陳 冰，林雅軍，馬雅鑾，李玉梅，薛 欣，胡鏡清△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2. 北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學(xué)中心，北京 100730)

【實(shí)驗(yàn)研究】

祛痰、化瘀和祛痰化瘀方對氧化低密度脂蛋白誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及凋亡功能的影響?

陳 冰1，林雅軍2，馬雅鑾1，李玉梅1，薛 欣1，胡鏡清1△

(1. 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所，北京 100700； 2. 北京醫(yī)院國家老年醫(yī)學(xué)中心，北京 100730)

目的：觀察祛痰、化瘀和祛痰化瘀方對ox-LDL損傷HUVEC增殖及凋亡功能的影響。方法：建立HUVEC ox-LDL損傷模型，采用MTT檢測法、AnnexinV-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)和Western blot 檢測法，觀察方藥對HUVEC增殖率、凋亡率及與增殖、凋亡相關(guān)蛋白VEGFR、P66、P53、Bcl-2、BAX表達(dá)的影響。結(jié)果：在細(xì)胞增殖方面，祛痰化瘀方能增加HUVEC吸光度，祛痰方、祛痰化瘀方可上調(diào)HUVEC VEGFR的表達(dá)水平，ox-LDL作用下4種方劑均可增加HUVEC吸光度并上調(diào)VEGFR表達(dá)水平。在細(xì)胞凋亡方面，祛痰方、化瘀方和祛痰化瘀方均能降低P66的表達(dá)水平；ox-LDL作用下，HUVEC Bcl-2表達(dá)降低，BAX、P66表達(dá)升高；祛痰化瘀方等4種方劑對早期、晚期及總凋亡率都有極大改善，且均可降低BAX的表達(dá)水平；祛痰方組、化瘀方組和祛痰化瘀方可降低P66的表達(dá)水平，祛痰化瘀方可提高Bcl-2的表達(dá)水平，Ox-LDL及4種方劑均對P53的表達(dá)水平無明顯影響。結(jié)論：祛痰、化瘀和祛痰化瘀方及基礎(chǔ)方均可在不同程度上通過促進(jìn)增殖、抗凋亡達(dá)到對抗HUVEC氧化損傷的作用，其中祛痰化瘀方的效果最顯著。

祛痰方、化瘀方和祛痰化瘀方；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；氧化低密度脂蛋白；增殖；凋亡

動(dòng)脈粥樣硬化[1](atherosclerosis，As)表現(xiàn)為動(dòng)脈內(nèi)膜的脂質(zhì)、血液成分的沉積，平滑肌細(xì)胞及膠原纖維增生，并伴有壞死及鈣化等不同程度病變，是嚴(yán)重危害人類健康的常見病。中醫(yī)認(rèn)為，As的基本病機(jī)是痰濁、血瘀，“水谷津液若化得其正則成津血，化失其正則為痰濁”。痰濁即成則隨氣升降，無處不到，痰性稠濁注于血脈，則血行凝澀，久則成瘀。認(rèn)為As多為痰瘀互阻型，因此臨床治療此類患者多使用痰瘀同治法。

本文使用的痰瘀同治方藥為我所胡鏡清研究員多年來用于治療高脂血癥/As 與心腦疾病等痰瘀互結(jié)證的經(jīng)驗(yàn)方，經(jīng)過拆分后分為祛痰方、化瘀方、祛痰化瘀方、基礎(chǔ)方4組。本研究以ox-LDL作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)后，觀察這4種方藥對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC增殖、凋亡功能的影響。

1 材料

1.1 藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)所用藥材均購自北京同仁堂藥店共4種組方：基礎(chǔ)方(黨參、干姜、麻黃等)、祛痰方(法半夏、陳皮、茯苓等加基礎(chǔ)方)、化瘀方(桃仁、紅花、生地等加基礎(chǔ)方)和祛痰化瘀方(祛痰方加化瘀方加基礎(chǔ)方)。Ⅱ型膠原酶、低糖DMEM、胎牛血清購自美國Hyclone公司，內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Sciencell公司，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒購自美國BD公司，ox-LDL購自北京協(xié)生生物科技有限公司。血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)-2、P66、P53、Bcl-2、BAX、β-actin一抗購自美國Cell Signaling Technology公司，免疫印記法(Western Blot) 發(fā)光液和免疫印跡PVDF 膜購自美國Millipore公司。

1.2 動(dòng)物分組及含藥血清的制備

清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±20)g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號SCX-(軍)2012-0004)。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組、基礎(chǔ)方組、祛痰方組、化瘀方組、祛痰化瘀方組5組各10只。大鼠給藥前禁食不禁水4 h，各組藥物加8倍量水浸泡1 h，煎煮30 min濾去藥液，藥渣加6倍量水再煎煮30 min過濾，合并2次濾液，以蒸餾水調(diào)至適當(dāng)濃度備用。各組按成人臨床日用量等效劑量的2倍灌胃，正常組以去離子水代替，每天2次共5次；末次灌胃1.5 h后，腹主動(dòng)脈取血，3000 rpm/min離心分離血清，56 ℃滅活30 min，0.22 μm無菌濾膜過濾分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆?。水?次合并藥液過濾濃縮，濃縮成含生藥量2 g/ml，給藥時(shí)以蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.3 儀器

1300 series A2超凈工作臺購自美國Thermo公司，F(xiàn)luor Chen FC2電泳儀購自美國Cell Biosciences公司，IX-70倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，F(xiàn)ACS Callibur流式細(xì)胞儀購自美國BD公司，3K15高速低溫離心機(jī)購自美國Sigma公司，-80 ℃低溫冰箱購自美國Thermo公司。

2 方法

2.1 HUVEC的原代培養(yǎng)

取長度約20 cm的新鮮臍帶，用37 ℃生理鹽水沖洗臍靜脈后，以0.1%的Ⅱ型膠原酶灌注臍靜脈20 min，收集灌注液，800 r/min離心10 min，收集內(nèi)皮細(xì)胞至25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入5 ml含10%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基在37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將3～5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及用藥方法

本研究分為正常組、模型組、基礎(chǔ)方組、祛痰方組、化瘀方組和祛痰化瘀方組6組。正常組用含20%正常組大鼠血清+2%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，模型組用含ox-LDL(100 mg/L)+20%正常組大鼠血清+2%胎牛血清內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，基礎(chǔ)方組用含ox-LDL(100 mg/L)+20%基礎(chǔ)方組大鼠血清+2%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，祛痰方組用含ox-LDL(100 mg/L)+20%祛痰方組大鼠血清+2%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，化瘀方組用含ox-LDL(100 mg/L)+20%化瘀方組大鼠血清+2%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，祛痰化瘀方組用含ox-LDL(100 mg/L)+20%祛痰化瘀方組大鼠血清+2%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基。

2.3 MTT法檢測不同藥物對HUVEC增殖的影響

取對數(shù)生長期HUVEC，將細(xì)胞以4000 /孔的密度接種于96孔板中，待細(xì)胞融合生長至80%后，以PBS沖洗，加入不同濃度的4組(基礎(chǔ)方組、祛痰方組、化瘀方組和祛痰化瘀方組)含藥血清培養(yǎng)基。用藥方案如下：正常組即0%含藥血清組(0%含藥方組大鼠血清+20%正常組大鼠血清)，5%含藥血清組(5%含藥方組大鼠血清+15%正常組大鼠血清)，10%含藥血清組(10%含藥方組大鼠血清+10%正常組大鼠血清)，15%含藥血清組(15%含藥方組大鼠血清+5%正常組大鼠血清)，20%含藥血清組(20%含藥方組大鼠血清+0%正常組大鼠血清)。作用24 h后，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后終止培養(yǎng)。小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 mL DMSO振蕩10 min。用酶標(biāo)儀于570 nm處測定每個(gè)孔A570值。按下面公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：細(xì)胞存活率=(加藥組A570值-空白組A570值)/(對照組A570值-空白組A570值)×100%，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 MTT法檢測不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷的影響

實(shí)驗(yàn)方法同2.3，除2.3中各組均加入ox-LDL外，另增設(shè)1個(gè)正常組，即0%含藥血清組(0%含藥方組大鼠血清+20%正常組大鼠血清)。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡率的影響

以2×104/孔的細(xì)胞密度將HUVEC接種于6孔板中，以PBS沖洗后，按照2.2中的實(shí)驗(yàn)分組和用藥方法處理細(xì)胞。作用24 h后， 用0.25%的胰酶進(jìn)行消化，于室溫2000 rpm離心10 min收集細(xì)胞；用預(yù)冷1×PBS(4 ℃)重懸細(xì)胞，2000 rpm離心10 min，洗滌細(xì)胞2次，加入300 μL的1×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞；加入5 μL的Annexin V-FITC混勻后避光，室溫孵育15 min；上機(jī)前5 min再加入5 μL的PI染色，并補(bǔ)加200 μL的1×Binding Buffer，最后通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞早期和晚期凋亡率。

2.6 Western blot 法檢測不同藥物對HUVEC增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

將HUVEC接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，24 h 后以PBS沖洗后，按照2.2中的實(shí)驗(yàn)分組和用藥方法處理細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集各組細(xì)胞用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。蛋白變性后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF 膜上。2 h 后將轉(zhuǎn)印好的PVDF 膜置于含8% 脫脂牛奶的1×TBST 緩沖液中，室溫封閉2 h 后加入含抗VEGFR2、P66、P53、Bcl-2、BAX、β-actin的一抗孵育液(1∶1000)，4 ℃ 震蕩孵育過夜，1×TBST 洗3次，每次15 min，加入TBST 緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶5000)室溫震蕩1 h，1×TBST 洗3次，每次15 min。Millipore 發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，將PVDF 膜在alpha 凝膠成像儀上照相并分析各條帶吸光度變化。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 不同藥物對HUVEC增殖的影響

表1顯示，與正常組(0%含藥血清)比較，基礎(chǔ)方組、祛痰方組和化瘀方組吸光度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明上述3種方劑對HUVEC增殖無明顯影響。而祛痰化瘀方組(10%、15%、20%)吸光度顯著高于正常組(P<0.05)，其中20%濃度組效果最顯著(P<0.01)，表明祛痰化瘀方劑能夠促進(jìn)HUVEC增殖。

表1 不同藥物對HUVEC增殖的影響

注：與正常組(0%含藥血清)比較：*P<0.05，**P<0.01

3.2 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC損傷的保護(hù)作用

表2顯示，與正常組(0%含藥血清)比較，模型組(ox-LDL+0%含藥方組大鼠血清+20%正常組大鼠血清)吸光度值顯著降低(P<0.01)，表明ox-LDL可抑制HUVEC增殖；與模型組比較，不同濃度的祛痰方、化瘀方、祛痰化瘀方、基礎(chǔ)方組吸光度值均有不同程度增加，其中，祛痰方(10%、15%、20%)、化瘀方(15%、20%)、祛痰化瘀方(5%、10%、15%、20%)、基礎(chǔ)方組(15%、20%)吸光度值顯著增加(P<0.01)，表明上述4種方劑含藥血清可明顯抑制ox-LDL對HUVEC增殖的影響。

表2 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC增殖的影響

注：與正常組(0%含藥血清)比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組(0%+ ox-LDL)比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

3.3 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡的保護(hù)作用

圖1表3顯示，與正常組(0%含藥血清)比較，模型組早期及晚期凋亡率均顯著增加(P<0.01)，表明ox-LDL可誘導(dǎo)HUVEC凋亡；祛痰方、化瘀方、祛痰化瘀方、基礎(chǔ)方均可顯著降低ox-LDL損傷導(dǎo)致的HUVEC早、晚期凋亡率(P<0.01)，表明上述4種方劑均可抑制ox-LDL損傷導(dǎo)致的HUVEC凋亡。其中，基礎(chǔ)方組對早期凋亡率作用最為顯著，祛痰化瘀方對晚期凋亡率的作用最顯著。

3.4 不同藥物對增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡的保護(hù)作用

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：▲▲P<0.01

圖2表4顯示，與正常組比較，基礎(chǔ)方組、祛痰方組、化瘀方組、祛痰化瘀方組P53、Bcl-2、BAX表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明上述4種方劑對這4種與細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平無明顯影響。而與正常組比較，祛痰方和祛痰化瘀方能增加VEGFR的表達(dá)水平，祛痰方、化瘀方和祛痰化瘀方能降低P66表達(dá)水平。

圖1 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC凋亡的保護(hù)作用注：B.正常組；M.模型組；C.基礎(chǔ)方組；T.祛痰方組；Y.化瘀方組；T+Y.祛痰化瘀方組；Ⅰ.壞死細(xì)胞 Ⅱ：晚期凋亡細(xì)胞； Ⅲ：正?；罴?xì)胞； Ⅳ：早期凋亡細(xì)胞

組 別例數(shù)VEGFR2P66P53Bcl-2BAX正常組61.11±0.062.35±0.300.46±0.031.27±0.100.38±0.02基礎(chǔ)方組61.05±0.062.42±0.200.38±0.031.23±0.090.31±0.01祛痰方組61.30±0.07*2.01±0.21*0.54±0.051.08±0.070.27±0.02化瘀方組61.17±0.072.13±0.15*0.48±0.041.15±0.080.29±0.01祛痰化瘀方組61.37±0.07*2.18±0.15*0.46±0.031.30±0.110.25±0.02

注：與正常組比較：*P<0.05

圖2 不同藥物對增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響注：B.正常組；C.基礎(chǔ)方組；T.祛痰方組；Y.化瘀方組；T+Y.祛痰化瘀方組

3.5 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖3表5顯示，與正常組比較模型組VEGFR和Bcl-2表達(dá)水平降低，P66和BAX表達(dá)水平升高。與模型組比較，基礎(chǔ)方能升高VEGFR的表達(dá)水平，降低BAX的表達(dá)水平；祛痰方和化瘀方能升高VEGFR的表達(dá)水平，降低P66和BAX的表達(dá)水平；祛痰化瘀方能夠升高VEGFR和Bcl-2的表達(dá)水平，降低P66和BAX的表達(dá)水平。

圖3 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響注：B.正常組；M.模型組；C.基礎(chǔ)方組；T.祛痰方組；Y.化瘀方組；T+Y.祛痰化瘀方組

4 討論

Ox-LDL攜帶氧自由基，是造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷的最主要因素之一，ox-LDL通過影響內(nèi)皮細(xì)胞通透性、分泌功能及炎癥反應(yīng)等方式，以及通過某些信號通路抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙。

中醫(yī)辨證分型發(fā)現(xiàn)，痰瘀互結(jié)證是心血管疾病的主要證型之一，“痰濁”與“血瘀”為高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化共同的病理變化[2]。《靈樞·百病始生》指出：“溫氣不行，凝血蘊(yùn)里而不散，津液澀滲，著而不去，而積皆成矣。”《丹溪心法》談到：“痰夾瘀血，遂成窠囊?！薄堆C論》中的“須知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血，則痰水自消”“血積既久，亦能化為痰水”，以上觀點(diǎn)都說明痰瘀互結(jié)、交阻胸中是心血管疾病的重要病因病機(jī)。

表5 不同藥物對ox-LDL誘導(dǎo)的增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

注：與正常組比較：*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

目前已有學(xué)者對痰瘀同治方藥含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)痰瘀同治方對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞有促進(jìn)增殖和遷移作用[3]。中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所胡鏡清研究員在多年臨床經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上，針對動(dòng)脈粥樣硬化等常見心血管疾病，總結(jié)具有祛痰化瘀、補(bǔ)益脾腎、解表開郁、清熱解毒功效的方劑，經(jīng)我們拆解成祛痰方、化瘀方、祛痰化瘀方、基礎(chǔ)方。在前期的工作中我們發(fā)現(xiàn)[4]，這4 種方劑對于高血脂引發(fā)的apoE-/-高脂血癥/As 模型小鼠血管局部炎癥反應(yīng)均起到保護(hù)作用。本研究觀察了這4種方劑對內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、凋亡方面的影響。

在細(xì)胞增殖方面，與內(nèi)皮細(xì)胞增殖相關(guān)的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在正常人血液中濃度非常低，其生物學(xué)效應(yīng)通過其特異性受體VEGFR的介導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)的。VEGF與VEGFR結(jié)合后，將細(xì)胞外的信號傳遞至胞內(nèi)，激活VEGF介導(dǎo)的下游信號傳導(dǎo)通路，從而起到促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移、抗凋亡和形成新生血管等作用，并提高內(nèi)皮細(xì)胞的存活率[5]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，祛痰方、化瘀方、祛痰化瘀方、基礎(chǔ)方4種方劑中，祛痰化瘀方能增加HUVEC吸光度；祛痰方、祛痰化瘀方可上調(diào)HUVEC VEGFR的表達(dá)水平；氧化應(yīng)激情況下，4種方劑均可增加HUVEC吸光度并上調(diào)VEGFR的表達(dá)水平。

在細(xì)胞凋亡方面，主要有內(nèi)源性途徑、外源性途徑及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。其中， Bcl-2、BAX主要參與內(nèi)源性凋亡途徑，Bcl-2[6]抑制凋亡發(fā)生的主要機(jī)制為：通過抑制線粒體通透性的改變，抑制細(xì)胞色素C從線粒體透過線粒體膜向胞質(zhì)的釋放，阻止caspase的活化；穩(wěn)定內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，阻斷Ca2 +從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放，使依賴Ca2 +的核酸內(nèi)切酶活性降低，從而阻斷細(xì)胞凋亡。BAX與Bcl-2作用相反，通過提高線粒體的外膜通透性，增加線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，激活效應(yīng)caspase，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[7]。P53主要參與外源性凋亡途徑，可通過激活Fas基因增加細(xì)胞表面Fas，修復(fù)Fas-L/Fas死亡信號通路，促進(jìn)Fas缺損的細(xì)胞凋亡[8]。P66可受P53及JNK調(diào)節(jié)，介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡作用[9]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，祛痰方、化瘀方和祛痰化瘀方均能降低P66的表達(dá)水平；氧化應(yīng)激情況下，HUVEC抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平降低，促凋亡蛋白BAX、P66表達(dá)水平升高；祛痰化瘀方等4種方劑對早期、晚期及總凋亡率都有極大改善，且均可降低BAX的表達(dá)水平；祛痰方組、化瘀方組和祛痰化瘀方可降低p66的表達(dá)水平，只有祛痰化瘀方可提高Bcl-2的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用100 mg/L ox-LDL刺激24 h后，p53表達(dá)水平無明顯改變，祛痰化瘀方等4種方劑對p53表達(dá)水平也無明顯影響，可能由于作用時(shí)間或濃度不夠所致，或藥物抗凋亡作用主要是通過內(nèi)源性途徑進(jìn)行所致。

綜上所述，祛痰方、化瘀方、祛痰化瘀方、基礎(chǔ)方4種方劑可以從提高細(xì)胞增殖率、上調(diào)VEGFR表達(dá)水平從而發(fā)揮促增殖作用；并通過調(diào)節(jié)Bcl-2、BAX、P66介導(dǎo)的凋亡途徑達(dá)到抗凋亡作用，從而達(dá)到對抗氧化應(yīng)激導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用，其中以祛痰化瘀方效果最為顯著。這可能是其抗As的重要作用機(jī)制，可為痰瘀同治法治療As等常見心血管疾病提供依據(jù)。

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EffectsofEliminatingPhlegm,RemovingBloodStasisandEliminatingPhlegmandRemovingStasisPrescriptiononProliferationAndApoptosisofVascularEndothelialCellsInducedbyOxidizedLowDensityLipoprotein

CHEN Bing1, LIN Ya-jun2, MA Ya-luan1, LI Yu-mei1, XUE Xin1， HU Jing-qing1△

(1.InstituteofBasicTheoryforChinesemedicine,ChinaAcademyofChineseMedicalScience，Beijing100700,China; 2.NationalCenterofGerontology,BeijingHospital,Beijing100730,China)

Objective: To observe the effect of Qutan-Fang, Huayu-Fang, and Qutan-Huayu- Fang on proliferation and apoptosis of Human umbilical vascular endothelial cells induced by ox-LDL.(HUVECs) in oxidative injury. Methods: HUVEC were divided into normal group, model group, Basic-Fang group, Qutan-Fang group，Huayu-Fang group and Qutan-Huayu-Fang group, which treated with ox-LDL(100mg/ml). Proliferation of HUVECs were detected by MTT. Apoptosis of HUVECs were analysed by AnnexinV-FITC/PI staining with flow cytometry. And the expression of VEGFR, P66, P53, Bcl-2, BAX were detected by Western blot. Results: Compared with normal group, Qutan-Huayu-Fang can promote the light absorption value of HUVEC, and Qutan-Fang, Qutan-Huayu-Fang can increase the expression of VEGFR. All four prescriptions can increase the light absorption value on HUVEC and raising the expression of VEGFR stimulated with ox-LDL.Compared with normal group, Qutan-Fang，Huayu-Fang，Qutan- Huayu-Fang can reduce the expression of P66 of HUVEC. Stimulated with ox-LDL, the expression of Bcl-2 was reduced, and the expression of BAX、P66 were increased. All four prescriptions can improve the early apoptotic rate, the late apoptotic rate,and the total apoptotic rate. These four prescriptions can reduced the expression of BAX. Qutan-Fang，Huayu-Fang，Qutan-Huayu-Fang can reduce the expression of P66 stimulated with ox-LDL. Qutan- Huayu- Fang can increase the expression of Bcl-2 of HUVEC. Conclusion: Qutan-Fang, Huayu-Fang, Qutan-Huayu-Fang can effectively reduce the oxidative injury on HUVECs by improve their proliferation and inhibiting their apoptosis. The effect of Qutan-Huayu-Fang was the most significant in all four prescriptions.

Qutan-Fang; Huayu-Fang and Qutan-Huayu-Fang; Human umbilical vein endothelial cells; Oxide low density lipoprotein; Proliferation; Apoptosis

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2014CB542903)-中醫(yī)證候臨床辨證的基礎(chǔ)研究；中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項(xiàng)目(YZ-1408)-祛痰、化瘀及祛痰化瘀法對人血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF信號通路的影響；中國中醫(yī)科學(xué)院自主選題研究項(xiàng)目(YZ-1407)-祛痰、化瘀及祛痰化瘀對ApoE-/-動(dòng)脈粥樣硬化小鼠的作用機(jī)制的對比研究

陳 冰(1975-)，女，遼寧盤錦人，副研究員，醫(yī)學(xué)博士，從事證候物質(zhì)基礎(chǔ)及方證相應(yīng)研究。

△通訊作者：胡鏡清(1965-)，男，研究員，醫(yī)學(xué)博士，博士研究生導(dǎo)師，從事適應(yīng)中醫(yī)藥理論構(gòu)筑與診療模式的臨床方法研究，Tel：13911546633，E-mail: gcp306@126.com。

R285.5

B

1006-3250(2017)11-1554-05

2017-03-24