姬愛華，王廣新 ，史傳奎 ，周愛妍，高 蕾

(1.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院 皮膚科，山東 濟(jì)南 250022；2.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院 兒研所，山東 濟(jì)南 250022)

臨床醫(yī)學(xué)研究

苦參洗劑對(duì)兒童特應(yīng)性皮炎皮損定植金黃色葡萄球菌影響的體內(nèi)外研究

姬愛華1，王廣新2，史傳奎1，周愛妍1，高 蕾1

(1.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院 皮膚科，山東 濟(jì)南 250022；2.山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院 兒研所，山東 濟(jì)南 250022)

目的通過體內(nèi)外研究探討苦參洗劑對(duì)特應(yīng)性皮炎(AD)皮損定植金黃色葡萄球菌的影響。方法選取AD患兒45例，采用隨機(jī)、自身左右對(duì)照的方法，以左側(cè)(或右側(cè))上肢(或下肢)的典型皮損作為治療組靶皮損，對(duì)側(cè)相應(yīng)皮損則作為對(duì)照組皮損。治療組靶皮損以苦參洗劑和基礎(chǔ)潤(rùn)膚處理，對(duì)照組皮損僅基礎(chǔ)潤(rùn)膚處理，分別在治療0、7、14 d比較兩組患者皮損處的金葡菌定植密度。檢測(cè)苦參洗劑體外抑菌活性。測(cè)定生物被膜的形成以及生物被膜內(nèi)菌數(shù)。結(jié)果治療后第7天和14天，治療組靶皮損處的金葡菌定植密度與對(duì)照組相比均有顯著下降，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。經(jīng)24 h培養(yǎng)后，苦參洗劑能夠明顯抑制金葡菌和耐甲氧西林金葡菌生物被膜的形成(P<0.05)。結(jié)論苦參洗劑能有效抑制金葡菌、耐藥菌生物被膜的形成，表現(xiàn)出良好的抗菌效果，是發(fā)揮抗AD療效的機(jī)制之一，這為開發(fā)適合AD兒童使用的中藥外用制劑提供了理論基礎(chǔ)。

苦參洗劑；兒童；特應(yīng)性皮炎；金黃色葡萄球菌

特應(yīng)性皮炎(Atopic dermatitis，AD)是一種與遺傳相關(guān)的、慢性炎癥性皮膚病，其病程長(zhǎng)、復(fù)發(fā)率高，多在兒童和青少年人群中起病[1]。中醫(yī)藥外治法治療濕疹皮炎類的皮膚病有著悠久的歷史。

苦參洗劑是一種外用中藥復(fù)方制劑，該方主要由苦參、黃柏、黃連、地膚子、蛇床子、百部6味中藥構(gòu)成，其功效主要是清熱解毒、燥濕止癢。為了評(píng)價(jià)苦參洗劑對(duì)兒童AD的療效，本研究以兒童AD患者皮損處金黃色葡萄球菌定植密度為指標(biāo)，在體研究苦參洗劑對(duì)AD兒童的療效，同時(shí)采用體外抑菌試驗(yàn)，評(píng)價(jià)苦參洗劑對(duì)金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的抑菌活性，以期闡釋苦參洗劑治療AD可能的機(jī)理。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取就診于本院皮膚科門診的兒童AD患者，共計(jì)45例，其中男30例，女15例，年齡3～12歲，平均年齡(7.1±1.2)歲；病程0.3～9.1年，平均(4.2±0.8)年。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有入選患者均符合Hanifin和Rajka的AD臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，皮損呈左右對(duì)稱分布；金葡菌培養(yǎng)陽(yáng)性；監(jiān)護(hù)人已簽署知情同意書。治療前2周，45例患者均未使用過任何抗菌劑以及局部或系統(tǒng)使用過抗生素。排除標(biāo)準(zhǔn)：已知對(duì)苦參洗劑中所含成分過敏者；急性期滲出嚴(yán)重、不宜通過外用藥進(jìn)行治療的；有嚴(yán)重心、肝、腎等方面的疾??；其他皮膚病需要合并治療的患者。

1.2 試劑 用苦參洗劑中藥免煎顆粒(深圳華潤(rùn)三九醫(yī)藥貿(mào)易有限公司)加蒸餾水配制溶液，濃度為1 g/mL。體外抑菌試驗(yàn)陽(yáng)性藥：注射用夫西地酸鈉(成都諾迪康生物制藥有限公司，批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20058151)，以生理鹽水配制成含夫西地酸鈉2%溶液，待用。

1.3 治療方法 采用隨機(jī)、自身左右對(duì)照的方法，隨機(jī)選取兒童AD患者左側(cè)(或右側(cè))上肢(或下肢)的典型皮損作為治療組的靶皮損，而其對(duì)側(cè)相應(yīng)皮損作為對(duì)照組皮損。其中，治療組靶皮損部位以苦參洗劑外洗或者濕敷處理，15 min/次，2次/d?？鄥⑾磩┲委熀笠詽?rùn)膚、保濕劑外搽做基礎(chǔ)潤(rùn)膚治療。對(duì)照組僅作基礎(chǔ)潤(rùn)膚處理。以14 d為一個(gè)療程，分別在治療0、7、14 d根據(jù)皮損表面微生物密度計(jì)算方法檢測(cè)各患者皮損處的金葡菌定植密度，考察苦參洗劑對(duì)AD的治療效果。

1.4 體外抑菌試驗(yàn) 根據(jù)常規(guī)皮損取材和細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定方法[3]，以無菌棉簽擦拭收集治療組靶皮損和對(duì)照組皮損處細(xì)菌，將棉簽置于4 mL生理鹽水中多次震蕩后，取5 μL菌液接種于瓊脂培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。經(jīng)過常規(guī)細(xì)菌鑒定和藥敏分析后，記錄所有分離出的金葡菌的菌落數(shù)目，計(jì)算每平方厘米的菌落數(shù)。

將金葡菌和耐甲氧西林金葡菌兩種菌株在M-H瓊脂培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)24 h，選取典型菌落于預(yù)先配置好的M-H液體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，過夜，調(diào)整菌液濃度為3×1010CFU/mL，備用[3-4]。將增菌后的菌液密度稀釋至105CFU/mL，采用二倍遞減濃度稀釋法測(cè)定苦參洗劑對(duì)金葡菌和耐甲氧西林金葡菌兩種菌株抑菌作用的最小抑菌濃度(minimum bacteriostatic concentration，MIC)MIC值。取滅菌試管36支，編號(hào)。每12支為1組，共3個(gè)重復(fù)組[5]，1～10號(hào)管為濃度依次遞減的苦參洗劑藥液2 mL，其濃度分別為1、0.5、 0.25、 0.125、 0.062 5、 0.031 3、 0.015 6、 0.007 8、 0.003 9、0.001 9 g/mL，各樣品pH范圍為8.32±0.15。再向各管中分別加入0.1 mL稀釋后的菌液。第11號(hào)管作為金葡菌陰性對(duì)照組，其中僅加入M-H液體培養(yǎng)基和苦參洗劑原液各1 mL；第12號(hào)管為金葡菌陽(yáng)性對(duì)照組，其中僅加入M-H液體培養(yǎng)基2 mL和菌液0.1 mL。所有試管均于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后取出，觀察各試管溶液澄清度以評(píng)價(jià)細(xì)菌生長(zhǎng)情況，以細(xì)菌不生長(zhǎng)的最低藥液濃度為苦參洗劑的MIC值。

同法操作，考察苦參洗劑對(duì)耐甲氧西林金葡菌的體外抑菌活性，以及陽(yáng)性藥夫西地酸鈉對(duì)兩種菌株的抑菌活性，夫西地酸鈉的濃度梯度設(shè)置分別為0.36、0.32、 0.28、 0.24、 0.20、 0.16、 0.12、 0.08、 0.04、0.02 mg/L[6]。

1.5 生物被膜體外模型制備[7]取金葡菌典型單菌落接種于2 mL M-H液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日用M-H液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液密度至1×107CFU/mL，并取200 μL加入96孔板中。37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，之后洗滌3次，自然風(fēng)干后即得金葡菌的早期生物被膜體外模型。同法操作，制備耐甲氧西林金葡菌的體外生物被膜模型。

1.6 生物被膜形成的影響[8]在96孔板中加入金葡菌菌液和苦參洗劑，4個(gè)復(fù)孔，苦參洗劑的終濃度為1×MIC、1/2×MIC、1/4×MIC、1/8×MIC、1/16×MIC、1/32×MIC，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。采用結(jié)晶紫染色半定量法測(cè)定生物被膜的量：每孔洗滌3次，風(fēng)干后加入0.1%結(jié)晶紫染色20 min，洗凈，加入200 μL 95%乙醇以去掉黏附細(xì)菌結(jié)合的結(jié)晶紫，于595 nm處測(cè)定OD值。同法操作，考察苦參洗劑對(duì)耐甲氧西林金葡菌生物被膜形成的影響。

1.7 生物被膜存活菌數(shù)的測(cè)定[9]體外制備金葡菌生物被膜模型，加入含有苦參洗劑的M-H液體培養(yǎng)基，終濃度為2×、10×、50×和100×MIC，將不含苦參洗劑的M-H液體培養(yǎng)基作為對(duì)照。37 ℃孵育24 h，洗滌3次，加入200 μL M-H液體培養(yǎng)基，輕輕刮下生物被膜，45 Hz頻率下超聲5 min，釋放生物被膜內(nèi)的細(xì)菌，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。同法操作，考察耐甲氧西林金葡菌生物被膜內(nèi)的存活菌數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 臨床療效評(píng)價(jià) 治療前后患者皮損處金葡菌定植密度的統(tǒng)計(jì)結(jié)果。治療前(第0天)，兩組患者靶皮損處的金葡菌定植密度無顯著性差異(P>0.05)，對(duì)治療后的效果比較無影響；經(jīng)苦參洗劑外洗或濕敷治療后第7天和14天，治療組靶皮損處的金葡菌定植密度與對(duì)照組相比均有顯著下降，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，見表1)，說明經(jīng)過一個(gè)療程的治療，苦參洗劑對(duì)兒童AD表現(xiàn)出了良好的療效。

組別定植密度(0d)定植密度(7d)定植密度(14d)治療35099．90±20290．4410080．45±5842．41?2746．91±970．35?對(duì)照39117．28±20765．5032497．61±19243．3649605．59±35283．05

*與對(duì)照組相比P<0.001。

2.2 體外抑菌活性評(píng)價(jià) 經(jīng)24 h培養(yǎng)后，可以明顯發(fā)現(xiàn)，苦參洗劑在濃度大于0.015 6 g/mL時(shí)，對(duì)金葡菌和耐藥菌兩種菌株的生長(zhǎng)均產(chǎn)生較好的抑制作用(見表2)，由此得出苦參洗劑對(duì)金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的MIC值是0.015 6 g/mL。而陽(yáng)性對(duì)照組夫西地酸鈉對(duì)金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的MIC分別是0.2 mg/L、0.24 mg/L。

表2苦參洗劑對(duì)金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的MIC測(cè)定結(jié)果

菌株苦參洗劑濃度(g/mL)10．50．250．1250．06250．03130．01560．00780．00390．0019陽(yáng)性陰性MIC(g/mL)SA-------++++-0．0156MRSA-------++++-0．0156

SA：金葡菌；MRSA：耐甲氧西林金葡菌；“-”表示無細(xì)菌生長(zhǎng)；“+”表示有細(xì)菌生長(zhǎng)。

2.3 對(duì)生物被膜形成的影響 從表3可知，苦參洗劑能夠劑量依賴性的抑制金葡菌和耐甲氧西林金葡菌生物被膜的形成；在高濃度下(1×MIC，1/2×MIC或1/4×MIC)，OD值與對(duì)照組比較均顯著性降低(P<0.05)，表明能顯著抑制金葡菌和耐甲氧西林金葡菌生物被膜的形成；且在1×MIC濃度下對(duì)金葡菌和耐甲氧西林金葡菌生物被膜的抑制率均高于80%。

SA：金葡菌；MRSA：耐甲氧西林金葡菌；*與對(duì)照組相比P<0.05。

2.4 生物被膜存活菌數(shù)的測(cè)定 苦參洗劑作用于金葡菌和耐甲氧西林金葡菌生物被膜24 h后，兩個(gè)菌株的存活菌數(shù)均明顯下降(P<0.05)。如表4所示，與對(duì)照組相比，在2×MIC～100×MIC的藥物作用下，金葡菌中的存活菌落數(shù)分別下降了1.57、0.86、1.03和1.21 log10CFU/mL；耐甲氧西林金葡菌菌數(shù)分別下降了0.84、1.73、1.91和2.02 log10CFU/Ml,與對(duì)照相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明苦參洗劑能減少金葡菌和耐甲氧西林金葡菌生物被膜內(nèi)的菌數(shù)，對(duì)已形成生物被膜具有抑制作用。

菌株02×MIC10×MIC50×MIC100×MICSA7．68±0．046．11±0．11?6．82±0．15?6．65±0．14?6．47±0．14?MRSA7．66±0．136．82±0．17?5．93±0．13?5．75±0．17?5．64±0．26?

SA：金葡菌；MRSA：耐甲氧西林金葡菌；*與對(duì)照組相比P<0.05。

3 討論

隨著社會(huì)的快速發(fā)展，在環(huán)境污染、氣候變化等外界因素的影響下，AD的患病率大大升高，其中90%為兒童和青少年患者，并且3歲以內(nèi)兒童患有AD的人數(shù)約占44%[10]。由于AD可從多方面影響病人的心理狀態(tài)以及生活質(zhì)量，如影響睡眠，令病人產(chǎn)生焦慮、缺乏自信、難以融入集體生活等，對(duì)人們的健康生活尤其是對(duì)青少年兒童的健康成長(zhǎng)構(gòu)成了極大的障礙[11]。已有很多相關(guān)研究證實(shí)，細(xì)菌感染在AD的發(fā)病進(jìn)程中扮演著十分重要的角色，而其中金葡菌是重要因素之一[12]，大多數(shù)AD患者皮損處存在較為嚴(yán)重的金葡菌定植現(xiàn)象，其金葡菌的檢出率可至80%～100%[13-14]。因此在治療AD疾病時(shí)，通常采取的治療策略以抗金葡菌為主。局部外用抗生素是一種主要治療AD的手段。但由于抗生素的濫用，也令金葡菌的耐藥菌株漸漸增多起來，其中耐甲氧西林金葡菌在AD患者中的檢出率可達(dá)到10%～25%。耐甲氧西林金葡菌可對(duì)現(xiàn)有多種抗生素產(chǎn)生明顯的耐藥性，嚴(yán)重影響了疾病的治療效果[15]。生物被膜(bacterial biofilm，BF)是細(xì)菌粘附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等物質(zhì)，將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物，是導(dǎo)致耐藥的重要因素之一，也是引起慢性難治性感染的主要原因之一[16-17]。目前研究表明，中藥在抗生物被膜方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，許多單味或復(fù)方中藥都具有抑制或破壞細(xì)菌生物被膜的作用[18-20]，這成為了中藥抗菌治療的新思路。

苦參洗劑是我院專家由大量臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)而得的經(jīng)驗(yàn)方，一直以來在治療濕疹、瘙癢癥等皮膚病中取得了較好的臨床療效[21-23]。為了系統(tǒng)分析和評(píng)價(jià)苦參洗劑是否對(duì)兒童AD患者有較明顯的治療作用，我們對(duì)45例兒童AD患者進(jìn)行了隨機(jī)、自身對(duì)照的治療方法，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過14d的治療后，苦參洗劑可明顯改善各AD患者的病情，顯著降低皮損處金葡菌的定植密度(P<0.001)，且無不良反應(yīng)發(fā)生。另外，在體外抑菌試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)苦參洗劑可顯著抑制金葡菌和耐甲氧西林金葡菌的生長(zhǎng)，其MIC值為0.0156 g/mL。從BF的研究結(jié)果來看，苦參洗劑對(duì)生物被膜的形成具有明顯的抑制作用，這可能是因?yàn)槠錅p弱了細(xì)菌的起始黏附的結(jié)果；同時(shí)，在苦參洗劑的作用下，生物被膜內(nèi)的存活菌數(shù)也呈顯著性下降，因此，苦參洗劑對(duì)已形成的生物被膜也具有一定的抑制作用，但并不能完全清除生物被膜內(nèi)的細(xì)菌，這可能是細(xì)胞外多種基質(zhì)阻礙藥物的滲入所導(dǎo)致的。綜上所述，苦參洗劑可以通過抑制金葡菌和耐藥菌生物被膜的形成，從而表現(xiàn)出良好的抗菌效果，由此推測(cè)苦參洗劑顯著的抗菌作用可能是其發(fā)揮抗AD療效的機(jī)制之一，這為開發(fā)適合兒童使用的、安全有效的中藥外用制劑提供了理論基礎(chǔ)。

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[收稿2017-09-26;修回2017-10-31]

(編輯：王福軍)

Impactofanti-inflammatorysophoramoisturizinglotiononstaphylococcusaureusatopicdermatitisinchildren:invitroandinvivoresearches

JiAihua1,WangGuangxin2,ShiChuankui1,ZhouAiyan1,GaoLei1

(1.Department of Dermatology, Qilu Children’s Hospital of Shandong University, Jinan Shandong 250022,China；2.Institute of Pediatrics，Qilu Children’s Hospital of Shandong University, Jinan Shandong 250022,China)

ObjectiveTo study Sophora lotion on atoptic dermatitis (AD) in children, develop suitable compound preparation for pediatric use.MethodsSelect 45 AD children, use a randomized, self-control method to detect lesions of each patient and staphylococcus aureus colonization density; Collect target skin lesion bacteria in treated group and the control group for in vitro study. The number of colonies per square centimeter, biofilm formation and the number of living bacteria in biofilm were assayed.ResultsAt 0，7 and 14 days after sophora lotion washing or wet treatment, staphylococcus aureus colonization density of target lesions was significantly decreased, compared to control group. The results are statistically significant (P<0.001); After 24 h incubation, sophora lotion inhibited the biofilm formation of staphylococcus aureus and methicillin-resistant staphylococcus aureus obviously(P<0.05).ConclusionSophora lotion is effective to inhibit biofilm of staphylococcus aureus and methicillin-resistant staphylococcus aureus to exhibit excellent antibacterial effect, which is one of the mechanisms for the anti-AD efficacy, and provides a theoretical basis for the development of traditional Chinese medicine external preparations for children use.

sophora lotion; children; atopic dermatitis; staphylococcus aureus

R758.2

A

1000-2715(2017)06-0641-05