孫付存，孔祥波，張?zhí)K芳，王鴻斌，張 真，劉 福

(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

思茅松毛蟲3個(gè)地理種群性信息素成分差異分析

孫付存，孔祥波*，張?zhí)K芳，王鴻斌，張 真，劉 福

(中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，國家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

目的分析思茅松毛蟲雌成蟲不同地理種群間性信息素成分、含量和比例差異，比較雄成蟲觸角敏感性和不同配比誘芯誘捕效果差異，開發(fā)不同地域有針對(duì)性的思茅松毛蟲種群監(jiān)測方法和誘捕防控技術(shù)。方法運(yùn)用氣相色譜(GC)分析思茅松毛蟲湖南、云南和江西地理種群雌蟲性信息素腺體提取物，利用觸角電位儀(EAG)測定思茅松毛蟲各地理種群雄蛾觸角對(duì)性信息素標(biāo)準(zhǔn)品及其不同配比組分的電生理敏感性，然后進(jìn)行林間生物測定，比較不同配比的性信息素成分誘蛾效果。結(jié)果思茅松毛蟲性信息素腺體中含有順5,反7-十二碳二烯乙酸酯(Z5,E7-12:OAc)、順5,反7-十二碳二烯醇(Z5,E7-12:OH)和順5-十二碳烯乙酸酯(Z5-12:OAc)3種成分，3個(gè)地理種群間這3種腺體成分含量和比例存在微小差異。3種成分以100:10:25或者100:10:10的比例配比，不同地理種群間均具有很好的觸角電位活性和林間誘蛾活性。結(jié)論思茅松毛蟲性信息素組分還沒有發(fā)生明顯的種下分化現(xiàn)象，3個(gè)地理種群間性信息素含量和比例的細(xì)微差異暗示著與地域差異、寄主植物差異和人為化學(xué)防控干擾等因素相關(guān)。

思茅松毛蟲；性信息素；色譜分析；地理種群；生物測定

思茅松毛蟲Dendrolimuskikuchii(鱗翅目：枯葉蛾科)主要分布在我國貴州、江西、安徽和云南等省，是我國危害最嚴(yán)重的 6 種松毛蟲之一，經(jīng)常對(duì)馬尾松、云南松和思茅松等寄主植物造成重大危害[1]。該害蟲性信息素成分被鑒定為順5,反7-十二碳二烯乙酸酯(Z5,E7-12:OAc)，順5,反7-十二碳二烯醇(Z5,E7-12:OH)和順5-十二碳烯乙酸酯(Z5-12: OAc)[2-3]。溶劑浸提性信息素腺體發(fā)現(xiàn)這3種成分的比例是100∶18∶0.6，固相微萃取法頂空吸附性信息素腺體發(fā)現(xiàn)這3種成分的比例是100∶7∶1，而林間試驗(yàn)證明氯化丁基橡膠塞誘芯中這3種成分以100∶20∶25的比例添加誘蛾活性最高[3]。不同性信息素成分提取及應(yīng)用方法證明雌蛾性信息素成分釋放和雄蛾響應(yīng)間存在較大的比例差異。初步的林間誘捕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相同性信息素誘芯對(duì)不同地域思茅松毛蟲成蟲引誘活性也存在一定的差異，這無疑給該蟲的準(zhǔn)確預(yù)測預(yù)報(bào)和有效防治帶來一定的困難。

蛾類昆蟲性信息素通訊系統(tǒng)的變化對(duì)于種內(nèi)雌雄交配行為和近緣種種間生殖隔離具有重要的生物學(xué)意義。這種變化主要體現(xiàn)在蛾類昆蟲不同地理種群間釋放信息素成分量的差異或者釋放比例的不同。從昆蟲種群間和種群內(nèi)性信息素信號(hào)產(chǎn)生以及行為反應(yīng)差異方面研究物種特異性交配信號(hào)的變異程度具有重要的生物學(xué)意義。本研究主要開展不同思茅松毛蟲地理種群雄蛾觸角對(duì)性信息素標(biāo)準(zhǔn)化合物的觸角電位反應(yīng)、不同種群雌蛾性信息素腺體所含性信息素成分比例變化以及對(duì)各地理種群進(jìn)行性信息素活性評(píng)價(jià)試驗(yàn)，探討思茅松毛蟲性信息素成分在不同地理種群間的變異程度。研究結(jié)論有助于開發(fā)有針對(duì)性地思茅松毛蟲種群監(jiān)測方法和誘捕防控技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 思茅松毛蟲采集

1.2 思茅松毛蟲性信息素提取

1.3 觸角電位(EAG)分析

標(biāo)準(zhǔn)化合物配制：Z5,E7-12:OAc、Z5,E7-12:OH和Z5-12:OAc標(biāo)準(zhǔn)化合物分別配制成10 μg·μL-1的母液。進(jìn)行EAG劑量反應(yīng)測試時(shí)，母液由高到低10×稀釋成一系列濃度，取稀釋液1 μL滴加到巴斯德管中5 cm × 0.6 cm 的濾紙條上。按照濃度1 ng·μL-1、10 ng·μL-1、100 ng·μL-1、1 μg·μL-1、10 μg·μL-1從低到高的順序依次進(jìn)行EAG測試。進(jìn)行3種性信息素成分不同比例EAG測試時(shí)，以3種信息素成分絕對(duì)含量的比例進(jìn)行樣品配制(如，Z5,E7-12:OAc:Z5-12:OAc=500 ng:125 ng或者Z5,E7-12:OAc:Z5,E7-12:OH=500 ng:50 ng)，測試時(shí)各比例樣品隨機(jī)測試，配制比例見圖2。

1.4 性信息素腺體提取物氣相色譜(GC)分析

每個(gè)種群分析20頭雌蟲性信息素腺體提取物。性信息素單腺體提取物在HP6890氣相色譜儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA)上分析。色譜儀裝有無分流進(jìn)樣器、毛細(xì)管色譜柱DB-1701(30 m × 0.25 mm 外徑 × 0.25 μm 液膜厚，J & W Scientific，F(xiàn)olsom，CA，USA) 和火焰離子化檢測器。色譜升溫程序：60℃保持1 min，以8℃·min-1的升溫速率升至220℃，保持 10 min。氮?dú)鉃檩d氣。利用Chemstation軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集分析。

1.5 林間生物測試

誘芯制備：將不同比例化合物(其中Z5,E7-12:OAc固定為500 μg)的正己烷溶液滴加到灰色袖口式氯化丁基橡膠塞上，待溶劑揮發(fā)后，再加20 μL二氯甲烷(含BHT 1 μg·μL-1)溶液使性信息素成分滲到橡膠塞載體中，BHT保護(hù)性信息素成分避免氧化分解。制備好的誘芯密封在鋁箔袋中低溫保存。

林間生物測試3個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)概況：湖南省郴州市桂陽縣(112.734 1° E，25.754 1° N)，樹種主要為柔毛油杉及少量馬尾松，思茅松毛蟲林間危害較重，測試時(shí)間為6月中旬到7月中旬；云南省普洱市震東鄉(xiāng)(100.494 6° E，23.252 5° N)，樹種主要是思茅松，思茅松毛蟲林間危害相對(duì)較輕，測試時(shí)間為6月上旬到7月中旬；江西省九江市永修縣(115.826 5° E，29.035 7° N)，樹種主要是濕地松，危害最為嚴(yán)重，測試時(shí)間段為6上旬到7月中旬，每個(gè)處理設(shè)置5個(gè)重復(fù)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

將每一處理的GC數(shù)據(jù)、EAG數(shù)據(jù)及誘捕雄蛾數(shù)據(jù)經(jīng)log(x+1)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用Turkey’s HSD對(duì)處理間平均數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05，SPSS Statistics22)。

2 結(jié)果與分析

2.1 3個(gè)地理種群思茅松毛蟲性信息素成分分析

思茅松毛蟲3個(gè)地理種群雌蛾單腺體提取物 GC分析見圖1。3個(gè)地理種群雌蟲腺體提取物中除含有相對(duì)大量的Z5,E7-12:OAc外，還發(fā)現(xiàn)微量的Z5,E7-12:OH和Z5-12:OAc(圖1，表1)。Z5,E7-12:OAc在湖南、江西和云南種群中含量均最高且3個(gè)種群間無顯著性差異(F(2,57)=0.008，P=0.992)。Z5,E7-12:OH在湖南和江西種群間差異不顯著，但是都顯著高于云南種群(F(2,57)=9.643，P<0.05)。Z5-12:OAc在湖南和江西種群間差異不顯著，但都顯著低于云南種群(F(2,57)=7.787，P=0.001)。在3個(gè)地理種群雌蛾單腺體提取物中，3種性信息素成分分別以100:10:9(湖南)、100:9:8(江西)和100:6:11(云南)的比例存在(表1)。

表1 3個(gè)地理種群思茅松毛蟲處女雌蛾單腺體提取物中性信息素成分GC定量分析結(jié)果

*表中差異顯著性檢驗(yàn)是在α=0.05條件下進(jìn)行橫向比較的結(jié)果。

圖1 3個(gè)地理種群思茅松毛蟲處女雌蛾單腺體提取物GC分析圖Fig. 1 Gas chromatography traces from analysis of hexane extracts of the single sex pheromone gland of Dendrolimus kikuchii virgin females collected from 3 geographic populations

2.2 3個(gè)地理種群思茅松毛蟲觸角電位差異分析

表2 思茅松毛蟲3個(gè)地理種群雄蟲觸角對(duì)Z5,E7-12:OAc，Z5, E7-12:OH和Z5-12:OAc 的EAG劑量-反應(yīng)數(shù)值

*每欄后不同小寫字母表示雄蛾觸角對(duì)單一性信息素成分不同濃度梯度的EAG反應(yīng)有顯著差異(α=0.05)，N為測定重復(fù)數(shù)。

Z5,E7-12:OAc：湖南F(4,220)=184.59，P<0.05；江西F(4,160)=31.39，P<0.05；云南F(4,165)=76.62，P<0.05；

Z5,E7-12:OH：湖南F(4,220)=36.76，P<0.05；江西F(4,160)=78.66，P<0.05；云南F(4,170)=30.22，P<0.05；

Z5-12:OAc：湖南F(4,220)=48.77，P<0.05；江西F(4,170)=58.64，P<0.05；云南F(4,170)=45.24，P<0.05。

湖南F(11,804)=40.32，P<0.05；江西F(11,384)=3.823，P<0.05；云南F(11,324)=1.91，P=0.038。圖2 思茅松毛蟲3個(gè)地理種群雄蟲觸角對(duì)Z5,E7-12:OAc，Z5,E7-12:OH和Z5-12:OAc 不同比例的EAG反應(yīng)Fig.2 Mean EAG responses of three Dendrolimus kikuchii populations to different ratios of Z5,E7-12:OAc, Z5,E7-12:OH and Z5-12:OAc

2.3 3個(gè)不同地理種群思茅松毛蟲林間生測試驗(yàn)

林間生物測定確定了Z5,E7-12:OAc、Z5,E7-12:OH和Z5-12:OAc 3組分的最佳誘蛾比例(圖3)。結(jié)果表明，在Z5,E7-12:OAc和Z5-12:OAc的含量和比例(500 μg:125 μg)保持不變的情況下，Z5,E7-12:OH的含量是50 μg時(shí)(100:10:25)對(duì)3個(gè)思茅松毛蟲地理種群的誘蛾活性最高。在Z5, E7-12:OAc和Z5,E7-12:OH比例和含量(500 μg:50 μg)保持不變的情況下，Z5-12:OAc的含量在50 μg時(shí)(100:10:10)，江西和云南種群的誘蛾活性均最高，但與100:10:25配比相比誘芯誘蛾效果差異不顯著；湖南種群在100:10:10配比時(shí)的誘芯誘蛾效果也較高，但配比為100:10:25的誘芯誘蛾效果最好且顯著高于其他配比誘芯的誘蛾效果。其他不同配比的誘蛾效果均不如這2種配比的誘蛾效果，這與EAG測定結(jié)果相吻合(圖3)。

湖南F(11,24)=2.43，P=0.033；江西F(11,24)=9.19，P<0.05；云南F(11,24)=10.278，P<0.05。圖3 Z5,E7-12:OAc，Z5, E7-12:OH和Z5-12:OAc不同比例配制的誘芯對(duì)不同地理種群思茅松毛蟲的誘捕總量Fig.3 Total trap number per treatment of different Dendrolimus kikuchii populations trapped to different ratios of Z5,E7-12:OAc, Z5,E7-12:OH and Z5-12:OAc

3 討論

思茅松毛蟲在長江以南各省廣域分布，林間點(diǎn)片發(fā)生，危害的寄主植物各地有差異。思茅松毛蟲3個(gè)地理種群性信息素成分的釋放比例有微小的差異，雄蛾對(duì)不同比例性信息素成分的響應(yīng)也有差異，原因可能是思茅松毛蟲從南向北蔓延危害過程中，面臨不同寄主選擇及各地區(qū)溫濕度和地形等因素的分化干擾造成的。目前，性信息素地理變異研究較全面的是玉米螟。歐洲玉米螟(Ostrinianubilalis)有2個(gè)完全不同的性信息素型種群，危害玉米的種群以順11-十四碳烯乙酸酯(Z11-14:OAc)和反11-十四碳烯乙酸酯(E11-14:OAc)97:3的比例進(jìn)行雌雄間化學(xué)通訊(Z型)[4]，Z型種群在歐美廣泛分布[5]；而危害艾蒿的種群這2種成分的比例是4:96(E型)[6]；同域發(fā)生的這2個(gè)種群在田間由于危害的寄主不同、其性信息素通訊系統(tǒng)比例差異巨大而完全生殖隔離。另外，歐洲玉米螟與亞洲玉米螟(O.furnacalis)性信息素生物合成過程中脫飽和化酶基因發(fā)生了改變，導(dǎo)致這2個(gè)近緣種性信息素化學(xué)信號(hào)成分發(fā)生了本質(zhì)的變化[7-8]。思茅松毛蟲雌蟲釋放的性信息素化學(xué)信號(hào)及雄蟲對(duì)化學(xué)信號(hào)的反應(yīng)沒有發(fā)生像玉米螟一樣較大的比例變化，說明其化學(xué)信號(hào)釋放面臨較弱的性選擇壓力，化學(xué)信號(hào)組分、比例的遺傳漂變可能是隨機(jī)的過程[5,9]。思茅松毛蟲性信息素通訊系統(tǒng)僅表現(xiàn)出性信息素成分含量和比例的微小差異，這與各地氣候差異、寄主種類差異和人類進(jìn)行農(nóng)藥噴施、砍伐樹木等因素密切相關(guān)。今后我們還應(yīng)該采用分子標(biāo)記的方法深入研究思茅松毛蟲地理種群間的種下變異程度。

4 結(jié)論

思茅松毛蟲性信息素腺體中含有Z5,E7-12:OAc(1.3-1.5 ng/female)，Z5,E7-12:OH(0.08-0.15 ng/female)和Z5-12:OAc(0.12-0.15 ng/female)3個(gè)性信息素成分，確認(rèn)了湖南種群(100∶10∶9)、云南種群(100∶6∶11)和江西種群(100∶9∶8)3種性信息素成分的含量和比例有微小的差異。經(jīng)EAG測試分析表明，湖南種群最佳EAG反應(yīng)的3種性信息素成分的比例是100∶10∶25，云南種群是100∶10∶10，江西種群是100∶10∶10或者100∶10∶25。林間生物測試表明，湖南種群3種性信息素成分以100∶10∶25的比例配比誘蛾效果最佳，云南種群和江西種群是100∶10∶25或者100∶10∶10。證明思茅松毛蟲性信息素成分的含量與比例多態(tài)性存在于南方各地理種群。本研究分析了思茅松毛蟲湖南、云南和江西地理種群間性信息素的變異程度，為進(jìn)一步研究其傳播及發(fā)生規(guī)律、開發(fā)有針對(duì)性對(duì)思茅松毛蟲的種群監(jiān)測方法和誘捕防控技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

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GeographicVariationofSexPheromonesinThreePopulationsofDendrolimuskikuchii(Lepidoptera:Lasiocampidae)

SUNFu-cun,KONGXiang-bo,ZHANGSu-fang,WANGHong-bin,ZHANGZhen,LIUFu

(Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, the Key Laboratory of Forest Protection of State Forestry Administration, Beijing 100091, China)

ObjectiveIn order to unveil the mechanism of population divergences to sex pheromone responses and develop a region-specific pheromone lure for successful monitoring and control ofDendrolimuskikuchii(Lepidoptera: Lasiocampidae), we focus on the geographic variation analysis of sex pheromones ofD.kikuchiiaccordingto its sex pheromone quantity, blend ratio, antennal sensitivity, and biological activity in three populations from Hunan, Jiangxi, and Yunnan Provinces.MethodSex pheromone ofD.kikuchiifrom different populations mentioned above was analyzed by means of Gas chromatography (GC), Electroantennographic recording (EAG), and field behavioral assays.ResultGC analyses of virgin female glands demonstrated that three pheromone components, (5Z,7E)-5,7-dodecadien-1-yl acetate (Z5,E7-12:OAc), (5Z,7E)-5,7-dodecadien-1-ol (Z5,E7-12:OH) and (5Z)-5-dodecenyl acetate (Z5-12:OAc) were present in all three populations. On average, all populations had a similar and abundant quantity of Z5,E7-12:OAc as well as trace amounts of Z5,E7-12:OH and Z5-12:OAc, the blend ratio and quantities of the three components in three populations existed relatively small differences with a blend ratio of 100:10:25 or 100:10:10 showing better EAG and behavioral activities than that of the other blend ratios.ConclusionThese results suggested that different geographic populations ofD.kikuchiihave developed some minor genetic variation but did not form completely independent groups. The subtle changes in sex pheromone quantities and blend ratios in different populations might be related to geographic distribution range, hosts, and man-made pesticide control interference.

Dendrolimuskikuchii; sex pheromone; GC analysis; geographic populations; biological assay

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.06.015

2017-02-22

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助(項(xiàng)目編號(hào)：201404401)。國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目：馬尾松毛蟲區(qū)域化成災(zāi)的分子與化學(xué)生態(tài)機(jī)制(項(xiàng)目批準(zhǔn)號(hào)：31470654)。

孫付存，男，碩士；主要從事昆蟲化學(xué)生態(tài)學(xué)研究，E-mail：sfc18853811341@126.com

* 通訊作者：孔祥波，男，研究員，博士，主要從事昆蟲化學(xué)生態(tài)學(xué)研究. E-mail：xbkong@sina.com

S763

A

1001-1498(2017)06-0993-06

崔 貝)