盧建洲，蔣增海，鄧同煒，霍元楠，王宇坤

（1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2．河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染的診治分析

盧建洲，蔣增海*，鄧同煒，霍元楠，王宇坤

（1．河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；2．河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

豬鏈球菌病是由多種不同血清群（C、D、E、L群）的鏈球菌引起的不同臨診傳染病的總稱(chēng)，臨床上主要是以淋巴結(jié)膿腫、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及敗血癥為主要特征，其中，豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)引起豬鏈球菌病最主要的病原，該菌可引起豬腦膜炎和敗血癥等癥狀，并能通過(guò)黏膜或者傷口等傳播途徑感染人[1]。豬是多殺性巴氏桿菌的易感動(dòng)物之一，豬群中流行的多殺性巴氏桿菌血清型多為A型和D型，主要引發(fā)豬肺疫和豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎[2]。近年來(lái)，豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染病例報(bào)道較少[3-4]。2017年2月下旬，河南濮陽(yáng)某800頭基礎(chǔ)母豬規(guī)?；瘓?chǎng)，保育后期、育肥前期的豬群陸續(xù)發(fā)病，送來(lái)我單位診斷，筆者通過(guò)臨床綜合診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷，確診為豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染，現(xiàn)將報(bào)道如下。

1 臨床癥狀

該豬場(chǎng)存欄保育后期、育肥前期的豬群約1 500余頭，50～120日齡，從2月上旬，相繼陸續(xù)發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁，食欲減退，體溫升高為41～42 ℃，眼結(jié)膜潮紅，腹式呼吸，喘氣，四肢無(wú)力，趴臥地面，耳廓、腹部、四肢皮膚有紫紅色出血斑塊（圖1）；有的豬晚上發(fā)病、早上死亡，口鼻流出血樣泡沫；有的關(guān)節(jié)腫大、跛行；有的保育仔豬頭頸歪斜，共濟(jì)失調(diào)，走路搖晃，病程長(zhǎng)的保育仔豬嚴(yán)重消瘦。整個(gè)豬場(chǎng)自發(fā)病以后，發(fā)病率約為40%，死亡率約為15%，使用氟苯尼考、替米考星、強(qiáng)力霉素等，療效不明顯。

2 剖解病理變化

腹股溝淋巴結(jié)腫大（圖1），頜下淋巴結(jié)腫大；心包積液（圖2），心包液內(nèi)有少量的纖維性物質(zhì)；有的豬心外膜有大量纖維素物質(zhì)包裹，呈絨毛心；氣管內(nèi)有大量出血泡沫液體；肺臟出血，呈紫紅色，有肉變區(qū)，有的豬肺氣腫，切面流出泡沫樣液體；有的豬腎臟針尖狀出血點(diǎn)；關(guān)節(jié)積液增多，內(nèi)有纖維絮狀物。

3 實(shí)驗(yàn)室診斷

3.1 主要試劑

TSA（胰蛋白大豆瓊脂）、TSB（胰蛋白大豆肉湯）購(gòu)自美國(guó)BD（Becton，Dickinson and Company） 公司；TSA平板、TSB肉湯配制時(shí)，分別添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）終濃度為10 mg/L和犢牛血清（終濃度50 mL/L)；2×Taq PCR MasterMix/with dye購(gòu)自加拿大ABM公司；Marker 2000等購(gòu)自寶生物工程（大連)有限公司；藥敏片購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司。

3.2 引物與合成

豬鏈球菌特異性擴(kuò)增引物，參照文 獻(xiàn)[5]，P1 ：GCAGCGTATTCTGTCAAACG，P2：CCATGGACAGATAAAGATGG，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為689 bp；多殺性巴氏桿菌特異性擴(kuò)增引物，參照文獻(xiàn)[6]，P1：5′ -ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′，P2：5 ′ -GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為457 bp，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3.3 分離、培養(yǎng)

無(wú)菌采集患豬肺臟，引火自燃消毒肺臟表明，使用滅菌剪刀與鑷子，剪去肺臟表面，采集深部肺臟組織，涂抹于TSA平板（添加有NAD，犢牛血清），37 ℃培養(yǎng)24～48 h，生長(zhǎng)出一種白色、半透明、圓形菌落，約為0.5～1 mm；另外一種淡淺色、圓形、濕潤(rùn)菌落，大小約為1～1.5 mm，進(jìn)一步將兩株菌落接種于TSA平板（添加有NAD，犢牛血清）純化、傳代。

3.4 染色、鏡檢

無(wú)菌采集病變部位的肺臟組織，染色后，觀察到疑似兩種細(xì)菌，一種為革蘭氏陽(yáng)性、單個(gè)或短鏈球菌，另外一種為革蘭氏陰性短桿菌或個(gè)別稍長(zhǎng)桿菌（圖3）。將分離、純化的可疑菌，染色、鏡檢，觀察到一種為革蘭氏陽(yáng)性、鏈狀排列的球菌，疑似豬鏈球菌（圖4）；另外一種為革蘭氏陰性、卵圓性的短小桿菌，疑似為多殺性巴氏桿菌（圖5）。

3.5 PCR鑒定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[5-6]，利用PCR方法，擴(kuò)增疑似為豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌的特異性片段，結(jié)果顯示擴(kuò)增出豬鏈球菌689 bp 特異性片段、多殺性巴氏桿菌457 bp片段，與預(yù)期一致（圖6），表明分離兩種細(xì)菌為豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌。

3.6 藥敏試驗(yàn)

選擇18種藥物，采用紙片擴(kuò)散法，測(cè)定分離的豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌藥物敏感性，其結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌對(duì)氨芐西林、阿莫西林、青霉素、恩諾沙星、環(huán)丙殺沙星菌等敏感，因此，建議該養(yǎng)殖戶(hù)，針對(duì)發(fā)病嚴(yán)重豬只，使用氨芐西林、青霉素、或者恩諾沙星單獨(dú)，或者聯(lián)合注射治療，同時(shí)使用阿莫西林拌料，適當(dāng)加大用藥劑量，連用5～7 d。治療效果明顯，1周后，該豬場(chǎng)疫情平息。

圖1 腹部皮膚出血和腹股溝淋巴結(jié)出血

圖2 心包積液

圖3 肺膈葉病料中疑似鏈球菌、巴氏桿菌（革蘭氏染色）

圖4 分離鏈球菌（革蘭氏染色）

圖5 分離多殺性巴氏桿菌（革蘭氏染色）

圖6 分離細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果

表1 分離豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌對(duì)各種藥物的抑菌圈

4 分析與討論

通過(guò)臨床癥狀與病變，容易診斷為急性傳染性胸膜肺炎，因此筆者采用TSA平板（加有NAD、犢牛血清）分離發(fā)病豬群感染的病原，是為了判斷能否分離到傳染性胸膜肺炎放線桿菌，及副豬嗜血桿菌（該培養(yǎng)基，能夠適合這兩種菌的生長(zhǎng)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示分離到的兩種細(xì)菌分別為豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌，結(jié)合臨床癥狀和病理變化，最終確診為豬鏈球菌與多殺性巴氏桿菌混合感染，混合感染時(shí)，病情更加復(fù)雜，增加診斷難度，必須依靠實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)才能確診。

根據(jù)養(yǎng)殖戶(hù)反映，使用氟苯尼考、替米考星、強(qiáng)力霉素等藥物，療效不佳，筆者推測(cè)豬群感染耐藥性菌株所致。因此，分離豬鏈球菌和多殺性巴氏桿菌，進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，結(jié)果顯示，氨芐西林、阿莫西林、青霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星等藥物敏感，最后，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，使用氨芐西林、青霉素、或者恩諾沙星聯(lián)合注射治療，阿莫西林拌料給藥，適當(dāng)加大劑量，療效明顯。獸醫(yī)臨床中，由于濫用藥物，耐藥性問(wèn)題相當(dāng)嚴(yán)重，分離病原菌、進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，對(duì)于正確指導(dǎo)用藥十分重要。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].6版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社， 2015：156-157.

[2] 彭忠， 王庚， 吳廣敬， 等. 豬源多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科學(xué) ， 2015， 45(9)： 943-951.

[3] 吳柯青. 豬鏈球菌病與豬多殺性巴氏桿菌病混合感染的診治[J]. 福建畜牧獸醫(yī) ， 2010， 32(6)： 73.

[4] 婁欣建. 一例母豬豬肺疫與鏈球菌病混合感染的診治[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2012(3)： 186.

[5] OKUMABUA O，O’ CONNOR M，SHULL E. A polymerase chain reaction(PCR)assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J].FEMS Microbiol Lett，2003，218(1)：79-84.

[6] 唐先春， 吳斌， 陳煥春. 豬多殺性巴氏桿菌 PCR 檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)獸醫(yī)科技 ，2004， 34(2)： 46-48.

河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：MXK2016102）；

盧建洲（1963-），男，河南鞏義人，主要從事豬病臨床診斷與防治研究；

*通訊作者：蔣增海（1976-），男，四川簡(jiǎn)陽(yáng)人，講師，在職博士，主要從事豬病原微生物研究。E-mail：50242328@qq.com。

2017-09-20)