有機納米材料在植物核酸遞送中的研究進展

霍愛玲+陳金慧+甄艷+夏兵+陳楨雨+施季森

摘要： 將外源遺傳物質(zhì)導入植物細胞是植物生物技術研究中一項非常重要的技術，對農(nóng)林業(yè)的發(fā)展有十分重要的意義，目前常用的植物轉(zhuǎn)基因方法主要包括農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染法和基因槍法，隨著納米生物技術的發(fā)展，基于納米材料為載體的植物轉(zhuǎn)基因技術為植物遺傳轉(zhuǎn)化提供了新途徑。本文綜述了近年來有機納米材料作為外源基因載體的特點、攜帶基因的能力、進入受體植物細胞的機制，并展望了有機高分子納米載體在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的應用，以期促進植物轉(zhuǎn)基因技術的發(fā)展。

關鍵詞： 有機納米材料；載體；核酸遞送；殼聚糖；聚乙烯亞胺；多聚賴氨酸；樹枝狀聚合物

中圖分類號： Q785 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0001-04

自1983年首次研究獲得轉(zhuǎn)基因煙草以來，植物轉(zhuǎn)基因技術迅速發(fā)展，至2015年全球轉(zhuǎn)基因作物的種植面積已達到1.797億hm2。植物基因傳遞系統(tǒng)——將外源基因?qū)胫参锛毎姆椒ǎ侵参锷锛夹g中一個最基本的技術。目前可以使用不同的方法將外源基因?qū)胫参锘蚪M中[3]。根據(jù)轉(zhuǎn)化過程中是否使用載體介導，通?？梢苑譃檩d體介導轉(zhuǎn)化和直接遺傳轉(zhuǎn)化。在常用的載體介導轉(zhuǎn)基因方法中，農(nóng)桿菌介導是最廣泛使用的轉(zhuǎn)化手段；基因槍法是另一種常用的轉(zhuǎn)基因手段，但是轉(zhuǎn)化率較低、會產(chǎn)生大量嵌合體等問題是限制其使用的主要瓶頸。將植物細胞酶解去壁后獲得原生質(zhì)體再進行遺傳轉(zhuǎn)化，也是一類常用的轉(zhuǎn)基因方法，但原生質(zhì)體再生完整植株的難度較大、穩(wěn)定性差的特點限制了這種方法在植物轉(zhuǎn)基因中的廣泛應用。針對上述植物轉(zhuǎn)基因技術的局限，研發(fā)新的轉(zhuǎn)基因方法和挖掘新的基因載體成為現(xiàn)代基因工程研究中的熱點，業(yè)界期待著植物轉(zhuǎn)基因新理論和新技術的突破，來促進植物轉(zhuǎn)基因技術及其相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。相對于源自病毒基因改造的遺傳轉(zhuǎn)化載體，基于納米材料構建的載體具有制備容易、穩(wěn)定性好、容易修飾、生物和環(huán)境安全性高等優(yōu)點，因此納米生物技術已成為劃時代、跨學科的研究重點[4]。

根據(jù)納米材料的組成，可分為無機納米材料和有機高分子納米材料，其中無機納米材料用作植物轉(zhuǎn)基因載體開展得較早，已有較多介紹。本文重點介紹有機納米材料載體轉(zhuǎn)基因技術的特點，并結合其在植物基因轉(zhuǎn)化研究中的應用實例闡述這些方法的優(yōu)點及存在的問題，詳見表1。

1 天然高分子納米基因載體

1.1 殼聚糖（chitosan，簡稱CS）

殼聚糖是廣泛分布于甲殼類動物、昆蟲和真菌細胞壁中的甲殼質(zhì)在堿作用下脫乙?；蟮玫降陌被嗵?。Mulligan等首次利用殼聚糖為載體把外源DNA運輸?shù)讲溉閯游锛毎麅?nèi)，殼聚糖納米載體由于來源天然、生物相容性好、可生物降解、可溶性強、無毒等特點，在生物醫(yī)學上成為研究較多的天然高分子納米基因載體系統(tǒng)[5-6]。

在植物轉(zhuǎn)基因研究中，殼聚糖納米載體的研究處于剛剛起步階段。宋瑜等用殼聚糖為基因載體，制備了CS/DNA納米復合物，直接將綠色熒光蛋白基因（簡稱GFP）轉(zhuǎn)化到擬南芥原生質(zhì)體中，但轉(zhuǎn)化效率很低，而且對細胞有毒害作用[7]。王鳳華等用交聯(lián)法制備了殼聚糖納米顆粒，通過靜電作用吸附質(zhì)粒DNA后，用基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥細胞，觀察到有8%的細胞轉(zhuǎn)化成功并表達目的基因[8]。Wang等通過靜電吸附作用將CS/DNA納米顆粒和硒化鎘量子點（簡稱QDs）納米顆粒連接起來，制備了CS/DNA—QDs復合納米顆粒[9]。這種復合納米顆粒對外源基因具有顯著的酶切保護作用，并實現(xiàn)了GFP轉(zhuǎn)載基因在麻瘋樹細胞內(nèi)的表達。

從上述研究結果來看，殼聚糖納米載體在植物細胞中的轉(zhuǎn)化效率較低，對去壁的植物細胞原生質(zhì)體有一定的毒性。但殼聚糖作為一類天然的高分子聚合物，可以對其進行化學和生物學的修飾來提高它在生理溶液中的穩(wěn)定性、基因轉(zhuǎn)移的特異性和在細胞內(nèi)逃逸的能力。殼聚糖被開發(fā)成為一類環(huán)境友好的新型植物基因工程介導物質(zhì)具有較好的前景。

1.2 淀粉

淀粉是一類價格便宜、產(chǎn)量豐富、可再生的天然材料，通過物理、化學或者酶解的方法可以大大改善它的性能。在醫(yī)藥領域，淀粉常被用作填充劑，由于它具有生物相容性和生物可降解性，也常被用作藥物和基因載體系統(tǒng)。Xiao等利用反向微乳液法合成多聚賴氨酸-淀粉納米顆粒，在乳腺癌細胞中成功地進行了轉(zhuǎn)化試驗[10]。Liu等研究表明，在利用超聲波介導的基因轉(zhuǎn)移試驗中發(fā)現(xiàn)，多聚賴氨酸淀粉納米基因載體能夠保護DNA，使其不受超聲波的影響，而裸露的DNA則會被超聲波破壞[11]。Liu等在超聲波的作用下，用多聚賴氨酸淀粉納米顆粒將含有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到盾葉薯蕷和水稻懸浮細胞中并實現(xiàn)了表達[12]。Wang等利用反向微乳液法合成磁性淀粉納米顆粒，包封多聚賴氨酸，連接異硫氰酸熒光素（簡稱FITC），得到了既有熒光標記、又有磁性的雙功能淀粉納米顆粒，有望成為一種新型的基因載體[13]。

1.3 細胞穿膜肽（cell-penetrating peptides，簡稱CPPs）

細胞穿膜肽是一大類由10～30個氨基酸組成的短肽，具有很強的跨膜轉(zhuǎn)運能力，能夠攜帶多種活性物質(zhì)進入細胞，而且可以導入幾乎所有的細胞中[14]。由于細胞穿膜肽具有很強的跨膜轉(zhuǎn)運能力，對細胞膜不會產(chǎn)生永久性損傷，在一定濃度范圍內(nèi)對宿主細胞無毒害作用。因此，細胞穿膜肽作為一種新型的藥物輸送工具和基因治療的載體引起人們極大的關注和廣泛的使用[15]。

在植物基因運載方面，近幾年Lakshmanan等利用細胞穿膜肽載體分別將質(zhì)粒DNA、dsRNA、dsDNA用注射滲透法轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥的葉片，可以實現(xiàn)外源基因在植物細胞內(nèi)的瞬間表達或者快速、高效誘導基因沉默[16-18]。最近，Chuah等用含有線粒體定位肽的陽離子聚合物結合質(zhì)粒DNA，單獨或者同細胞穿膜肽再結合，用注射滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥葉片，孵育12 h后，報告基因能夠在擬南芥葉片表皮細胞的線粒體中表達[19]。從已有的研究報道可見，細胞穿膜肽作為基因載體可將質(zhì)粒DNA、dsRNA、dsDNA轉(zhuǎn)運進入完整的植物細胞或者某個特定的細胞器中并表達。未來經(jīng)過優(yōu)化和提高其轉(zhuǎn)化率后，細胞穿膜肽這類信號肽類的載體有望成為又一類新興的植物轉(zhuǎn)基因載體，但其入胞機制特別是如何穿過植物細胞壁還值得進一步研究。endprint

2 合成的高分子納米基因載體

除了利用天然高分子材料制備納米基因載體之外，用人工合成的高分子材料制備納米基因載體更具優(yōu)勢，合成和制備相對容易、經(jīng)濟，并且能夠規(guī)?；a(chǎn)。目前在植物基因轉(zhuǎn)化中使用較多的由合成高分子材料制備的納米載體包括聚乙烯亞胺（polyethylenimine，簡稱PEI）、多聚賴氨酸（poly-L-lyine，簡稱PLL）和樹枝狀聚合物。

2.1 聚乙烯亞胺

聚乙烯亞胺是一種常用的陽離子聚合物，是動物細胞轉(zhuǎn)基因中常用的體外或體內(nèi)非病毒基因載體，主要以分支狀或線狀結構形式存在[20]。分支狀聚乙烯亞胺含有伯胺、仲胺、叔胺，線狀聚乙烯亞胺主要含有仲胺。這些氨基基團使分支狀聚乙烯亞胺在較寬pH值范圍內(nèi)具有緩沖能力，即所謂的“質(zhì)子海綿效應”，PEI/DNA復合物被細胞內(nèi)吞后，引起外源質(zhì)子內(nèi)流，隨后水分大量涌入導致內(nèi)吞囊泡裂解、釋放出的PEI/DNA復合物穿過核膜進入細胞核，通過這個過程完成基因轉(zhuǎn)染[21-22]。由于PEI本身對動物細胞有一定的毒害作用，最近主要通過使用交聯(lián)低分子量PEI或者將低分子量PEI和生物可分解的陰離子基團結合起來的方法來減少PEI載體對細胞的毒性，提高轉(zhuǎn)染率[23]。在用于植物基因轉(zhuǎn)染方面，Ying等以PEI（分子量25 000）為載體介導含有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒在擬南芥原生質(zhì)體中瞬間表達，轉(zhuǎn)化率達到65%[24]。但PEI是否能進入有壁的植物細胞以及進入植物原生質(zhì)體的機制尚有待進一步研究。

2.2 多聚賴氨酸

多聚賴氨酸是一種以賴氨酸分子為重復單元的線狀多肽結構，它最大的優(yōu)點是易于對其結構進行修飾，因此常被用作修飾物結合到其他納米材料的表面[25]。在生理條件下，多聚賴氨酸中的氨基被質(zhì)子化，能與DNA通過靜電作用結合，多聚賴氨酸與DNA能以不同的比例相結合，相應形成從50 nm到700 nm不同尺寸的微粒。由于多聚賴氨酸缺少等電點處于5～7之間的氨基基團，利用多聚賴氨酸作為基因載體時，須要額外提供輔助因子如加入融合肽或氯喹，以促使溶酶體或內(nèi)吞體裂解。在植物中尚未見將多聚賴氨酸單獨用作基因載體的報道，多是將其修飾在其他納米材料表面用于結合質(zhì)粒DNA[19，26]。

2.3 樹枝狀聚合物

樹枝狀聚合物指的是一類以內(nèi)核分子為中心，延伸出許多具有樹枝狀高度分枝結構的球形分子，常用的包括聚乙二胺、聚乙烯亞胺和聚酰胺樹枝狀聚合物[27]。其中，聚酰胺樹枝狀聚合物（polyamidoamine dendrimers，簡稱PAMAM）由于容易合成，也容易得到市售產(chǎn)品，成為一類廣泛使用的基因運送聚合物載體。PAMAM的基本特點是分散指數(shù)較低，容易形成球形，不飽和雙鍵數(shù)量多，表面功能特性易于控制等。樹枝狀聚合物通常是通過分支末端帶正電荷的基團和DNA帶負電荷的磷酸基團之間的靜電作用相互結合，形成直徑約為50 nm的DNA-樹枝狀多聚復合物，能夠保護DNA免受核酸酶的降解作用。在植物轉(zhuǎn)基因研究中，Pasupathy等曾使用PAMAM將綠色熒光蛋白的質(zhì)粒導入草坪草的愈傷組織細胞中，轉(zhuǎn)化率可以達到48.5%[28]。

3 高分子納米載體的入胞機制

制備的納米材料與基因耦合構建成的轉(zhuǎn)基因載體，能否順利穿過細胞壁進入植物細胞，是能否在植物轉(zhuǎn)基因工程中應用的關鍵。而納米載體的入胞機制和效率，受到納米材料尺寸、表面理化性質(zhì)、植物細胞壁特征、共孵育環(huán)境條件等諸多因素的影響。目前，已經(jīng)成功將外源基因?qū)胫参锛毎挠袡C納米載體有殼聚糖、淀粉納米顆粒、細胞穿膜肽、聚乙烯亞胺等，揭示的納米載體攜帶外源基因進入植物細胞的機制見圖1。

首先，DNA或RNA等外源分子可以通過疏水作用、靜電吸附作用或共價鍵結合等結合在納米顆粒的表面或者封裝在納米顆粒的內(nèi)部，形成裝載有外源基因的納米顆粒耦合物。載有外源基因的納米顆粒耦合物可以通過2條途徑將外源基因送進植物細胞并得到表達。一類是利用物理力或場對細胞施加的主動影響，如電激、超聲波、基因槍、外加磁場或低能重離子束場，在細胞上同時形成一些可逆的瞬間通道，外源基因被直接送入到細胞質(zhì)或細胞核內(nèi)[29]；另一類是利用載有外源基因的納米顆粒耦合物通過靜電吸附等作用附著在植物組織或細胞的周圍，然后經(jīng)胞間連絲等細胞壁上的孔隙通過細胞壁，或者利用修飾過的工程納米顆粒同細胞壁上受體的相互作用來擴大細胞壁的孔徑以提高納米顆粒的攝入[16]。穿過細胞壁后，大多數(shù)納米顆粒耦合物載體通過細胞膜的內(nèi)吞作用進入細胞質(zhì)，有的可能通過細胞膜上的轉(zhuǎn)運載體蛋白或者離子通道轉(zhuǎn)運進入細胞質(zhì)。Ghosh等認為，納米載體攜帶的基因，進入到細胞以后，在細胞內(nèi)源因素（如pH值刺激）和外源因素（如光刺激）的激發(fā)下釋放出納米載體所攜帶的遺傳物質(zhì)。顯然內(nèi)源的激發(fā)基因釋放機制是按照生物學的方式運作的，而外源的激發(fā)基因釋放機制則提供一種可以通過時間和空間控制釋放基因的方法[30]。

其次，DNA導入細胞核并整合到植物基因組中發(fā)揮功能。一般來說，分子都是通過核孔復合物進入細胞核的。對于DNA是單獨進入細胞核還是與納米載體整合后一起進入細胞核仍無定論，目前主要有2種理論。一種是納米載體在內(nèi)涵體或細胞質(zhì)中被溶解，然后釋放DNA轉(zhuǎn)運進核，同植物細胞的基因組發(fā)生非同源重組，從而整合到植物基因組上得以穩(wěn)定表達；另一種是攜帶DNA的納米載體直接到達細胞核表面，然后DNA轉(zhuǎn)運進核，并離開基因載體還原成具有生物活性的DNA，最后經(jīng)過轉(zhuǎn)錄、翻譯步驟合成目標蛋白[31]。

4 展望

雖然按照構成材料組成可以將納米顆粒分為無機和有機2種，在納米材料載體實際的制備和運用中，通常是充分利用各類材料的優(yōu)勢，使用的是復合型納米材料。例如常在各類無機納米顆粒和有機高分子材料的表面修飾上多聚賴氨酸、聚乙烯亞胺等高分子聚合物，甚至是再連接上量子點熒光標記或者加上細胞穿膜肽等靶分子，使其成為一個“超級復合納米載體”——可以大量裝載DNA、RNA等外源基因，高效定向地進入有壁的植物細胞實現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定表達。endprint

多基因轉(zhuǎn)化是近年來植物轉(zhuǎn)基因研究的一個亮點，而納米載體轉(zhuǎn)化法容量大，一次可將多個不同的質(zhì)粒導入細胞內(nèi)，并可在細胞內(nèi)源因素和外源因素的作用下實現(xiàn)基因的可控釋放，這些特點為植物基因功能的研究提供了一條新的途徑。

[HS2][HT8.5H]參考文獻：

[1] Herrera-Estrella L，van den Broeck G，Maenhaut R，et al. Light-inducible and chloroplast-associated expression of a chimaeric gene introduced into Nicotiana tabacum using a Ti plasmid vector[J]. Nature，1984，310（5973）：115-120.

[2]James C，Teng P，Arujanan M，et al. Global status of commercialized biotech/GM crops：2015[R]. New York：ISAAA，2015.

[3]Chilton M D. Adding diversity to plant transformation[J]. Nature Biotechnology，2005，23（3）：309-310.

[4]Medintz I L，Tirrell M. Editorial overview：nanobiotechnology：a time-stamped cross-sectional analysis[J]. Current Opinion in Biotechnology，2015，34：vii-ix.

[5]Mulligan R C，Howard B H，Berg P. Synthesis of rabbit β-globin in cultured monkey kidney cells following infection with a SV40 β-globin recombinant genome[J]. Nature，1979，277（5692）：108-114.

[6]Buschmann M D，Merzouki A，Lavertu M，et al. Chitosans for delivery of nucleic acids[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2013，65（9）：1234-1270.

[7]宋 瑜，李 穎，崔海信，等. 兩種陽離子納米基因載體及植物基因介導效果的研究[J]. 生物技術通報，2009（6）：75-80.

[8]王鳳華，劉 俊，唐冬英，等. 基于殼聚糖納米顆粒的基因槍法轉(zhuǎn)化洋蔥細胞研究[J]. 湖南大學學報（自然科學版），2009，36（5）：67-70.

[9]Wang Q，Chen J N，Zhang H Y，et al. Synthesis of water soluble quantum dots for monitoring carrier-DNA nanoparticles in plant cells[J]. Journal of Nanoscience and Nanotechnology，2011，11（3）：2208-2214.

[10] Xiao S Y，Liu X M，Tong C Y，et al. Studies of poly-L-lysine-starch nanoparticle preparation and its application as gene carrier[J]. Science in China Series B：Chemistry，2005，48（2）：162-166.

[11]Liu J，Liu X M，Xiao S Y，et al. Bioconjugated nanoparticle for DNA protection from ultrasound damage[J]. Analytical Sciences，2005，21（3）：193-195.

[12]Liu J，Wang F H，Wang L L，et al. Preparation of fluorescence starch-nanoparticle and its application as plant transgenic vehicle[J]. Journal of Central South University of Technology，2008，15（6）：768-773.

[13]Wang F H，Liu J，Tang D Y，et al. Synthesis and biochemical properties of fluorescent/magnetic bifunctional starch particles[J]. Journal of Central South University of Technology，2010，17（2）：211-217.

[14]Chugh A，Eudes F，Shim Y S. Cell-penetrating peptides：nanocarrier for macromolecule delivery in living cells[J]. Iubmb Life，2010，62（3）：183-193.

[15]Farkhani S M，Valizadeh A，Karami H，et al. Cell penetrating peptides：efficient vectors for delivery of nanoparticles，nanocarriers，therapeutic and diagnostic molecules[J]. Peptides，2014，57：78-94.endprint

[16]Lakshmanan M，Kodama Y，Yoshizumi T，et al. Rapid and efficient gene delivery into plant cells using designed peptide carriers[J]. Biomacromolecules，2012，14（1）：10-16.

[17]Numata K，Ohtani M，Yoshizumi T，et al. Local gene silencing in plants via synthetic dsRNA and carrier peptide[J]. Plant Biotechnology Journal，2014，12（8）：1027-1034.

[18]Lakshmanan M，Yoshizumi T，Sudesh K，et al. Double-stranded DNA introduction into intact plants using peptide-DNA complexes[J]. Plant Biotechnology，2015，32（1）：39-45.

[19]Chuah J A，Yoshizumi T，Kodama Y，et al. Gene introduction into the mitochondria of Arabidopsis thaliana via peptide-based carriers[J]. Scientific Reports，2015，5：7751.[HJ1.78mm]

[20]Boussif O，Lezoualch F，Zanta M A，et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo：polyethylenimine[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences，1995，92（16）：7297-7301.

[21]Godbey W T，Wu K K，Mikos A G. Poly （ethylenimine） and its role in gene delivery[J]. Journal of Controlled Release，1999，60（2）：149-160.

[22]Godbey W T，Wu K K，Mikos A G. Poly （ethylenimine）-mediated gene delivery affects endothelial cell function and viability[J]. Biomaterials，2001，22（5）：471-480.

[23]Taranejoo S，Liu J，Verma P，et al. A review of the developments of characteristics of PEI derivatives for gene delivery applications[J]. Journal of Applied Polymer Science，2015，132（25）：1-8.

[24]Ying L I，Cui H，Yu S，et al. Transient expression of exogenous gene into plant cell mediated by PEI nanovector[J]. Agricultural Sciences in China，2011，10（6）：820-826.

[25]Park S，Healy K E. Nanoparticulate DNA packaging using terpolymers of poly （lysine-g-（lactide-b-ethylene glycol））[J]. Bioconjugate Chemistry，2003，14（2）：311-319.

[26]孔倩倩. 麻瘋樹高效再生體系的建立及納米載體轉(zhuǎn)基因技術研究[D]. 長沙：中南林業(yè)科技大學，2010：29-37.

[27]Shcharbin D G，Klajnert B，Bryszewska M. Dendrimers in gene transfection[J]. Biochemistry （Moscow），2009，74（10）：1070-1079.

[28]Pasupathy K，Lin S，Hu Q，et al. Direct plant gene delivery with a poly （amidoamine） dendrimer[J]. Biotechnology Journal，2008，3（8）：1078-1082.

[29]余增亮. 離子束生物技術引論[M]. 合肥：安徽科學技術出版社，1998：250-267.

[30]Ghosh P，Han G，De M，et al. Gold nanoparticles in delivery applications[J]. Advanced Drug Delivery Reviews，2008，60（11）：1307-1315.

[31]Miller G，van Schaik D. Nanotechnology in food and agriculture [M]. Switzerland：Springer International Publishing，2008：209-240.endprint