劉 捷，王 文，張體祥

(河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450001)

皺皮木瓜多糖的分離純化及結(jié)構(gòu)表征

劉 捷，王 文，張體祥

(河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450001)

研究從皺皮木瓜中提取的水溶性多糖的分離、純化、單糖組成及結(jié)構(gòu)，為木瓜的開發(fā)利用提供依據(jù).采用Sevag法除蛋白、透析法除小分子雜質(zhì)后，經(jīng)Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱分離得到了皺皮木瓜多糖CSP1.通過高效凝膠滲透色譜、氣相色譜、紫外光譜、紅外光譜和核磁共振氫譜等分析手段初步確定了其組成和結(jié)構(gòu).皺皮木瓜多糖CSP1為均一組分，重均相對分子質(zhì)量為27 622，由鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖4種單糖組成，摩爾比為0.042∶0.067∶0.860∶0.031，葡萄糖是主要成分，木瓜多糖CSP1結(jié)構(gòu)中存在α-糖苷鍵.

皺皮木瓜；多糖；分離純化；單糖組成；結(jié)構(gòu)

木瓜的種類很多，主要分為三類：一類是薔薇科木瓜，如光皮木瓜、皺皮木瓜；一類是番木瓜科木瓜，如番木瓜；還有一類是木通科木瓜，如野木瓜.作為一味常用的中藥，木瓜具有平肝舒筋、和胃化濕的功效[2]，文獻[3]研究還發(fā)現(xiàn)木瓜有抗菌消炎、抗衰老、抗腫瘤的作用.皺皮木瓜(Chaenomeles Speciosa (Sweet.) Nakai)為木瓜中正品[1]，是一種藥食同源植物，果實中富含糖類、有機酸、蛋白質(zhì)、多種維生素、礦物元素等，營養(yǎng)價值很高.

多糖是木瓜果實中重要的生物活性物質(zhì)，國內(nèi)外僅有為數(shù)不多的幾篇文獻對光皮木瓜、野木瓜多糖的提取及其抗氧化活性進行了研究[4-7]，關(guān)于皺皮木瓜多糖的研究報道更不多見.為了進一步提高皺皮木瓜的經(jīng)濟價值，課題組在前期對皺皮木瓜多糖的提取、化學(xué)改性及其抗氧化活性工作的基礎(chǔ)上[8]，對提取的水溶性木瓜多糖進行分離純化和結(jié)構(gòu)分析，為深入研究皺皮木瓜多糖的理化性質(zhì)、組成結(jié)構(gòu)、生物活性及應(yīng)用提供了實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1原料

新鮮皺皮木瓜采摘于鄭州市黃河游覽區(qū)植物園，粉碎后，將粉末儲存于冰箱備用.皺皮木瓜粗多糖由本實驗室提取，多糖質(zhì)量分數(shù)63%.

1.1.2試劑

葡萄糖(天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心)，D-半乳糖(上海市國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，D-甘露糖(上海市國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，D-木糖(上海伯奧生物科技有限公司)，L-鼠李糖(美國Sigma公司)，葡聚糖凝膠(Sephadex G-100，Sephadex G-200)(美國Sigma公司)，透析袋(Sigma 公司)，無水乙醇、氯仿、苯酚(A.R.，洛陽市化學(xué)儀器廠)，三氟乙酸、吡啶、正丁醇(A.R.，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)，鹽酸羥胺(A.R.，洛陽化學(xué)試劑廠)，醋酸酐、萘酚(A.R.，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心).

1.1.3儀器

微型高速萬能試樣粉碎機(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)，JJ-1型定時電動攪拌器(金壇市華峰儀器有限公司)，RE-52c型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，BSZ-100型自動部分收集器(上海和勤分析儀器有限公司)，SHA-B恒溫水浴振蕩器(金壇市華峰儀器有限公司)，真空冷凍干燥機(上海比朗儀器制造有限公司)，凝膠分離柱(上海亞榮生化儀器廠)，BL-3205型電子天平(精度≥0.000 1 g，日本島津公司)，UV-2450型紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，GC-9790型氣相色譜儀(浙江溫嶺福立分析儀器有限公司)，AVANCE 400型核磁共振譜儀(布魯克北京科技有限公司)，Prestige-21型傅里葉變換紅外光譜儀(日本島津公司)，LC-10AVP型高效液相色譜儀(日本島津公司).

1.2 實驗方法

1.2.1多糖的分離純化

采用 Sevag法去除蛋白質(zhì)，將一定量的多糖溶液中加入氯仿和正丁醇(V(氯仿)∶V(正丁醇)= 5∶1)的混合溶劑，離心20 min，去除多糖溶液層與有機溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)，重復(fù)數(shù)次直至中間無混濁沉淀為止.然后，用透析法去除小分子雜質(zhì).

取5.0 mg 純化后的多糖，1 mL 蒸餾水溶解后，離心20 min，上清液立即裝入Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱，用0.1 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，控制流速為1 mL/min，洗脫液由分布收集器收集，每管5 mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測，合并流出液濃縮至一定體積，乙醇沉淀、過濾、干燥，得到精制的皺皮木瓜多糖.

1.2.2多糖純度鑒定

將Sephadex G-100裝柱，用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡一天.將精制的木瓜多糖溶解后，用0.05 mol/L的NaCl溶液進行洗脫，按每管4 mL 分部收集，用苯酚-硫酸法檢測.

1.2.3多糖的相對分子質(zhì)量的測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定木瓜多糖的相對分子質(zhì)量，相對分子質(zhì)量與多糖在凝膠柱上的洗脫體積Ve、分配系數(shù)Kav存在如下關(guān)系：

Ve=a-b×lgMw，

(1)

Kav=K1-K2×lgMw，

(2)

(3)

式中：a，b，K1，K2為常數(shù)；V0為標(biāo)準(zhǔn)物的洗脫體積；Vt為葡萄糖的洗脫體積.根據(jù)公式(3)，用已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)木瓜多糖的洗脫體積計算木瓜多糖的相對分子質(zhì)量[9].

色譜條件如下：GPC柱為Shim-pack GPC 803 300 mm×4.6 mm；柱溫為40 ℃；流動相為0.7%的Na2SO4加0.05%的NaN3；流量為1.0 mL/min；檢測器為示差折光檢測器；樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL；進樣量為100 μL.

1.2.4單糖組成的測定

(1)多糖糖腈乙酸酯衍生化

于10 mg 多糖中加入濃度為2 mol/L的三氟乙酸5 mL，在100 ℃下密閉水解6 h.將水解液減壓濃縮至干，60 ℃烘箱中干燥后，加入10 mg 鹽酸羥胺和0.5 mL 吡啶，將反應(yīng)液水浴加熱30 min.冷卻至室溫，加入0.5 mL 醋酸酐繼續(xù)反應(yīng)30 min，所得的反應(yīng)液可直接進行氣相色譜分析[10].

(2)標(biāo)準(zhǔn)單糖衍生物的制備

分別稱取葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖各10 mg，按照上述多糖水解液制備多糖糖腈乙酸酯衍生物的方法進行乙酰化反應(yīng).

GC分析過程如下：150 ℃下保持4 min，然后以10 ℃/min升溫至160 ℃，保持8 min，再以5 ℃/min升溫至180 ℃，保持2 min，最后以20 ℃/min升溫至250 ℃，保持5 min.進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為240 ℃，載氣壓力為0.1 MPa.

將樣品圖譜與標(biāo)準(zhǔn)單糖圖譜對照，確定皺皮木瓜多糖的單糖組成.

1.2.5理化性質(zhì)

(1)碘-碘化鉀反應(yīng)

將木瓜多糖樣品制成1 mg/mL的溶液，取1 mL加入碘-碘化鉀溶液，觀察顏色變化.

(2)茚三酮反應(yīng)

取1 mL質(zhì)量濃度1 mg/mL的木瓜多糖溶液，加入0.5 mL 0.1%的茚三酮乙醇溶液，混勻，煮沸1～2 min，冷卻，觀察顏色變化.

(3)Molish反應(yīng)

分別取1 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL的木瓜多糖溶液，各加入2滴Molish試劑(即10%的α-萘酚的乙醇溶液)，混合均勻后將試管傾斜45°，沿試管壁慢慢加入1 mL濃硫酸(勿搖動)，豎立試管，觀察濃硫酸和糖交界面顏色的變化.

1.2.6紅外光譜

取2.0 g純化后的皺皮木瓜多糖粉末，KBr壓片，在4 000～400 cm-1處掃描.

1.2.7紫外光譜

將純化后的皺皮木瓜多糖溶于水，以蒸餾水為參比，在200～400 nm處掃描.

1.2.8核磁共振氫譜

將10 mg 純化后的皺皮木瓜多糖溶于0.5 mL的D2O中，加入TMS，在核磁共振儀上測定1H NMR譜.

2 結(jié)果分析

2.1 皺皮木瓜多糖的純化、分離

皺皮木瓜粗多糖經(jīng)Sevag法脫蛋白、透析除小分子雜質(zhì)后，由棕色粉末變?yōu)榛野咨勰?，苯?硫酸法測定多糖質(zhì)量分數(shù)為80.92%.木瓜多糖的Sephadex G-100柱層析的洗脫曲線見圖1.

從圖1可以看到，木瓜多糖樣品經(jīng)Sephadex G-100柱層析洗脫，分離得到3個峰，分別出現(xiàn)在第6管、第23管和第29管，其中第6管的含糖量最高且峰形尖銳對稱，與另外兩個小峰分離效果好.收集第6管的流出液，減壓濃縮至一定體積，經(jīng)醇沉、過濾、干燥，得精制木瓜多糖，命名為CSP1.這說明利用葡聚糖凝膠柱可以完全分離木瓜多糖.經(jīng)苯酚-硫酸法測定，多糖質(zhì)量分數(shù)為96.29%.

2.2 皺皮木瓜多糖CSP1的純度鑒定

對Sephadex G-100柱層析分離得到的CSP1進行純度鑒定，凝膠柱層析圖譜中出現(xiàn)單一峰且峰形對稱，說明CSP1為均一組分，如圖2所示.

圖1 木瓜多糖的Sephadex G-100柱層析的洗脫曲線Fig.1 Elution curve of CSP1 by Sephadex G-100

圖2 木瓜多糖在Sephadex G-100柱層析的洗脫曲線Fig.2 Elution curve of CSP1 by Sephadex G-100

圖3 葡聚糖的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Standard curve of molecular weight

2.3 木瓜多糖CSP1的相對分子質(zhì)量

圖3是標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=7.218 7-1.441 5X，R2=0.992 9.根據(jù)洗脫體積回歸方法計算，木瓜多糖CSP1的重均相對分子質(zhì)量為27 622.

2.4 木瓜多糖CSP1的單糖組成分析

標(biāo)準(zhǔn)單糖混合物水解的衍生物和木瓜多糖CSP1水解衍生物的氣相色譜圖如圖4所示，氣相色譜保留時間數(shù)據(jù)見表1.

圖4 標(biāo)準(zhǔn)單糖混合衍生物與木瓜多糖衍生物的氣相色譜圖Fig.4 GC spectra of standard monosaccharides derivatives and CSP1 derivate

表1 標(biāo)準(zhǔn)糖與木瓜多糖水解衍生物的保留時間數(shù)據(jù)Tab.1 The retention time of hydrolysis derivatives from standard monosaccharides and CSP1

氣相色譜結(jié)果表明，皺皮木瓜多糖CSP1由鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖組成，摩爾比為0.042∶0.067∶0.860∶0.031，其中葡萄糖是主要的單糖成分.

2.5 皺皮木瓜多糖的理化性質(zhì)

分離純化后的皺皮木瓜多糖CSP1為白色粉末，溶于水，不溶于乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等有機溶劑.理化性質(zhì)測定顯示：苯酚-硫酸反應(yīng)呈陽性，碘-碘化鉀反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)均呈陰性，說明多糖中不含淀粉、氨基酸和蛋白質(zhì)，屬于非淀粉糖.

2.6 光譜鑒定

CSP1的紫外吸收光譜結(jié)果顯示在260 nm處和280 nm處無吸收，表明CSP1不含核酸、多肽和蛋白質(zhì).CSP1的紅外光譜具有典型的多糖特征吸收峰[11]，如圖5所示.各吸收峰的歸屬見表2.

圖5 木瓜多糖CSP1的紅外光譜Fig.5 IR spectrum of CSP1

表2 木瓜多糖CSP1的紅外光譜數(shù)據(jù)Tab.2 Infrared spectrum data of CSP1

從圖5和表2可知，紅外光譜顯示皺皮木瓜多糖在3 400 cm-1處、2 900 cm-1處、1 640 cm-1處和1 100～1 000 cm-1處有多糖的特征吸收峰.1 021 cm-1處出現(xiàn)的強吸收峰是葡萄糖的特征吸收峰,850 cm-1處的吸收峰表明多糖結(jié)構(gòu)中存在α-糖苷鍵[12].890 cm-1處無吸收峰，可以確定不含有β-糖苷鍵.770 cm-1處附近的吸收峰為D-葡萄吡喃糖環(huán)的吸收.同時，在810 cm-1處和870 cm-1處無吸收峰表明無甘露糖的特征吸收，這也與GC結(jié)果相符.因此，通過IR光譜可以初步確定皺皮木瓜多糖屬于α-吡喃糖.

圖6 木瓜多糖的1H-NMR 圖譜Fig.6 1H-NMR spectrum of CSP1

從1H-NMR(圖6)結(jié)果分析，異頭氫質(zhì)子在4.5×10-6～5.5×10-6時出現(xiàn)一個明顯的質(zhì)子信號(δ4.721)，說明木瓜多糖的主要單糖種類有一種,δ5.204 證實多糖中存在α-型糖苷鍵[13-14]，這與木瓜多糖的紅外光譜圖、GC 結(jié)果是相符的，δ3.769、δ3.647和δ3.452為非異頭氫質(zhì)子.

3 結(jié)語

采用水煮醇沉工藝提取的水溶性皺皮木瓜粗多糖經(jīng)過Sevag法脫蛋白、透析法除小分子化合物、Sephadex G-100色譜技術(shù)分離純化得到精制的皺皮木瓜多糖CSP1，多糖質(zhì)量分數(shù)達到96.29%，說明該工藝適用于純化木瓜多糖.CSP1的重均相對分子質(zhì)量為27 622，單糖組成主要有鼠李糖、木糖、葡萄糖、半乳糖，其中葡萄糖是主要的單糖成分.木瓜多糖CSP1具有多糖的典型特征吸收峰，屬于α-吡喃糖，核磁共振氫譜進一步證實了皺皮木瓜多糖中存在α-糖苷鍵.多糖是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子，糖的絕對構(gòu)型、單糖的連接方式、羥基被取代情況等結(jié)構(gòu)信息還有待進一步的深入研究.

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Isolation,purificationandstructuralcharacterizationofpolysaccharidesfromChaenomelesSpecious(Sweet.)Nakai

LIUJie,WANGWen,ZHANGTixiang

(CollegeofChemistry,ChemicalEngineeringandEnvironmentEngineering,HenanUniversityofTechnology,Zhengzhou450001,China)

The study on the isolation, purification, monosaccharides composition and structure of water-soluble polysaccharides from Chaenomeles Specious (Sweet.) Nakai will provide experimental foundation for the further development of chaenomeles. The refined polysaccharides CSP1 were obtained by Sevag method for de-protein, dialysis and Sephadex G-100 gel column chromatography. HPGPC, GC, UV, IR and1H-NMR were used to investigate the constituents and structrue of CSP1. Results CSP1 was homogeneous and the relative molecular weight was 27 622. The monosaccharides were Rha, Xyl, Glu and Gal, respectively, in molar ratio of 0.042∶0.067∶0.860∶0.031. There exists α-glucosidal bond in the polysaccharides, in which Glu is the main constituent.

Chaenomeles Specious (Sweet.) Nakai;polysaccharides;isolation and purification;monosaccharides composition; structure

O69

A

1674-330X(2017)04-0030-05

2017-07-19

河南工業(yè)大學(xué)博士科研基金(150049)

劉捷(1970-)，女，河南鄭州人，副教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物化學(xué).