段軍偉，唐曉平，張濤，趙龍，彭華，段劼

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 南充 637000)

microRNA-34a對人腦膠質瘤細胞生物學特性的影響

段軍偉，唐曉平，張濤，趙龍，彭華，段劼

(川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，四川 南充 637000)

目的研究microRNA-34a對人腦膠質瘤細胞生物學特性的影響。方法選取南充市川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院2015年3月至2016年3月收治的100例膠質瘤患者為研究對象，采集膠質瘤組織樣本，選取同期在我院接受減壓術治療的40例腦外傷患者為對照，術中采集正常腦組織樣本。采用實時熒光定量PCR檢測microRNA-34a在膠質瘤組織與正常腦組織樣本中表達水平。將轉染后人腦膠質瘤細胞系U87分為空白對照組、無義序列轉染組及microRNA-34a轉染組，檢測microRNA-34a對人腦膠質瘤細胞系U87增殖、凋亡、遷移、侵襲能力的影響。結果膠質瘤組織microRNA-34a相對表達量為(0.53±0.48)，顯著低于正常腦組織的(1.38±0.25)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。不同惡化程度膠質瘤組織microRNA-34a相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。microRNA-34a轉染組轉染后48 h細胞生長抑制率、轉染后細胞凋亡率顯著高于空白對照組與無義序列轉染組，劃痕24 h后細胞遷移數(shù)、細胞12 h穿膜數(shù)顯著低于空白對照組與無義序列轉染組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。結論microRNA-34a具有抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲，促進腫瘤細胞凋亡等作用。

膠質瘤；microRNA-34a；細胞生物學；增殖；凋亡

膠質瘤是臨床常見原發(fā)性顱腦腫瘤，具有較高致殘率與致死率，對人類健康造成嚴重威脅[1]。目前膠質瘤治療主要以手術、放療、化療、靶向治療、中醫(yī)藥治療等為主，但由于膠質瘤生長速度快，與周圍組織界限模糊，侵襲性強，難以徹底根除，治療后仍具有較高復發(fā)風險[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)microRNA與膠質瘤發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系，為膠質瘤治療提供新思路[3]。本研究選取我院近年來收治的100例膠質瘤患者為研究對象，采集膠質瘤組織樣本，探討microRNA-34a對人腦膠質瘤細胞生物學特性的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 膠質瘤組織樣本 選取南充市川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院2015年3月至2016年3月收治的100例膠質瘤患者為研究對象。納入標準：(1)符合《中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質瘤診斷與治療指南(2015)》[4]，經(jīng)病理組織學證實為膠質瘤患者；(2)初發(fā)膠質瘤；(3)在我院接受手術治療，術前未經(jīng)放化療。排除標準：(1)合并有嚴重心、肺、肝、腎等器官疾??；(2)合并有其他惡性腫瘤；(3)復發(fā)性膠質瘤；(4)既往手術史或放化療史。100例患者中男性68例，女性32例；年齡35～57歲，平均(46.08±10.82)歲；膠質瘤形態(tài)學分型：彌漫星形細胞瘤22例，間變星形細胞瘤17例，大腦膠質瘤病11例，少變膠質細胞腫瘤10例，間變少突膠質瘤8例，少突星形細胞瘤12例，室管膜瘤20例；膠質瘤惡性程度分級：Ⅰ級21例，Ⅱ級25例，Ⅲ級40例，Ⅳ級14例。本組患者均接受手術治療，在術中采集膠質瘤組織樣本。選取同期在我院接受減壓術治療的40例腦外傷患者為對照組，其中男性28例，女性12例，年齡26～55歲，平均(40.43±14.39)歲，術中采集正常腦組織樣本。膠質瘤組織與正常腦組織取材成功后，迅速置入凍存管，在液氮環(huán)境保存?；颊呋蚱浼覍賹Ρ狙芯恐橥獠⒑炇鹬橥鈺?。

1.1.2 人腦膠質瘤細胞系 人腦膠質瘤細胞系U87購自中科院上海細胞庫，采用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置于37℃、5%CO2恒溫箱培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量PCR(Real-time PCR) 取50 mg組織標本，研磨成漿，采用Trizol法提取總DNA，microRNA提取試劑盒購自德國Roche公司。根據(jù)逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen)說明書反轉錄cDNA。本實驗以U6作為內(nèi)源性參照，microRNA-34a相對表達量采用2△△Ct計算。Real-time PCR購自美國Invirogen公司，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，PCR 循環(huán)參數(shù)：95℃，5 min；95℃，15 s；65℃，15 s；72℃，32 s；95℃，15 s，共40個循環(huán)，4℃保存。

1.2.2 細胞培養(yǎng) 取出液態(tài)氮冷藏人腦膠質瘤細胞系U87凍存管，浸入37℃水浴中搖動融化，吸出細胞懸液轉入離心管，滴加10 mL培養(yǎng)液，置入離心機，1 000 r/min離心5 min。棄置上清液，加入10%小牛血清培養(yǎng)基，37℃、5%CO2恒溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。在倒置顯微鏡下，采用血細胞計數(shù)板法直接計數(shù)，計算細胞密度。

1.2.3 細胞轉染 取對數(shù)生長期腦膠質瘤細胞系U87，種植于24孔板中，轉染前細胞密度培養(yǎng)達到70%～90%。轉染步驟嚴格按照Lipofectamine 2000(美國Invitrongen公司)試劑盒說明書。在37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)48 h后，提取總DNA，行反轉錄cDNA，實驗步驟與上同。采用Real-time PCR檢測轉染后microRNA-34a表達情況。

1.2.4 CCK-8法檢測細胞增殖 取出轉染后人腦膠質瘤細胞系U87，分為空白對照組、無義序列轉染組以及microRNA-34a轉染組。轉染前1 d將細胞消化接種至24孔培養(yǎng)板，約5×103細胞/孔，次日以50 mol/L轉染濃度轉染，設置4個復孔，以及只加細胞培養(yǎng)液和CCK-8工作液的空白孔，置入37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h。細胞轉染后每12 h使用酶標儀在450 nm處檢測三組細胞吸光度，計算三組細胞生長抑制率。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取出轉染后人腦膠質瘤細胞系U87，分組方法同上。置入37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)48 h，將細胞吹打成單細胞懸液，加入緩沖液洗滌，1 000 r/min離心4 min，棄置緩沖液，加入5 μL AnnexinV-FITC和5 μL PI染色，震蕩混勻，室溫避光15 min。加入200 μL Binding buffer重懸細胞濃度，采用流式細胞儀檢測轉然后細胞凋亡情況。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移 取出轉染后人腦膠質瘤細胞系U87，分組方法同上。將三組細胞制備為懸液，接種至六孔板中，置入37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h。次日用20 μL移液器沿培養(yǎng)孔底部作直線劃痕，呈一字型，劃痕過程嚴格無菌。采用緩沖液沖洗劃痕，加入培養(yǎng)液，置入用37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h。觀察劃痕區(qū)域細胞遷移情況。

1.2.7 Transwell法檢測細胞侵襲 取出轉染后人腦膠質瘤細胞系U87，分組方法同上。加入10%小牛血清培養(yǎng)基，長勢良好可換用無血清培養(yǎng)液，置入37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h。采用人工基質膠構建侵襲小室，均勻鋪滿所有微孔，室溫放置1 h凝膠。將Transwell小室放入24孔培養(yǎng)板，上室加入100 μL人腦膠質瘤細胞系U87懸液，下室加入10%小牛血清培養(yǎng)基500 μL，置入37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)48 h。用緩沖液淋洗Transwell小室，再用棉簽擦去濾膜上層細胞。0.1%結晶紫溶液染色30 min，采用顯微鏡選取5個200倍視野計算穿過小室底膜的細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法應用統(tǒng)計學軟件SPSS19.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差(x-±s)表示，組間比較進行t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 microRNA-34a在膠質瘤與正常腦組織中的表達 在膠質瘤組織與正常腦組織樣本中均可檢測到microRNA-34a表達。正常腦組織microRNA-34a相對表達量為(1.38±0.25)，高于膠質瘤組織microRNA-34a相對表達量(0.53±0.48)，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.310，P＜0.05)。Ⅰ級膠質瘤組織microRNA-34a相對表達量為(0.83±0.18)，Ⅱ級為(0.67±0.19)，Ⅲ級為(0.35±0.12)，Ⅳ級為(0.10±0.05)。不同惡化程度膠質瘤組織microRNA-34a相對表達量差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 Real-time PCR檢測microRNA-34a的轉染效果 在人腦膠質瘤U87細胞系中，microRNA-34a轉染組microRNA-34a表達量為(6.06±0.15)，顯著高于空白對照組的(1.67±0.18)與無義序列轉染組的(1.59±0.20)，差異有統(tǒng)計學意義 (t=91.788、87.594，P＜0.05)。

2.3 microRNA-34a對腦膠質瘤細胞增殖的影響 microRNA-34a轉染組轉染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h細胞生長抑制均顯著高于空白對照組與無義序列轉染組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1。

2.4 microRNA-34a對腦膠質瘤細胞凋亡的影響 microRNA-34a轉染組轉染后細胞凋亡率為(8.79±2.82)%，顯著高于空白對照組的(4.88±1.14)%與無義序列轉染組的(5.12±1.69)%，差異均有統(tǒng)計學意義(t=12.595、10.938，P＜0.05)。

表1 三組轉染細胞生長抑制率(%±s)

表1 三組轉染細胞生長抑制率(%±s)

組別microRNA-34a轉染組空白對照組無義序列轉染組檢驗值1(microRNA-34a轉染組vs空白對照組)檢驗值2(microRNA-34a轉染組vs無義序列轉染組)檢驗值3(空白對照組vs無義序列轉染組)轉染后12 h 12.54±2.17 4.42±0.89 4.88±1.04 t=16.961 P＜0.05 t=15.595 P＜0.05 t=1.646 P＞0.05轉染后24 h 18.92±3.34 5.63±1.25 6.34±1.29 t=18.257 P＜0.05 t=17.213 P＜0.05 t=1.936 P＞0.05轉染后36 h 27.65±2.05 6.85±0.95 5.82±1.35 t=45.099 P＜0.05 t=43.569 P＜0.05 t=3.057 P＜0.05轉染后48 h 38.40±4.11 6.16±0.93 7.55±2.19 t=37.481 P＜0.05 t=32.453 P＜0.05 t=2.862 P＜0.05轉染后60 h 35.17±3.63 8.92±1.31 8.46±1.74 t=33.323 P＜0.05 t=32.506 P＜0.05 t=1.035 P＞0.05轉染后72 h 18.96±3.22 7.73±1.65 8.20±1.63 t=15.205 P＜0.05 t=14.606 P＜0.05 t=0.993 P＞0.05

2.5 microRNA-34a對腦膠質瘤細胞遷移的影響 microRNA-34a轉染組劃痕24 h后細胞遷移數(shù)為(79.25±6.21)，顯著低于空白對照組的(168.49±11.75)與無義序列轉染組的(151.44±10.32)，差異均有統(tǒng)計學意義(t=16.448、14.681，P＜0.05)。

2.6 microRNA-34a對腦膠質瘤細胞侵襲的影響 microRNA-34a轉染組細胞12 h穿膜數(shù)為(52.35±4.78)，顯著低于空白對照組的(233.47±13.95)與無義序列轉染組的(219.22±10.76)，差異均有統(tǒng)計學意義(t=60.172、69.432，P＜0.05)。

3 討 論

膠質瘤是最常見的惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，具有極高侵襲性，手術根除難度大，患者復發(fā)率高，聯(lián)合放化療也無法取得較佳療效[5]。膠質瘤惡性進展分子機制，與如何抑制膠質瘤侵襲能力，是目前臨床神經(jīng)外科重要研究課題[6]。microRNA是新近發(fā)現(xiàn)的一類非編碼單鏈RNA分子，含18～25個核苷酸，在細胞內(nèi)具有多種重要調(diào)節(jié)作用[7]。目前已發(fā)現(xiàn)28 645個microRNA，越來越多研究證實microRNA參與膠質瘤發(fā)生、發(fā)展。李星光等[8]發(fā)現(xiàn)microRNA-17高表達與膠質瘤患者預后不良存在密切聯(lián)系。李新星等[9]指出microRNA-221是抑癌基因p27Kipl的調(diào)控因子，可以通過抑制p27Kipl基因表達，激活膠質瘤細胞，影響治療與預后。郎博娟等[10]認為microRNA-184低表達可以抑制腫瘤細胞凋亡，加速腫瘤細胞增殖，在膠質瘤發(fā)生、發(fā)展中占有重要地位。趙焱等[11]發(fā)現(xiàn)microRNA-93可以通過介導轉化生長因子-β R2表達，減弱膠質瘤細胞侵襲能力。根據(jù)microRNA在膠質瘤發(fā)展中的作用，可將microRNA分為致癌基因與抑癌基因，前者促進膠質瘤細胞分化、增殖、遷移、侵襲，后者參與腫瘤細胞凋亡，調(diào)控腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲。MicroRNA-34a是一種microRNA抑癌基因，廣泛分布于心、肺、肝、腦等組織中，其編碼基因位于1號染色體短臂。近年來研究證實microRNA-34a可以抑制多種腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲。袁匯等[12]發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者體內(nèi)microRNA-34a表達顯著下降，microRNA-34a可以作為宮頸癌治療靶點。莊彪等[13]認為microRNA-34a高表達可以抑制結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲。金向宇等[14]指出microRNA-34a可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2、C-MYC、P53等基因，促進肺癌細胞凋亡，抑制腫瘤細胞遷移、侵襲。為闡明microRNA-34a在過程中作用，本研究首先比較正常腦組織與膠質瘤組織樣本microRNA-34a表達量，以及不同惡化程度膠質瘤組織microRNA-34a表達量，發(fā)現(xiàn)隨膠質瘤惡化程度上升，microRNA-34a相對表達量逐漸降低，提示microRNA-34a與膠質瘤發(fā)生、發(fā)展存在密切聯(lián)系，可以指導膠質瘤分級。細胞增殖指細胞通過分裂產(chǎn)生新個體的過程，是生物體重要生命特征。惡性腫瘤通過腫瘤細胞增殖方式不斷發(fā)展惡化[15]。本研究采用經(jīng)典CCK-8實驗檢測microRNA-34a對膠質瘤細胞生長抑制作用，結果顯示microRNA-34a轉染組轉染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h細胞生長抑制率均顯著高于空白對照組與無義序列轉染組，表明microRNA-34a可以減弱膠質瘤細胞增殖能力。腫瘤發(fā)生是細胞凋亡受阻造成的腫瘤細胞失控生長，過度增殖[16]。抑制腫瘤細胞抗凋亡能力，誘導腫瘤細胞凋亡，是腫瘤治療重要機制。正常細胞不會被AnnexinV-FITC與PI染色，早期凋亡細胞可被AnnexinV-FITC染色而不會被PI染色，晚期凋亡細胞與壞死細胞可被AnnexinV-FITC與PI染色。本次實驗證實，microRNA-34a轉染組轉染后細胞凋亡率顯著增高，與空白對照組、無義序列轉染組比較差異有統(tǒng)計學意義，表明microRNA-34a具有誘導膠質瘤細胞凋亡的能力。遷移指腫瘤細胞隨血液、淋巴轉移至其他部位，侵襲指腫瘤細胞在原發(fā)部位浸潤，兩者均為惡性腫瘤重要生物學特性。相關研究顯示，膠質瘤具有較強遷移、侵襲能力，發(fā)生機制可能與腫瘤細胞黏附、局部基質降解、腫瘤血管新生等相關[17]。本研究分別采用劃痕實驗與Transwell法檢測人腦膠質瘤細胞遷移與侵襲能力，結果顯示microRNA-34a轉染組劃痕24 h后細胞遷移數(shù)、細胞12 h穿膜數(shù)顯著低于空白對照組與無義序列轉染組，提示microRNA-34a可以有效抑制膠質瘤細胞遷移、侵襲能力。

綜上所述，microRNA-34a在膠質瘤組織中呈低表達，隨病理分級增高而降低。microRNA-34a高表達可以抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡。

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Effect of microRNA-34a on biological characteristics of human brain glioma cells.

DUAN Jun-wei,TANG Xiao-ping,ZHANG Tao,ZHAO Long,PENG Hua,DUAN Jie.Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College,Nanchong 637000,Sichuan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of microRNA-34a on the biological characteristics of human brain glioma cells.MethodsA total of 100 patients with glioma who were admitted in Department of Neurosurgery,Affiliated Hospital of North Sichuan Medical College from March 2015 to March 2016 were enrolled as the subjects.The glioma tissues were collected.Forty patients with brain trauma treated by decompression in our hospital were selected as controls,and normal brain tissue samples were collected during the operation.The expression levels of microRNA-34a in glioma tissues and normal brain tissues were detected by real-time quantitative PCR.The human cerebral glioma cell line U87 after transfection were divided into the blank control group,nonsense sequence transfection group and microRNA-34a transfection group.The effect of microRNA-34a on the proliferation,apoptosis,migration and invasion ability of human glioma cell line U87 was detected.ResultsThe relative expression level of microRNA-34a in glioma tissues was significantly lower than that in normal brain tissues,(0.53±0.48)vs(1.38±0.25),P＜0.05.The relative expression level of microRNA-34a showed significantly differences in different deteriorated glioma tissues(P＜0.05).48 hoursafter transfection,the cell growth inhibition rate and cell apoptosis rate after transfection in microRNA-34a transfection group were significantly higher than those in the blank control group and the nonsense sequence transfection group(P＜0.05).The number of migrating cells in 24 hours after scratch and number of cells penetrating membrane in 12 hours were significantly lower than those in the blank control group and nonsense sequence transfection group(P＜0.05).ConclusionmicroRNA-34a can inhibit the proliferation,migration and invasion of glioma cells and promote the apoptosis of tumor cells.

四川省醫(yī)學科研青年創(chuàng)新課題計劃(編號：Q15079)

段軍偉。E-mail：kmcvdeng@126.com

Glioma;microRNA-34a;Cell biology;Proliferation;Apoptosis

R730.264

A

1003—6350（2017）23—3826—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.23.014

2017-05-25)