龔 玲，劉代順，朱紅蘭

(遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563002)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

PPAR-γ在小鼠肺成纖維細(xì)胞中的抗纖維化作用

龔 玲，劉代順，朱紅蘭

(遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院 呼吸內(nèi)科，貴州 遵義 563002)

目的探討過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPAR-γ)在小鼠肺成纖維細(xì)胞中的抗纖維化作用及機(jī)制。方法體外培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞(C57BL/6)，以轉(zhuǎn)化生長因子-2(TGF-β2)刺激其轉(zhuǎn)換為肌纖維母細(xì)胞，使用不同濃度PPAR-γ配體羅格列酮(RSG)抑制轉(zhuǎn)化，采用細(xì)胞生長計(jì)數(shù)檢測細(xì)胞增殖；PCR檢測PPAR-γ mRNA、血小板衍生生長因子-β(PDGFR-β) mRNA及成纖維細(xì)胞生長因子R1(FGF-R1) mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果RSG抑制C57BL/6細(xì)胞增殖(P<0.05)；PPAR-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨RSG濃度增加而表達(dá)增加，PDGF-β mRNA隨RSG濃度增加而表達(dá)減少，F(xiàn)GF-R1 mRNA轉(zhuǎn)錄水平與RSG無關(guān)(P>0.05)。結(jié)論RSG抑制TGF-β2誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細(xì)胞生物學(xué)特性改變，其可能機(jī)制與使PPAR-γ活化及PDGF-β表達(dá)下調(diào)相關(guān)。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ；肺纖維化；轉(zhuǎn)化生長因子β2；羅格列酮；血小板衍生生長因子β

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一種進(jìn)展性、致死性、不可逆的慢性肺纖維化疾病[1-2]。臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難，并伴隨肺功能下降[3]。雖然經(jīng)過藥物治療，但此病仍預(yù)后不佳，確診后的平均生存時(shí)間為2～5年[4-6]，因此它被認(rèn)為比癌癥更致命[7]。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β,TGF-β)誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化是肺纖維化發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵點(diǎn)。羅格列酮(rosiglitazone,RSG)是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(Peroxisome Proliferater activated Receptor gamma,PPAR-γ)的配體，常作為胰島素增敏劑用于糖尿病治療[8]，近年發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ配體參與某些器官纖維化進(jìn)程。本研究應(yīng)用RSG探討PPAR-γ在小鼠肺成纖維細(xì)胞中的抗纖維化作用機(jī)制，為臨床用藥進(jìn)一步提供更為全面的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞(CRL-6013TM)購于美國American Type Culture Collection(ATCC)公司，實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞均為第3～4代。

1.2 藥物 羅格列酮(R2408)購于美國Sigma Aldrich公司，10 mg/支，羅格列酮純度>98%，分子式：C18H19N3O3S，分子量： 357.43。羅格列酮使用二甲基亞楓溶解，刺激濃度分別為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L。

1.3 試劑 TGF-β2(美國 R&D Systems)， Trizol試劑(美國Invitrogen) ，PCR試劑盒(日本TaKaRa)，PCR引物合成 (中國 生工生物工程(上海)股份有限公司)，DMEM(美國 Hyclone)，瓊脂糖(美國Cambrex公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞復(fù)蘇 從-150 ℃液氮中取出裝有C57BL/6細(xì)胞株的凍存管，立即放入37 ℃恒溫水浴箱，輕搖使之快速溶解；酒精消毒凍存管，開封后將細(xì)胞懸液移入塑料離心管中，加入DMEM培養(yǎng)基10 mL，混勻后低速離心5 min，小心棄上清液；重新加入DMEM(含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)基重新混勻細(xì)胞，應(yīng)用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，活細(xì)胞率95%，以每瓶1×106個(gè)/mL接種到10 cm2培養(yǎng)皿中，放置于5%CO2、飽和濕度、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.4.2 細(xì)胞傳代 C57BL/6細(xì)胞為貼壁生長細(xì)胞，觀察細(xì)胞生長覆蓋培養(yǎng)瓶底壁大于80%以上即可以傳代；自動(dòng)吸液器吸除培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液；加入0.25%胰蛋白酶1 mL，輕輕搖勻使消化液流遍所有細(xì)胞表面，放置在37 ℃孵箱內(nèi)消化；30 s～2 min后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大、細(xì)胞懸浮，立即加入10% FBS-P/S DMEM 9 mL終止消化；混勻吹散細(xì)胞，從培養(yǎng)瓶底部一邊開始，依順序反復(fù)輕柔吹打貼壁細(xì)胞，使細(xì)胞脫離瓶壁后形成細(xì)胞懸液；將細(xì)胞懸液分裝于新的培養(yǎng)瓶，加入培養(yǎng)基；隔2～3 d換液，細(xì)胞長至70%～80%融合狀態(tài)時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 細(xì)胞藥物處理 參照文獻(xiàn)[9-10]TGF-β2刺激濃度為10 ng/mL，二甲基亞楓溶解的RSG為5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L。

1.4.4 RNA提取及PCR 使用Trizol試劑參照說明書提取總RNA，測定A260/A280吸光度判斷純度和濃度后取2 μL總RNA使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄DNA。PCR反應(yīng)過程：反應(yīng)體系25 μL，94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)PCR循環(huán)，最后72 ℃總延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物，凝膠成像儀拍照。

表1 PCR引物序列

基因名稱 序列大小(bp)PPAR-γPPARγ-F，5′-GCCCTTTACCACAGTTGATTTC-3′252PPARγ-R，5′-GATGCTTTATCCCCACAGACTC-3′FGF-R1FGFR1-F，5′-GGAGGAGAGAGTGAGAGGATGA-3′333FGFR1-F，5′-TGAGTGGTGTGGGTTTGAATAA-3′PDGFR-βPDGFR-β-F，5′-GTGGTCCTTACCGTCATCTCTC-3′312PDGFR-β-R，5′-CTTCTCGCTACTTCTGGCTGTC-3′β-actinβ-actin-F，5′-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3′500β-actin-R，5′-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3′

1.4.5 細(xì)胞生長計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn) 相同密度的細(xì)胞分別接種于10 cm2培養(yǎng)皿中；細(xì)胞分為空白組、TGF-β2組(10 ng/mL)、羅格列酮組(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L)，TGF-β210 ng/mL +羅格列酮組(5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L及40 μmol/L)，培養(yǎng)24、48、72 h后用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 RSG對C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，在無TGF-β2刺激，C57BL/6細(xì)胞增殖隨RSG濃度梯度增加和時(shí)間梯度增加受到抑制(*P=0.000)；在有TGF-β2刺激，C57BL/6細(xì)胞增殖同樣也隨RSG濃度梯度增加和時(shí)間梯度增加而受到抑制(**P=0.001)，說明羅格列酮存在抑制C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞生長的作用(見表2，圖1)。

組別空白對照5μmol/LRSG10μmol/LRSG20μmol/LRSG40μmol/LRSG無TGF刺激4．45±0．013．82±0．01?3．18±0．03?2．50±0．03?2．09±0．03?有TGF刺激5．49±0．034．88±0．03??3．93±0．03??3．07±0．04??2．34±0．02??

A：未使用TGF-β2刺激； B：使用TGF-β210 ng/mL刺激。圖1 PSG對C57BL/6小鼠肺成纖維細(xì)胞增殖影響

1:空白;2:TGF-β2;3:TGF-β2+RSG 5 μm;4:TGF-β2+RSG 10 μm;5:TGF-β2+RSG 20 μm;6:TGF-β2+RSG 40 μm。圖2 PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA、FGFR1mRNA在不同RSG刺激下表達(dá)

2.2 RSG對PPAR-γmRNA、PDGFR-βmRNA、FGF-R1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，PPAR-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨RSG濃度增加表達(dá)上調(diào)(*P=0.002)。PDGFR-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平在TGF-β2刺激下表達(dá)上調(diào)，當(dāng)加入RSG后，PDGFR-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平隨RSG濃度增加表達(dá)下調(diào)(**P=0.001)。FGFR1 mRNA表達(dá)水平在TGF-β2刺激下增加，當(dāng)加入RSG后，F(xiàn)GFR1 mRNA表達(dá)水平無明顯變化。說明羅格列酮增加PPAR-γ mRNA轉(zhuǎn)錄，抑制PDGF-β mRNA轉(zhuǎn)錄，對FGF mRNA轉(zhuǎn)錄無作用(見表3，圖2)。

表3 PPAR-γ mRNA/PDGFR-β mRNA/FGFR1 mRNA光密度值

組別空白對照TGF刺激組TGF+5μmol/LRSGTGF+10μmol/LRSGTGF+20μmol/LRSGTGF+40μmol/LRSGPPAR-γmRNA0．47±0．020．67±0．010．83±0．02?0．91±0．01?0．95±0．00?0．97±0．03?FGFR1mRNA0．19±0．010．41±0．010．42±0．010．40±0．030．41±0．010．41±0．00PDGFR-βmRNA0．34±0．010．71±0．01??0．44±0．04??0．42±0．02??0．40±0．03??0．39±0．05??

3 討論

IPF是一種原因不明的進(jìn)行性疾病，是局限于肺部的彌漫性肺泡炎和肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，最終導(dǎo)致以肺纖維化伴蜂窩狀改變?yōu)樘卣鞯募膊?，因其進(jìn)展快、死亡率高，被世界衛(wèi)生組織稱為肺系疑難疾病。IPF病人經(jīng)抗纖維化等藥物治療后，癥狀無改善，病死率無明顯下降[11-14]。因此，對 IPF發(fā)病機(jī)制及治療靶點(diǎn)研究已成為國際熱點(diǎn)。

PPAR是一類配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子超家族成員，具有多種生物學(xué)效應(yīng)，在脂質(zhì)代謝、抑制炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分化、抑制細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮重要作用[15-17]。羅格列酮是目前研究最多的PPAR-γ經(jīng)典合成配體[18-19]，是PPAR-γ的高選擇性、強(qiáng)效激動(dòng)劑，與PPAR-γ親和力最大，越來越多的證據(jù)顯示，羅格列酮不僅在炎癥反應(yīng)免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用，還參與某些器官纖維化進(jìn)程，如皮膚和肝臟等[21]。我們實(shí)驗(yàn)組研究表明[13-14]，姜黃素通過刺激PPAR-γ表達(dá)增加從而抑制PDGF-β下游信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)可能是阻止肺纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。此外，Kulkarni[23]等研究表明，PPAR-γ配體RSG通過抑制FAK下游的PI3K/AKT信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)來阻止肺纖維化發(fā)生。Deng[22]等研究表明，羅格列酮還可通過抑制TGF-β下游的SMAD3/4信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)來抑制肺纖維化發(fā)生。Lin[24]等學(xué)者證實(shí)PPAR-γ促使PDGF-β表達(dá)下調(diào)后可進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及凋亡增加，細(xì)胞增殖及活力受到抑制，同樣可以阻礙肺維化形成。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們大膽推測，在TGF-β2誘導(dǎo)C57BL/6細(xì)胞分化過程中，TGF-β2促使PDGFR-β表達(dá)上調(diào)從而促使C57BL/6細(xì)胞增殖，然而RSG卻通過刺激PPAR-γ表達(dá)增加來阻止PDGFR-β活化，導(dǎo)致細(xì)胞分化受到影響，纖維化形成減少，這可能與PDGF-β下游的PI3K/AKT、ERK及JNK信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)受抑制導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯及凋亡增加有關(guān)，但是，為驗(yàn)證這一機(jī)制是否合理，我們還需要通過實(shí)驗(yàn)來深入探討。

綜上所述，PPAR-γ可能存在抗肺纖維化的作用，具體機(jī)制可能與PPAR-γ活化及PDGF-β表達(dá)下調(diào)相關(guān)。PPAR-γ配體對肺纖維化治療可能存在潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

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[收稿2017-09-11;修回2017-10-12]

(編輯：譚秀榮)

AntifibroticeffectsofPPAR-γinmouselungfibroblasts

GongLing,LiuDaishun,ZhuHonglan

(Department of Respiratory Medicine，The Third Affiliated Hospital of Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563002)

ObjectiveTo explore the role and mechanism of PPAR-γ in inhibiting the fibrosis process of mouse lung fibroblasts.MethodsMouse lung fibroblasts from C57BL/6 mice were cultured,stimulated for transformation with transforming growth factor β2,and inhibited for transition by different concentrations of rosiglitazone (RSG).Cell proliferation was detected by cell counting ,PCR was employed to examine transcriptional expression of PPAR-γ,platelet derived growth factorR-β (PDGFR-β) ,and fibroblast growth factor R1(FGFR1).ResultsRSG inhibited C57BL/6 fibroblast proliferation (P<0.05).The relative levels of PPAR-γ mRNA and PPAR-γ protein increased with the increasing concentration of RSG,and the expression of PDGFR-β mRNA decreased with the increasing concentration of RSG.The concentration alteration of RSG had nothing to do with the expression of FGFR1 mRNA(P<0.05).ConclusionRSG can inhibit the induction of TGF-β2 in alterations of biological characteristics of C57BL/6 fibroblasts.Possibly,it activates the PPAR-γ and downregulates the expression of PDGF-β.

peroxisome proliferator-activated receptor γ;pulmonary fibrosis;transforming growth factor β2;rosiglitazone;platelet derived growth factor β

貴州省衛(wèi)計(jì)委基金資助項(xiàng)目(NO：gzwkj2013-1-003)。

劉代順，男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：慢性呼吸道疾病的分子機(jī)制；胸部腫瘤的靶向治療，E-mail:ldsdoc@126.com。

R563

A

1000-2715(2017)06-0626-05