黃小忠+謝正林+許俊齊+張寶珍
摘要: 通過蟬花僵蟲體、子座芽、孢子3個部分的分離培養(yǎng),利用單因素和正交試驗,優(yōu)化生產(chǎn)蟲草酸各營養(yǎng)因子的最佳種類和配比,以達到蟬花真菌的分離及液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化效果。結(jié)果表明,分離得到的蟬花真菌為擬青霉屬蟬擬青霉[Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson];工藝優(yōu)化后得出蟬花液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為蔗糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L;生物量和蟲草酸總產(chǎn)量能分別提高1.852 g/L、17.774 mg/g。
關鍵詞: 蟬花真菌;分離培養(yǎng);液體發(fā)酵;工藝優(yōu)化;培養(yǎng)基優(yōu)化
中圖分類號: S567.3+90.43 文獻標志碼: A
文章編號:1002-1302(2017)22-0153-03
蟬花(Cordyceps cicadae)別稱蟬蟲草、蟬茸、胡蟬等,主要產(chǎn)于江浙一帶丘陵竹林中,云南和四川等地也有分布。蟬花藥性甘寒、無毒,《本草綱目》記載“蟬花可治療驚癇,夜啼心悸,功同蟬蛻”。蟬花中含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、真菌多糖等生理活性物質(zhì),具有鎮(zhèn)痛退熱、鎮(zhèn)靜明目、降低血壓、抗疲勞、抗腫瘤及提高免疫力的功效[1]。蟬花一般生長在針闊混交林帶,山巒平緩起伏,生態(tài)環(huán)境優(yōu)良,分布滿山遍野的毛竹林,陰蔽較好的林地都有金蟬花,尤其在向陽坡地的竹林下,落葉和腐殖層很厚,透氣、透水、保溫,密布粗壯、濃白的菌絲體[2-4]。
由于野生蟬花生長環(huán)境被破壞及濫采現(xiàn)象嚴重,導致當前野生蟬花資源日益減少,另外人工采集野生蟬花勞動強度大,其作為中藥材走向國際市場存在功能活性組分不明、原料不純等問題[5-6]。本研究通過用蟬擬青霉[Paecilomyces cicadae (Miquel.) Samson]的分離培養(yǎng),優(yōu)化液體發(fā)酵工藝來生產(chǎn)菌絲體,旨在解決以上資源短缺及產(chǎn)品品質(zhì)等問題。
1 材料與方法
1.1 蟬花來源
蟬花標本采集于江蘇省句容市磨盤山海拔高度200~400 m的竹林中,冰袋低溫保存新鮮金蟬花,24 h內(nèi)處理。
1.2 試劑與儀器
1.2.1 試劑
甘露醇標準品、Nash(乙酸銨、冰醋酸、乙酰丙酮)、高碘酸鈉、L-鼠李糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、麩皮、蛋白胨、酵母膏、豆粉、酪蛋白、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2。
1.2.3 儀器
水浴恒溫振蕩器(SHZ-28A,江蘇省太倉市華美生化儀器廠);電子天平(KF6102,浙江凱豐集團有限公司);千分之一精密電子天平(JA5003N,上海精密科學儀器有限公司);立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠);數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-4,江蘇省金壇市杰瑞爾電器有限公司);可見分光光度計(WFJ-7200,上海尤尼柯儀器有限公司)。
1.3 方法
1.3.1 培養(yǎng)基
1.3.1.1 分離培養(yǎng)基
土豆15.00%,葡萄糖2.00%,蛋白胨0.20%,KH2PO4 0.10%,MgSO4·7H2O 0.05%,瓊脂粉 1.50%;pH值自然,121 ℃滅菌30 min。
1.3.1.2 母種培養(yǎng)基
土豆20.00%,葡萄糖2.00%,蛋白胨0.15%,KH2PO4 0.10%,MgSO4·7H2O 0.05%,瓊脂粉 1.50%~2.00%;pH值自然,121 ℃滅菌30 min。
1.3.1.3 液體菌種培養(yǎng)基
土豆20.00%,蔗糖5.00%,豆粉0.50%,KH2PO4 0.50%,MgSO4·7H2O 0.05%;pH值自然,121 ℃滅菌30 min。
1.3.2 蟬花真菌的分離培養(yǎng)
1.3.2.1 僵蟲體分離
無菌水浸泡蟲體10 min攪拌出泥沙,0.1%氯化汞溶液浸泡2~3 min,75%乙醇棉球擦拭,無菌水漂洗3次;取蟲體前段,切開外殼,取血腔菌絲3~4 mm,接入分離培養(yǎng)基[2];于28 ℃培養(yǎng)48 h,分離培養(yǎng)去雜菌,移入試管斜面培養(yǎng)并低溫保存。
1.3.2.2 子座芽分離
取子座芽,無菌水洗凈,0.1%氯化汞溶液浸泡2~3 min,無菌水洗凈,取中間3~4 mm組織塊接入培養(yǎng)基,置于28 ℃培養(yǎng)48 h,挑取少量菌絲分離培養(yǎng)去雜菌,移入試管斜面培養(yǎng)并低溫保存。
1.3.2.3 孢子分離
取無菌紙袋套住蟬花(花蕾),反復振蕩,使孢子黏附到袋壁上,將紙浸入25%葡萄糖液中,洗孢子,混勻。取0.1 mL原液,加入1.0 mL無菌水,1.0 mL 01% NaOH,2~3 min后加入無菌水,離心洗滌3次,加入25%葡萄糖溶液,28 ℃培養(yǎng)。每天鏡檢,孢子萌發(fā)后,微吸管吸取單個孢子滴于平板中培養(yǎng)。
1.3.3 種子發(fā)酵液培養(yǎng)
1.3.3.1 菌種活化
將保藏的金蟬花菌種無菌操作接種至試管斜面上,25 ℃下培養(yǎng)5~7 d,此時菌絲長滿斜面,即可使用。
1.3.3.2 種子液制備
從斜面上取大小相近的0.5 cm×0.5 cm 的母種塊,接種于液體培養(yǎng)基中(菌塊要薄,稍帶培養(yǎng)基,盡量使菌塊漂浮在液面上),每瓶接種3塊。裝液量為40%,培養(yǎng)溫度為25 ℃,轉(zhuǎn)速為180 r/min,一級種培養(yǎng)3 d,二級種在與一級種同樣條件下培養(yǎng)2 d。
1.3.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)
裝液量為40%,接種量為10%,培養(yǎng)溫度為25 ℃,轉(zhuǎn)速為180 r/min,培養(yǎng)48 h,靜置16 h。每個試驗3次重復。250 mL三角瓶分裝,100 mL/瓶。endprint
1.3.4 液體培養(yǎng)基優(yōu)化工藝
1.3.4.1 碳源篩選
以豆粉2.00%、KH2PO4 0.10%、MgSO4·7H2O 0.05%為基礎培養(yǎng)基,分別加入3.00%的葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇5種碳源,pH值自然,于25 ℃、180 r/min 恒溫水浴搖床培養(yǎng)5 d,分別對比這5種碳源對生物量及蟲草酸含量的影響。其中,豆粉煮沸20 min,經(jīng)過濾取濾液加入。
1.3.4.2 氮源篩選
以蔗糖2.00%、可溶性淀粉1.00%、KH2PO4 0.10%、MgSO4·7H2O 0.05%為基礎培養(yǎng)基,分別將蛋白胨、酵母膏、麩皮、酪蛋白、豆粉5種氮源以2.00%的量加入,pH值自然,于25 ℃、180 r/min恒溫水浴搖床培養(yǎng)5 d,分別對比這5種碳源對生物量及蟲草酸含量的影響。其中,麩皮經(jīng)煮沸水解10 min后,經(jīng)過濾取濾液加入。
1.3.4.3 無機鹽篩選
以蛋白胨2.00%、蔗糖2.00%為基礎培養(yǎng)基,分別加入0.05%的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KCl、CaCl2 5種無機鹽,pH值自然,于25 ℃、180 r/min恒溫水浴搖床培養(yǎng)5 d,分別對比這5種碳源對生物量及蟲草酸含量的影響。
1.3.4.4 生物量的測定
采用細胞干重法[7],取液體培養(yǎng)后發(fā)酵液,用100目尼龍紗網(wǎng)過濾得菌絲體和胞外液,并用蒸餾水反復沖洗,至濾出液澄清為止,收集菌絲體,60 ℃烘干至恒質(zhì)量,稱質(zhì)量。
1.3.4.5 蟲草酸含量測定
取樣品液1 mL,用高碘酸鈉比色法[8-9]在420 nm處測吸光度,制作甘露醇標準曲線見圖1,并計算樣品中的蟲草酸含量(mg/g)=C×50/m。式中:C為提取液中的蟲草酸含量(mg/mL);50是樣品提取液體積(mL);m為稱取樣品的質(zhì)量(g)。
1.3.4.6 不同因素和水平正交試驗優(yōu)化研究
培養(yǎng)溫度 25 ℃、初始pH值自然、接種量10%、接種菌齡4 d、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、培養(yǎng)時間5 d,在碳源、氮源、無機鹽單因素試驗基礎上,進行4個因素4個水平[L16(44)]正交試驗設計考察,具體設計見表1。發(fā)酵結(jié)果經(jīng)極差和方差分析,找出各種培養(yǎng)基成分的最佳濃度和它們對蟬花生物量和蟲草酸含量的影響程度。
1.3.4.7 驗證試驗
將正交試驗所獲得的最佳培養(yǎng)工藝條件進一步驗證,并設置對照,比較優(yōu)化培養(yǎng)基與基礎培養(yǎng)基同條件下蟬花真菌生物量及蟲草酸含量的差異。
1.3.4.8 數(shù)理統(tǒng)計方法
試驗數(shù)據(jù)用SPSS進行統(tǒng)計分析,并進行顯著性分析。
2 結(jié)果與分析
2.1 蟬花真菌的分離與鑒定
僵蟲體、子座芽和孢子3種來源的組織材料均可以分離得到蟬花真菌。子座芽和孢子的分離效果較好,雜菌污染率較低,菌落生長48 h左右即可見,起初星狀放射生長、菌絲平伏,菌絲逐漸呈白色絨毛狀,菌落白色、圓形隆起,表面有細小水珠,之后中間顏色加深,呈紫色,初步鑒定為擬青霉屬的蟬擬青霉。僵蟲體分離染菌率較高,分離效果略差。
2.2 蟬花真菌液體培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果
2.2.1 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的碳源篩選
由表2可知,在5種碳源中,葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖和乳糖都能得到較高的生物量,而蟲草酸含量最高的是甘露醇,由于標準品的主要成分是甘露醇,所以適合的碳源是蔗糖,蟲草酸的含量是28148 mg/g。
2.2.2 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的氮源篩選
由表3可知,不同氮源對蟲草酸含量及生物量的影響較大。在5種氮源中,蛋白胨和豆粉對蟬花液體發(fā)酵蟲草酸含量的影響比較明顯,但是豆粉在碳源篩選中作為基礎培養(yǎng)基中的氮源,對氮源篩選有一定干擾,所以合適的氮源是蛋白胨,其生物量為 1.361 g/L,蟲草酸含量為 32.284 mg/g。
2.2.3 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的無機鹽篩選
由表4可以看出,5種無機鹽對生物量的影響不是很大,但根據(jù)蟲草酸含量可以看出,MgSO4·7H2O和KH2PO4、K2HPO4能同時獲得高產(chǎn)量的蟲草酸。值得注意的是,CaCl2的添加反而抑制了蟲草酸的產(chǎn)生。基于鉀(K)、磷(P)、硫(S)、鎂(Mg)作為微生物生長所需的營養(yǎng)元素和蟲草素產(chǎn)量考慮,同時選用 MgSO4·7H2O、KH2PO4為培養(yǎng)基中的無機鹽組分,保證微生物能更好生長。
2.3 蟬花真菌液體培養(yǎng)基的正交試驗結(jié)果
從表5直觀分析可以看出,培養(yǎng)基的成分對蟬花液體發(fā)酵產(chǎn)生生物量的影響順序為蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O,最優(yōu)水平為A3B4C1D1,即蔗糖30 g/L、蛋白胨25 g/L、KH2PO4 0.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。
培養(yǎng)基成分對蟬花液體發(fā)酵產(chǎn)生蟲草酸含量的影響順序為蔗糖>蛋白胨>KH2PO4>MgSO4·7H2O,最優(yōu)水平為A4B2C3D1,即蔗糖40 g/L、蛋白胨15 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L。在上述優(yōu)化條件下,蟬花生物量和蟬花蟲草酸含量都要比正交試驗最高組(第10組)高。由以上分析可知,蟬花生物量和蟲草酸含量呈正相關,生物量的大量產(chǎn)生是蟲草酸積累的基礎。
2.4 基礎培養(yǎng)基和改良培養(yǎng)基驗證試驗結(jié)果
從表6可知,在驗證試驗中,工藝優(yōu)化后蟬花生物量和蟲草酸含量都有所提高,優(yōu)化后生物量提高1.852 g/L,蟲草酸含量提高17.774 mg/g。說明優(yōu)化后各種適宜濃度的營養(yǎng)因子能更好地促進生物量和蟲草酸的產(chǎn)生。
3 結(jié)論與討論endprint
碳源優(yōu)化試驗中培養(yǎng)基中加入豆粉、麩皮效果較好,可能與向真菌寄主體內(nèi)提供類似的激素等促進因子有關。在本研究中,蟬花菌株的生長和蟲草酸產(chǎn)生的最佳碳源是蔗糖,也有用葡萄糖作為小試發(fā)酵碳源的報道,但從生產(chǎn)成本來看,蔗糖更適合工業(yè)生產(chǎn)。氮是有機體的重要組成元素,本試驗中有機氮源比無機氮源能獲得更高的生物量和代謝產(chǎn)物,優(yōu)化后以15 g/L蛋白胨添加量作為氮源獲得總的蟲草酸含量達到44.317 mg/g,說明適量的蛋白胨可促進蟲草酸的產(chǎn)生。有報道發(fā)現(xiàn),添加NH4+不僅能夠成倍地增加蟲草酸含量,同時還在一定程度上提高了胞外多糖的產(chǎn)量[10]。無機鹽在蟬花的生長和蟲草酸的產(chǎn)生中起著重要作用。本試驗中添加的幾種無機鹽均能提高蟲草酸的產(chǎn)量,Ca2+效果較不明顯,可能影響蟲草酸的積累。
從蟬花液體發(fā)酵過程分析可知,蟬花真菌的分離、菌種的純化、液體菌種的培養(yǎng)等因素對生物量和蟲草酸的總產(chǎn)量都有很大的影響,更重要的是液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對培養(yǎng)的碳源、氮源、無機鹽、溫度、搖床的轉(zhuǎn)速等必要因素的考察更具有價值,這也為進一步提高蟬花發(fā)酵生產(chǎn)蟲草酸和優(yōu)質(zhì)菌絲體的生產(chǎn)效率提供參考,對提高經(jīng)濟效益有重要的意義。
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