結(jié)果顯示，隨著華蟾酥毒基濃度的增加，凋亡率逐漸升高，華蟾酥毒基50、100、200 nmol·L-1組處理48 h時(shí)，其凋亡率分別為(25.4±1.3)%、(52.7±0.8)%、(65.9±2.8)%，與空白對(duì)照組(2.1±0.3)%比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤U2OS細(xì)胞的凋亡率

3.3 Hoechst 33258 熒光染色法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變

熒光顯微鏡下對(duì)照組人骨肉瘤U2OS細(xì)胞核完整，著色均勻，熒光呈彌散狀，比較黯淡(見圖3)。華蟾酥毒基(20、50 nmol·L-1)處理48 h 后組細(xì)胞染色質(zhì)凝聚，細(xì)胞核裂解，著色不規(guī)則，部分濃聚，呈現(xiàn)出細(xì)胞凋亡的典型變化即核碎裂，產(chǎn)生凋亡小體(見圖3)。

圖3 Hoechst 33258 熒光染色法顯示不同濃度華蟾酥毒基處理后細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變

3.4 華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Caspase依賴的凋亡通路相關(guān)mRNA表達(dá)的影響

不同濃度的華蟾酥毒基作用于U2OS細(xì)胞48 h后，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)Caspase依賴的凋亡信號(hào)通路相關(guān)mRNA Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，20、50、100 nmol·L-1的華蟾酥毒基均能夠提高Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9 mRNA的表達(dá)水平，且隨著濃度的增加，促凋亡mRNA的表達(dá)量不斷增高，見圖4。

圖4 不同濃度華蟾酥毒基對(duì)骨肉瘤細(xì)胞Caspase依賴的凋亡通路相關(guān)mRNA的表達(dá)

4 討論

盡管早期手術(shù)治療結(jié)合新輔助化療已很大程度提高骨肉瘤患者的5年生存率(60%～70%)，但目前仍有20%～40%的患者死于骨肉瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。如何延緩其生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步提高其治療效果仍然是目前骨肉瘤治療的難題之一[9-12]。傳統(tǒng)化療藥因其毒副作用高和耐藥性等原因，常導(dǎo)致化療失敗。因此尋找一種具有高抗腫瘤活性的新型藥物，能夠協(xié)助或者替代傳統(tǒng)化療藥物促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，以減少傳統(tǒng)化療藥物的使用時(shí)間和使用劑量，降低其毒副作用或逆轉(zhuǎn)耐藥性的發(fā)生，從而提高骨肉瘤患者的耐受性和長(zhǎng)期生存率是目前骨肉瘤的研究熱點(diǎn)之一[13-14]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，中藥蟾皮或蟾酥的主要成分華蟾酥毒基是一種甾體類，具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性而得到廣泛的關(guān)注。華蟾素作為抗腫瘤中藥制劑，在腫瘤治療方面應(yīng)用很廣，對(duì)肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤都有一定的治療作用[8，15-17]。此外，相關(guān)毒理研究還證實(shí)其具有副作用小、使用安全的特點(diǎn)。目前認(rèn)為華蟾酥毒基主要通過線粒體或Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡通路、上調(diào)Caspases蛋白酶誘導(dǎo)凋亡、抑制Notch信號(hào)通路、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、調(diào)節(jié)凋亡抑制基因的表達(dá)等多種機(jī)制誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)腫瘤起到治療作用[3，18-22]。

在本實(shí)驗(yàn)中，采用不同濃度的華蟾酥毒基體外作用于人骨肉瘤系U2OS，通過CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，發(fā)現(xiàn)不同濃度華蟾酥毒基可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，且其存活率與華蟾酥毒基的濃度和作用時(shí)間均有關(guān)，當(dāng)華蟾酥毒基濃度為20 nmol·L-1，作用時(shí)間48 h時(shí)抑制作用明顯增強(qiáng)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖1)。本研究與國(guó)外其他學(xué)者研究結(jié)果相似[21]，提示華蟾酥毒基可以抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)骨肉瘤細(xì)胞起到殺傷作用。

凋亡在腫瘤治療中起著重要作用，凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有很大關(guān)系，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤治療有重要意義，許多抗癌藥物都是通過誘導(dǎo)凋亡而發(fā)揮殺傷癌細(xì)胞的作用。本文流式分析結(jié)果顯示，華蟾酥毒基在體外試驗(yàn)中誘導(dǎo)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡，且其凋亡率隨著華蟾酥毒基濃度的增加而增加(見圖2)。Hoechst 33258 可透過細(xì)胞膜并對(duì)DNA染色而發(fā)出明顯而強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光，常常用來進(jìn)行凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)檢測(cè)的研究。本文通過熒光顯微鏡下觀察顯示20、50 nmol·L-1的華蟾酥毒基處理后可誘導(dǎo)骨肉瘤U2OS細(xì)胞發(fā)生凋亡，細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、碎裂，以及凋亡小體。以上這些結(jié)果都說明，華蟾酥毒基可以誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡機(jī)制失調(diào)是惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制之一[23]，在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行過程中，天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶(Caspase)家族起著非常重要的作用，這種凋亡方式稱為Caspase依賴的細(xì)胞凋亡。Caspase家族包含多個(gè)成員，在細(xì)胞凋亡過程中起著非常關(guān)鍵的作用。正常情況下Caspase以無活性的酶原形式存在，在促凋亡因素的作用下級(jí)聯(lián)激活而觸發(fā)凋亡。本文檢測(cè)不同濃度華蟾酥毒基對(duì)Caspase-3、8、9 mRNA表達(dá)的影響，從圖4的結(jié)果中可以看到U2OS細(xì)胞中Caspase-3、8、9 mRNA的表達(dá)在加入華蟾酥毒基處理后均有不同程度明顯增高，提示華蟾酥毒基誘導(dǎo)的U2OS細(xì)胞凋亡與Caspase級(jí)聯(lián)活化有關(guān)，并可能同時(shí)涉及線粒體通路和死亡受體通路。

綜上，華蟾酥毒基具有抑制骨肉瘤U2OS細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其效應(yīng)呈時(shí)間和濃度依賴性。華蟾酥毒基可能通過Caspase依賴的凋亡途徑誘導(dǎo)了U2OS骨肉瘤細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制涉及上調(diào)Caspase mRNA表達(dá)，最終可能與啟動(dòng)了細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程有關(guān)。總之，本研究為華蟾酥毒基治療骨肉瘤提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，下一步我們將進(jìn)行更加深入的在體實(shí)驗(yàn)研究。

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EffectofCinobufaginonProliferationandApoptosisofU2OS

YU Ling，GUO Weichun，DAI Guo*

(DepartmentofOrthopedics，RenminHospitalofWuhanUniversity，Wuhan430060，China)

Objective:To investigate the effect of cinobufagin on the growth inhibition，apoptosis and the expression of Caspases mRNA in human osteosarcoma cell line U2OS．MethodsOsteosarcoma cell line U2OS was culturedinvitro． Cell proliferation was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8).The cells stained by Annexin V and PI were observed by flow cytometry ( FCM) for apoptosis．Hoechst 33258 was used to detect the morphological change of apoptotic cells.The mRNA expression of Caspases in U2OS was observed by RT-PCR．ResultsThe proliferation of human osteosarcoma cell line U2OS could be inhibited and apoptosis could be induced by cinobufagin．The inhibition rate and apoptosis rate were different with the different concentrations．The inhibition rate and apoptosis rate of U2OS cells rose significantly when the concentration of cinobufagin was over 20 nmol·L-1．Apoptotic body could be observed by Hoechst 33258 dying．The Caspases mRNA expression of human osteosarcoma cell line U2OS increased obviously by using cinobufagin.ConclusionCinobufagin could significantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of human osteosarcoma cell line U2OS．Its mechanism of action may be related to activation of Caspase dependent apoptosis pathway．

Cinobufagin；osteosarcoma；proliferation；apoptosis

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.9.008

國(guó)家自然科學(xué)基金(81341078)

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代國(guó)，住院醫(yī)師，研究方向：脊柱外科與骨腫瘤；E-mail：daiguo720@sina.com

2017-03-06)