黃粉蟲蟲粉對球孢白僵菌孢子粉產(chǎn)量、質(zhì)量及其毒力的影響

陶淑霞+薛丹+肖悅+田徑

摘要： 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）在營養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基質(zhì)上，菌株易發(fā)生退化，為保持高毒力優(yōu)良菌株的穩(wěn)定性，采用固液雙相法生產(chǎn)球孢白僵菌分生孢子粉，在大米固態(tài)培養(yǎng)基中加入不同劑量的黃粉蟲蟲粉，研究添加蟲粉對孢子粉產(chǎn)量、質(zhì)量及其對大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella）毒力的影響。結(jié)果表明，添加蟲粉對球孢白僵菌的產(chǎn)粉量具有明顯的促進(jìn)作用，其中5.0+處理組的產(chǎn)粉量達(dá)到46.88 mg/g；添加蟲粉對孢子粉活孢率無顯著影響，但各處理組間的萌發(fā)速率不同，其中5.0+處理組的孢子萌發(fā)率達(dá)到50%、90%所需的時(shí)間分別為13.86、20.77 h，明顯短于對照組。5.0+處理組的孢子粉對大豆食心蟲毒力最高，接種后第10天的校正死亡率達(dá)到98.27%，侵染率為96.67%，致死中時(shí)（lethal time of 50%，簡稱LT50）為5.58 d。說明添加蟲粉可以明顯提高大米固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)球孢白僵菌的孢子粉產(chǎn)量和質(zhì)量，有利于保持高毒力優(yōu)良菌株的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞： 球孢白僵菌；黃粉蟲蟲粉；孢子粉；毒力；大豆食心蟲；微生物防治

中圖分類號： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0114-03

球孢白僵菌（Beauveria bassiana）作為一種重要的生物防治介體，由于它對環(huán)境無污染、對人和動(dòng)物無毒害、殺蟲譜廣、致病性強(qiáng)，從而成為目前國內(nèi)外應(yīng)用最廣泛的昆蟲病原真菌。球孢白僵菌是害蟲微生物防治中的一種經(jīng)典絲孢類昆蟲病原真菌，可侵染15個(gè)目149個(gè)科的700多種昆蟲和若干種螨類。在自然界中，它具有分布范圍廣、感染力強(qiáng)、易于擴(kuò)散流行的特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是具有開發(fā)潛力的生防真菌 。

隨著球孢白僵菌的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，人們對高質(zhì)量、高純度球孢白僵菌分生孢子的需求量越來越大。生產(chǎn)上面臨著由菌株退化而導(dǎo)致的防效不穩(wěn)、高毒力菌株多代移植后毒力退化的問題[3]。因此在實(shí)際生產(chǎn)中控制菌株退化是十分必要的。長期在營養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基質(zhì)上培養(yǎng)球孢白僵菌容易導(dǎo)致菌株產(chǎn)生退化現(xiàn)象[4]。因此，根據(jù)目前球孢白僵菌生產(chǎn)和應(yīng)用的現(xiàn)狀，亟待解決的問題之一是如何保持高毒力優(yōu)良菌株的穩(wěn)定性。

黃粉蟲是一種高蛋白、高脂肪、氨基酸含量較全面的資源昆蟲。本試驗(yàn)選用經(jīng)毒力測定對大豆食心蟲具有高毒力的球孢白僵菌Bb02作為供試菌株，采用固液雙相法生產(chǎn)球孢白僵菌分生孢子粉，在大米固態(tài)培養(yǎng)基中加入不同劑量的黃粉蟲蟲粉，研究添加蟲粉對孢子粉含孢量、活孢率、孢子萌發(fā)速率及其對大豆食心蟲毒力的影響，以求證添加蟲粉對孢子粉質(zhì)量、產(chǎn)量及對大豆食心蟲毒力的影響，為今后球孢白僵菌孢子粉的工業(yè)化生產(chǎn)提供必要參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)中所選用的球孢白僵菌為分離自大豆食心蟲越冬幼蟲且經(jīng)過篩選對其具有高毒力的Bb02菌株。

1.2 供試?yán)ハx

大豆食心蟲采自吉林省長春市吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)基地大豆田，自然脫莢的越冬老熟幼蟲。選擇健康、整齊一致的幼蟲用于試驗(yàn)。黃粉蟲由吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲實(shí)驗(yàn)室提供，取新鮮健康的黃粉蟲蛹，微波烘干，研磨成粉備用。

1.3 球孢白僵菌孢子粉生產(chǎn)

1.3.1 液體培養(yǎng)

采用固液雙相法生產(chǎn)球孢白僵菌分生孢子粉，應(yīng)用SDY培養(yǎng)基（成分：葡萄糖為40 g，酵母浸出粉為10 g，蛋白胨為10 g，水為1 000 mL）進(jìn)行母液和子液培養(yǎng)。將篩選出的高毒力菌株Bb02的孢子粉接入20 mL的SDY培養(yǎng)基中，在25 ℃，130 r/min搖床中培養(yǎng)48 h后，取1 mL母液加入到滅菌后的100 mL SDY培養(yǎng)基中，在25 ℃，130 r/min搖床中進(jìn)行子液培養(yǎng)24 h。

1.3.2 固體培養(yǎng)

每個(gè)保鮮袋盛裝100 g大米，拌入0.5 mL豆油，分別添加蟲粉1.0、2.5、5.0 g，替代相應(yīng)等量的大米，以不添加蟲粉為對照，各處理分別用1.0+、2.5+、5.0+、CK表示，每個(gè)處理重復(fù)3次。經(jīng)濕熱滅菌至適當(dāng)熟度，取子液接入其中并進(jìn)行下一步培養(yǎng)，接種量為13%（體積/質(zhì)量），充分混合后鋪平，將袋口邊折起。在溫度為25 ℃、相對濕度為75%的條件下培養(yǎng)14 d。將發(fā)酵物置于超凈工作臺上自然晾干后，用200目標(biāo)準(zhǔn)篩收集孢子粉。對收集的孢子粉進(jìn)行質(zhì)量檢測。

1.4 球孢白僵菌產(chǎn)粉量和孢子粉質(zhì)量的測定

產(chǎn)粉量：每袋大米培養(yǎng)物上收獲的孢子粉質(zhì)量除以大米質(zhì)量即為產(chǎn)粉量（mg/g）。

含孢量：稱取孢子粉1 mg加入到50 mL 0.05%吐溫-80溶液中，經(jīng)磁力攪拌器充分?jǐn)嚢瑁?00 r/min）后鏡檢單孢率為100%時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板測定孢子懸浮液濃度（個(gè)/mL），計(jì)算1 g孢子粉所含的孢子個(gè)數(shù)，即為含孢量（個(gè)/g）。

含水量：將稱量瓶烘干稱質(zhì)量，加入約100 mg孢子粉，將稱量瓶和孢子粉在100 ℃下干燥2 h后取出稱質(zhì)量，計(jì)算含水量（%）。

活孢率：取適量孢子粉加入至50 mL SDY培養(yǎng)基中，配成濃度為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，在25 ℃條件下，130 r/min培養(yǎng)24 h，鏡檢萌發(fā)率，即為孢子粉的活孢率（%）。孢子萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)為芽管長度等于或大于孢子直徑[5]。

1.5 球孢白僵菌孢子萌發(fā)速率測定

分別取1.0+、2.5+、5.0+、CK組孢子粉適量，加入 50 mL SDY培養(yǎng)基中，配成濃度為1.0×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，在25 ℃，130 r/min搖床中培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)6、12、18、24、30 h時(shí)，用微量移液器吸取20 μL菌液滴在血球計(jì)數(shù)板上，然后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，測定孢子的萌發(fā)率，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6 球孢白僵菌芽生孢子濃度的測定

將上述用于測定孢子萌發(fā)率的菌液繼續(xù)培養(yǎng)至48 h時(shí)觀察芽生孢子，分別在培養(yǎng)48、72、96、168 h時(shí)，用微量移液器吸取20 μL 培養(yǎng)液，加入到380 μL無菌水中進(jìn)行稀釋。然后用微量移液器吸取20 μL滴在血球計(jì)數(shù)板上，然后置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，測定芽生孢子濃度（個(gè)/mL），每個(gè)菌株3次重復(fù)。

1.7 球孢白僵菌孢子粉毒力測定

分別稱取各處理組孢子粉與滅菌土（過50目篩）充分混勻，使1 g菌土中含有1.0×107個(gè)分生孢子。將含水量為20%的滅菌土壤盛于塑料杯（8 cm×12 cm）中，然后在表面均勻?yàn)⑸吓渲频木粒總€(gè)杯子接入20頭健康的大豆食心蟲老熟幼蟲，使 之在菌土上自由爬行，待幼蟲鉆入土壤后，將杯口用保鮮膜封好，放于25 ℃培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理重復(fù)3次，分別在接種后第4、6、8、10天調(diào)查幼蟲死亡情況，同時(shí)撿出死蟲將其保濕培養(yǎng)。觀察球孢白僵菌侵染情況，統(tǒng)計(jì)幼蟲死亡率、校正死亡率和侵染率，并計(jì)算致死中時(shí)（lethal time of 50%，簡稱LT50）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；單因素方差分析（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)各蟲粉添加組孢子粉的產(chǎn)量、質(zhì)量及其對大豆食心蟲毒力的差異顯著性（P<0.05）； 用回歸分析中曲線估計(jì)擬合孢子粉的萌發(fā)率隨培養(yǎng)時(shí)間變化的過程；用回歸分析中Probit分析各處理組孢子粉對大豆食心蟲的LT50。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加蟲粉對球孢白僵菌孢子粉產(chǎn)量和質(zhì)量的影響

由表1可知，各處理組間的球孢白僵菌產(chǎn)粉量具有顯著差異（F3，11=175.299，P<0.000 1），添加蟲粉對球孢白僵菌產(chǎn)粉量具有明顯的促進(jìn)作用，其中5.0+組的球孢白僵菌產(chǎn)粉量高達(dá)46.88 mg/g，對照組的球孢白僵菌產(chǎn)粉量只有1862 mg/g。各處理組的含水量（F3，11=0.03，P=0.993）和含孢量（F3，11=0.277，P=0.841）均無顯著差異。蟲粉添加組[CM（25]的活孢率隨著蟲粉添加量的增加而增加，但未達(dá)到顯著差

異水平（F3，11=1.512，P=0.284）。

2.2 添加蟲粉對球孢白僵菌孢子萌發(fā)速率的影響

各處理組的球孢白僵菌孢子萌發(fā)率觀察值如圖1所示，添加組和對照組球孢白僵菌孢子粉在第24 h的萌發(fā)率差異并不顯著（F3，11=1.512，P=0.284）。用Logistic方程 A為最大觀測值的漸近值；B為常數(shù)；k為增長率）擬合球孢白僵菌孢子粉的萌發(fā)率（G）隨培養(yǎng)時(shí)間（t）變化的過程，擬合結(jié)果較好[6]。根據(jù)擬合模型計(jì)算球孢白僵菌孢子萌發(fā)率達(dá)到50%、90%所需的時(shí)間，5.0+組分別為13.86、20.77 h，2.5+組別為15.10、21.88 h，1.0+組分別為16.04、22.63 h，對照組分別為16.57、22.70 h。雖然添加組和對照組球孢白僵菌孢子粉的最終萌發(fā)率是一致的，但5.0+組的孢子萌發(fā)速度最快，對照組孢子的萌發(fā)速度最慢，表明添加蟲粉對球孢白僵菌孢子的萌發(fā)速率具有促進(jìn)作用。

2.3 添加蟲粉對球孢白僵菌芽生孢子濃度的影響

由表2可知，培養(yǎng)48 h后5.0+組的球孢白僵菌芽生孢子濃度為 1.24×106個(gè)/mL，顯著高于其他組（F3，11=11.786，P=0.03），而2.5+、1.0+組與對照組差異不顯著。在培養(yǎng)72 h（F3，11=74.115，P<0.000 1）、96 h（F3，11=39.195，P<0.000 1）、168 h（F3，11=125.061，P<0.000 1）時(shí)，各處理組間球孢白僵菌芽生孢子濃度存在顯著差異，芽生孢子濃度隨著蟲粉添加量的增加呈現(xiàn)顯著的上升趨勢，表明添加蟲粉對Bb02菌株液體發(fā)酵芽生孢子濃度有明顯的促進(jìn)作用。

2.4 添加蟲粉對球孢白僵菌孢子粉毒力的影響

由表3可知，與對照組相比，5.0+組的球孢白僵菌孢子粉對大豆食心蟲的校正死亡率（P=0.022）、侵染率（P=0046）有顯著影響。5.0+組對大豆食心蟲毒力最高，接種后第10天的校正死亡率達(dá)到98.27%，侵染率為96.67%，LT50為 5.58 d，而對照組接種后第10天的校正死亡率為9138%，侵染率為8833%，LT50為6.64 d，可見添加蟲粉能明顯提高球孢白僵菌對大豆食心蟲老熟幼蟲的毒力。

3 討論

蟲生真菌在繼代培養(yǎng)過程中會(huì)發(fā)生高頻率的退化現(xiàn)象，表現(xiàn)為菌落角變、氣生菌絲化、分生孢子產(chǎn)生能力下降或喪失、重要次生代謝產(chǎn)物合成能力下降或喪失，往往給蟲生真菌的工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用帶來重大損失[7-8]。球孢白僵菌的高度變異可引起生產(chǎn)菌種的退化，從而導(dǎo)致毒力降低，嚴(yán)重影響防治效果。因此在生產(chǎn)和應(yīng)用中，選育高毒力菌株的同時(shí)，應(yīng)采取有效措施控制變異。在營養(yǎng)貧乏的培養(yǎng)基質(zhì)上，球孢白僵菌菌株易發(fā)生變異，為保持高毒力優(yōu)良菌株的穩(wěn)定性，應(yīng)選擇適宜的培養(yǎng)基質(zhì)[9]。

王福祥等在培養(yǎng)球孢白僵菌的PDA培養(yǎng)基中加入黃粉蟲幼蟲發(fā)現(xiàn)，與對照相比，添加幼蟲的處理組在營養(yǎng)生長量、孢子萌發(fā)率、產(chǎn)孢量和酶活性等方面均有所提高[10]，但在培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢狀況和應(yīng)用中的規(guī)模化生產(chǎn)還存在著很大差異[11]，所以還不能充分反映生產(chǎn)中的實(shí)際產(chǎn)孢情況。因此，本試驗(yàn)將黃粉蟲蟲粉添加到大米固態(tài)培養(yǎng)基中，采用固液雙相法對供試菌株進(jìn)行適當(dāng)規(guī)模的擴(kuò)大生產(chǎn)。結(jié)果表明，添加蟲粉可以顯著提高大米固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)球孢白僵菌的孢子粉產(chǎn)量和質(zhì)量，有利于保持高毒力優(yōu)良菌株的穩(wěn)定性。

目前，球孢白僵菌孢子粉的活孢率以24 h的萌發(fā)率表示[12]。然而，活孢率相同的孢子粉并不意味著其孢子的萌發(fā)進(jìn)程一致[13]。本研究在培養(yǎng)基質(zhì)中添加黃粉蟲蟲粉雖未影響球孢白僵菌孢子粉的活孢率，但與對照相比，球孢白僵菌孢子萌發(fā)率達(dá)到50%、90%所需的時(shí)間卻明顯縮短，表明添加黃粉蟲蟲粉可能影響球孢白僵菌孢子恢復(fù)活力的進(jìn)程或吸水萌發(fā)的速度，與對照相比，對大豆食心蟲的毒力也有所增加，這種差異正好從孢子萌發(fā)速度差異的比較中得到合理解釋，即萌發(fā)速度越快的孢子毒力越強(qiáng)。由此印證，任何影響孢子萌發(fā)的因素都將影響到孢子毒力[14]。

穩(wěn)定并提高蟲生真菌的毒力對發(fā)展有效的商品制劑至關(guān)重要。蟲生真菌入侵寄主的過程與其對體壁結(jié)構(gòu)物質(zhì)分解酶的活性有關(guān)，幾丁質(zhì)酶和蛋白降解酶在蟲生真菌入侵寄主體壁的過程中起重要作用，其活性高低是決定真菌侵染能力的重要因素[15-16]。蟲生真菌的幾丁質(zhì)酶和蛋白降解酶都具有誘導(dǎo)性。研究表明，不同的真菌培養(yǎng)基也影響真菌毒力。Milner發(fā)現(xiàn)，粉擬青霉菌株對麥長管蚜（Sitobion avenae）的毒力在蚜蟲或含蚜蟲表皮的瓊脂板上傳代3代后LT50從11.1 d下降到 5 d[17]。Pinto等發(fā)現(xiàn)，黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride）蛋白降解酶的活性在該菌的培養(yǎng)液中存在，但當(dāng)有昆蟲表皮存在時(shí)能高度表達(dá)[18]。本研究在培養(yǎng)基質(zhì)中加入蟲粉顯著提高球孢白僵菌對大豆食心蟲的毒力，也進(jìn)一步表明加入昆蟲物質(zhì)可誘導(dǎo)蟲生真菌毒力的提高，說明毒力因子易受培養(yǎng)底物的誘導(dǎo)，為提高真菌毒力提供了有價(jià)值的途徑。

參考文獻(xiàn)：

[1] 林乃銓. 害蟲生物防治[M]. 北京：科學(xué)出版社，2010，238.

[2]Feng M G，Poprawski T J，Khachatourians G G. Production，formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control：current status[J]. Biocontrol Science and Technology，1994，4（1）：3-34.

[3] 唐曉慶，樊美珍，李增志. 球孢白僵菌繼代培養(yǎng)中菌落局變現(xiàn)象及環(huán)境影響因素的研究[J]. 真菌學(xué)報(bào)，1996，15（3）：188-196.

[4]蔡國貴，林慶源，徐耀昌，等. 白僵菌菌株退化與培養(yǎng)條件關(guān)系及其控制技術(shù)[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，21（1）：76-79.

[5]Hong T D，Gunn J，Ellis R H，et al. The effete of storage environment on the longevity of conidia of Beauveria bassiana[J]. Mycological Researeh，2001，105（5）：597-602.

[6]董江水. 應(yīng)用SPSS軟件擬合Logistic曲線研究[J]. 金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，23（1）：21-24.

[7]張正坤，孫召朋，張語遲，等. 繼代培養(yǎng)對球孢白僵菌毒素產(chǎn)生水平的影響[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28（24）：243-249

[8]王成樹，呂丁丁，李 琳. 蟲生真菌致病與退化機(jī)理研究[C]//中國菌物學(xué)會(huì)第四屆會(huì)員代表大會(huì)暨全國第七屆菌物學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集. 湖北武漢，2008：10-17.

[9]樊美珍，李增智，唐曉慶. 白僵菌菌種退化及其控制[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，23（3）：239-245.

[10] 王福祥，溫曉蕾，王長青，等. 黃粉蟲蟲粉對白僵菌生長的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（18）：9575-9576，9596.

[11]Quesada-Moraga E，Maranhao E A A，Valverde-Garcia P，et al. Selection of Beauveria bassiana isolates for conrol of the whiteflies Bemisia tabaci and Trialeurodes vaporariorum on the basis of their virulence，thermal requirements，and toxicogenic activity[J]. Biological Control，2006，36（3）：274-287.

[12]殷鳳鳴，潘務(wù)耀，李增智. 白僵菌生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1996，23（3）：321-325.

[13]應(yīng)勝華，馮明光. 真空干燥球孢白僵菌純孢粉的活孢率、毒力與貯存期[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2002，29（5）：42-47.

[14]Anderson T E，Roberts D W. Compatibility of Beauveria bassiana isolates with insecticide formulations used in colorado potato beetle （Coleoptera：Chrysomelidae） control[J]. Journal Economic Entomology，1983，76（6）：1437-1441.

[15]Wang C S，Hu G，st Leger R J. Differential gene expression by Metarhizium anisopliae growing in root exudate and host（Manduca sexta）cuticle or hemolymph reveals mechanisms of physiological adaptation[J]. Fungal Geneties and Biology，2005，42（8）：704-718.

[16]Robert A，Messing-AI-Aidfroos K. Acid production by Metarhizium anisoplia：effects on virulence against mosquitoes and on detection of invitro amylase，protease and lipase activity[J]. Journal of Invertebrate Pathology，1985，45（1）：9-15.

[17]Milner R J. Prospects for biopesticides for aphid control[J]. Entomophaga，1997，42（1/2）：227-239.

[18]Pinto F G S，F(xiàn)ungaro M H P，F(xiàn)erreira J M，et al. Genetic variation in the cuticle-degrading protease activity of the entomopathogen Metarhizium flavoviride[J]. Genetics and Molecular Biology，2002，25（2）：231-234.