不同溫度對HE染色效果的影響

王慶容+徐曉舒+夏浪+楊秀榮

摘要： 取草魚的腎組織、肝組織、腸組織，選擇25、35、45 ℃這3種不同溫度進行HE染色，以觀察不同溫度條件下的染色效果。結(jié)果表明，在35 ℃溫度時所染的裝片脫蠟較為徹底，染色效果很明顯，細胞核與細胞質(zhì)以及細胞之間的間隙可以清晰看到；而在25、45 ℃溫度條件下染色效果則不明顯。

關(guān)鍵詞： 草魚；HE染色；組織切片；最適溫度；染色效果

中圖分類號： S917 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）22-0168-02

HE染色即蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining），是石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。HE染色法是組織學(xué)、胚胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法[1]。蘇木精可以將組織的嗜堿性結(jié)構(gòu)（如核糖體、細胞核及細胞質(zhì)中的核糖核酸等）染成藍紫色，伊紅可以將組織的嗜酸性結(jié)構(gòu)（如細胞內(nèi)及細胞間的蛋白質(zhì)，包括路易體、酒精小體以及細胞質(zhì)的大部分）染成粉紅色，使整個細胞組織的形態(tài)清晰可見[2]。組織切片方法是教學(xué)、科研、病理檢驗工作中非常常用的一種試驗方法，HE染色則是在制作切片的過程中最常用的染色方法[3]。

在實際試驗操作過程中并不是每一張切片的質(zhì)量都會出現(xiàn)預(yù)期的效果，而各種因素都會對切片的質(zhì)量產(chǎn)生影響[4]。因此，制備一張質(zhì)量好的切片，考慮的因素必須是多方面的，而溫度的影響則是不可忽視的因素之一。

本試驗選擇外觀正常、生長狀況良好、體表無明顯病變的草魚，處死后取其腎、肝、腸分別進行組織學(xué)切片，選擇25、35、45 ℃等不同的溫度處理，觀察在不同溫度條件下的染色效果，以期找出HE染色的最適溫度，為組織切片的染色技術(shù)提供一定幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

草魚的腎、肝、腸組織切片。

1.1.2 試劑配制

常用于組織學(xué)切片制作的試劑有Bouin氏液（苦味酸75 mL、40%甲醛25 mL、冰醋酸5 mL）、粘合劑（雞蛋清）、清洗液（重鉻酸鉀80 g、水1 000 mL、粗制濃硫酸120 mL）、乙醇（分別配制了70%、80%、90%、95%、100% 5種濃度）、1/2二甲苯（乙醇和二甲苯按1 ∶ 1比例配制）、氨水（1%）、酸水（1%）、0.2%蘇木精染色液（蘇木精6 g、無水乙醇100 mL、硫酸鋁鉀150 g、蒸餾水2 000 mL、碘酸鈉1.2 g、冰醋酸120 mL、甘油900 mL）、0.5%～1.0%伊紅染色液（95%乙醇配制）等。

1.1.3 試驗儀器

本試驗所用的儀器主要有精密電子天平 （AUY）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（101-5型）、包埋機（徠卡YB-6LF）、輪轉(zhuǎn)式切片機（徠卡RM2016）、攤片機（徠卡HI1210）等。

1.2 試驗方法

試驗的主要步驟如下：取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、展片、染色、封片、鏡檢觀察，詳細步驟參考唐從國等的方法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度條件下草魚腎組織的HE染色效果

用顯微鏡觀察3種溫度條件下進行的HE染色，可以明顯發(fā)現(xiàn)，在25 ℃時，由于溫度較低，組織之間的蠟塊沒有完全脫掉，細胞核模模糊糊，不呈藍色，顏色比較暗沉，不清晰，染色效果不明顯（圖1-a）；在35 ℃時，可以清晰地看到細胞間的界限，細胞核呈藍色，其他部分呈紅色或者粉紅色，細胞排列緊密、 規(guī)則，染色效果很明顯（圖1-b）；45 ℃時染色效果比35 ℃的差，可以看到細胞界限，但是部分組織或者細胞核破裂，細胞核著色不明顯或發(fā)灰（圖1-c）。以上結(jié)果顯示，對于草魚的腎臟組織，在35 ℃左右的溫度條件下染色效果較好。

2.2 不同溫度條件下草魚肝組織的HE染色效果

用顯微鏡觀察不同溫度條件下肝組織的切片，可以發(fā)現(xiàn)，在25 ℃時，肝組織中有很多蠟塊沒有脫掉，細胞核模糊，但形態(tài)依稀可見，細胞界限不清晰，細胞核能被染成藍色，但是染色效果不明顯（圖2-a）；在35 ℃時，可以很清晰地看到肝細胞呈卵圓形，細胞核大而圓，且被染成藍色，周圍的組織也被染成粉紅色或者紅色，細胞界限清晰，染色效果較好（圖2-b）；在45 ℃時，可以發(fā)現(xiàn)細胞之間的界限比較模糊，隱約可以看到細胞核被染成淡藍色，少數(shù)組織染色不均，染色效果較35 ℃時稍差（圖2-c）。以上結(jié)果顯示，對于草魚的肝臟組織，在35 ℃左右的溫度條件下染色效果較好。

2.3 不同溫度條件下草魚腸組織的HE染色效果

用顯微鏡觀察不同溫度條件下的草魚腸組織切片，可以發(fā)現(xiàn)，在25 ℃時，跟腎組織和肝組織切片一樣，組織塊之間的蠟沒脫完全， 可以隱約看到腸絨毛，細胞界限不清晰，細胞核

染色較明顯（圖3-a）；在35 ℃時，可以看出腸組織結(jié)構(gòu)完整，腸壁肌肉層均可清晰看到，腸細胞界限清晰，細胞排列緊密、規(guī)則，腸絨毛排列整齊、清晰，細胞核被染成藍色，周圍其他組織被染成粉紅色（圖3-b）；在45 ℃時，可以發(fā)現(xiàn)組織之間的蠟塊被脫掉，但是細胞核由于受到高溫，著色不明顯，且組織之間出現(xiàn)裂痕（圖3-c）。以上結(jié)果顯示，對于草魚的腸組織，在35 ℃左右的溫度條件下染色效果較好。

3 討論與結(jié)論

影響組織切片HE染色效果的因素很多，溫度是較敏感的因素之一。要做好一張HE組織切片，須注意許多細節(jié)問題。取材時要注意整個組織的形態(tài)特點，組織塊大小適宜、厚薄均勻、形狀規(guī)則，一般大小為3～5 mm，夾取組織時不能用力擠壓，避免機械損傷[6]。在制作組織切片的過程中，溫度對染色效果的影響比較明顯，溫度過高或過低都會對結(jié)果產(chǎn)生直接影響。當溫度過低時，二甲苯的脫蠟達不到預(yù)期的效果，組織內(nèi)蠟太厚，不僅不利于細胞核以及胞漿著色，而且還不利于觀察。當溫度過高時，脫蠟或許能達到目的，但是高溫也會對裝片產(chǎn)生很多影響，如著色不明顯、發(fā)灰等。在制作切片的過程中，低溫時需要在脫蠟這一環(huán)節(jié)延長時間，這樣就不能在有效的時間內(nèi)制作出一張令人滿意的裝片，不僅浪費時間，而且還浪費試驗材料。因此，本研究采用恒溫箱，選取3種不同溫度進行試驗，驗證了35 ℃左右為較合適的染色溫度，在一定程度上節(jié)約了時間和試驗材料。endprint

當然，溫度并不是影響組織切片染色的唯一因素，染色前期的很多試驗步驟對染色的影響也很大，包括取材、固定、浸蠟、烤片等步驟。如果固定不及時、不充分會造成細胞著色差或者發(fā)灰、組織結(jié)構(gòu)模糊不清等。浸蠟、烤片這方面的因素容易被忽視，很多情況下細胞核發(fā)灰都與其相關(guān)，如果浸蠟、烤片溫度過高，就會造成組織收縮變脆、細胞核染色不明顯或發(fā)灰等。一些試劑（蘇木精、伊紅等）在染色過程也會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響。

在25 ℃溫度條件下，裝片的細胞核、細胞質(zhì)著色不明顯，細胞核模糊不清，細胞界限不清晰，是因為組織塊脫蠟不徹底。組織塊在二甲苯中脫蠟需要合適的溫度，溫度過低，將導(dǎo)致脫蠟不徹底。在35 ℃溫度條件下，裝片的細胞核、細胞質(zhì)著色很明顯，細胞核被染成藍紫色或藍色，細胞質(zhì)呈紅色或者粉紅色，細胞界限清晰，脫蠟較為徹底，能達到試驗的目的。在45 ℃溫度條件下，裝片的細胞核、細胞質(zhì)著色也比較明顯，細胞核呈淡藍色，細胞質(zhì)呈紅色或者粉紅色，細胞界限可以大致看到模糊的輪廓。溫度過高，會導(dǎo)致組織塊出現(xiàn)裂痕，部分細胞核、細胞質(zhì)破裂。

[JP+1]綜上所述，在組織切片時，夏天溫度高，在常溫下染色可以達到目的，但是冬季溫度低，應(yīng)該在恒溫箱內(nèi)染色，且最理想的HE染色的溫度應(yīng)該控制在32～37 ℃之間。溫度低了，組織塊之間脫蠟就不完全，引起細胞核模糊不清，染色著色不明顯，并且細胞之間的界限也不清晰；溫度高了又會使得細胞破裂，組織結(jié)構(gòu)之間出現(xiàn)裂痕，細胞核著色不明顯或發(fā)灰。

參考文獻：

[1] 田玉旺，李 琳，朱紅艷，等. 常規(guī)HE染色易出現(xiàn)的問題、原因及解決方法[J]. 診斷病理學(xué)雜志，2008，15（6）：500-502.

[2] 郭 群，張品南. HE染色切片質(zhì)量欠佳的原因及處理[J]. 中華今日醫(yī)學(xué)雜志，2003（24）：52-53.

[3]王 華，周孝瓊. 病理組織切片中常見問題及解決方法[J]. 實驗科學(xué)與技術(shù)，2010，8（5）：38-40.

[4]鄭玉琴，李 麗，王毅訓(xùn)，等. 制作微小組織切片的技術(shù)探討[J]. 農(nóng)墾醫(yī)學(xué)，2008，30（2）：154-155.

[5]唐從國，郭周慶. 如何做好一張HE染色切片[J]. 中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志，2012，21（4）：428-429

[6]范小莉，胥維勇，楊 群. HE染色不良的分析與應(yīng)對方法[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志，2014，30（7）：805-807.endprint